Abstract
Interleukin 17A (IL-17A), som en pro-inflammatorisk cytokin, er involvert i patologi inflammatoriske sykdommer og svulstens mikromiljø. Målet med denne studien er å undersøke effekten av IL-17A på invasivitet av magekreft (GC). I studien fant vi at IL-17A kan fremme migrasjon og invasjon av GC-celler. Videre, etter behandling med IL-17A, uttrykkene og aktivitetene av matriks-metalloproteinase-2 (MMP-2) og MMP-9 ble oppregulert, mens uttrykket av TIMP-1 og TIMP-2 ble nedregulert. Videre atom /samlede fraksjoner av p65 og p50 ble dramatisk forhøyet ved IL-17A. Forbehandling med helenalin, en nukleær faktor-kB (NF-kB) inhibitor, ble vist seg å avskaffe den fremmende virkning av IL-17A på invasjonen evnen til GC-celler og oppregulering av MMP-2 og MMP-9. Som konklusjon, våre funn viste at IL-17A kunne fremme invasjonen av GC-celler ved å aktivere NF-kB vei, og deretter oppregulering av ekspresjon av MMP-2 og MMP-9. Disse resultatene kan føre til identifisering av nye diagnostiske markører og terapeutiske mål av GC
Citation. Wang Y, Wu H, Wu X, Bian Z, Gao Q (2014) Interleukin 17A Fremmer Gastric Cancer Invasivitet via NF -κB mediert matriksmetalloproteinaser 2 og 9 uttrykk. PLoS ONE 9 (6): e96678. doi: 10,1371 /journal.pone.0096678
Redaktør: Nikos K. Karamanos, Universitetet i Patras, Hellas
mottatt: 26 november 2013; Godkjent: 11 april 2014; Publisert: 06.06.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Prosjektet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr 81070536) og Ungdoms Vitenskapelige fond i sentral~~POS=TRUNC i Tai (2011ZRQNO35). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Som en av de beste årsakene til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, er GC ansvarlig for over 700 000 dødsfall per år [1]. Det er den nest vanligste kreftformen og den tredje største dødsårsaken blant kreftpasienter i Kina [2]. Den potente invasjon og metastasering evne til GC er en av de viktige faktorene som fører til dårlig prognose [3]. Derfor er det viktig å avdekke den underliggende mekanismer for å identifisere nye molekylære terapeutiske mål som regulerer invasjons evnene til GC celle, og således for å utvikle behandlinger for å fremme GC.
IL-17A er den grunnleggende medlem av IL -17 familie som strekker seg fra IL-17A til IL-17F [4] – [8]. IL-17 familiemedlemmer spille en aktiv rolle i ulike sykdommer som autoimmune sykdommer, inflammatoriske sykdommer, og ondartede sykdommer. Vedvarende betennelse har vært ansett å være korrelert med økt risiko for GC [9]. Tidlige fremgangsmåten i magekreft involvere
Helicobacter pylori
(H. pylori) infeksjon som fører til kronisk aktiv og atrofisk gastritt med produksjon av proinflammatoriske mediatorer [10] – [13], slik som IL-1 b, TNFa, IFNy, IL-6 og IL-8. Imidlertid er rollen til IL-17A i kreft var inkonsekvent i henhold til tidligere rapporter. Noen bevis avslørte at IL-17A kan fremme tumorvekst ved å stimulere angiogenese og invasiv kapasitet av tumorceller [14]. I kontrast til andre studier antydet at IL-17A viser en beskyttende effekt mot kronisk lymfatisk leukemi utvikling ved å fremme immunsystem-mediert avvisning tumor [15]. Videre er IL-17A forsterket den cytotoksiske effekten av NK-celler mot tumorceller ved å øke ekspresjonen av cytotoksiske molekyler [16]. Opp til nå, er det mindre rapport om rollen til IL-17A i invasjonen av GC.
I denne studien fant vi at IL-17A kan øke GC cellemotilitet ved oppregulering MMP-2 og MMP -9 via aktivering av NF-kB transkripsjonsfaktorer.
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneskelig GC cellelinje AGS ble kjøpt fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) og opprettholdt i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone, Logan, UT), 100 U /l penicillin og 100 mg /l streptomycin. Menneske GC cellelinjer BGC-823 og SGC-7901 ble hentet fra Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og dyrket i RPMI-1640 medium som inneholder 10% bovint serum, penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 mikrogram /ml). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C, 5% CO
2 luft atmosfære.
sårtilheling analysen
GC-celler ble dyrket som konfluent monolag i en seks-brønns plate og ble såret ved å fjerne en 1 mm strimmel på tvers av brønnen med en pipettespiss når de festes til plateoverflaten. De sårede monolag ble så vasket to ganger med PBS for å fjerne ikke-adherente celler før 1 ml medium med eller uten IL-17A (50 ng /ml) (R 0,05 og **
p
. 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
Effekt av IL-17A på oppregulering av MMP-2 og MMP-9 og nedregulering av TIMP-1 og TIMP-2 i GC-celler
Siden overekspresjon av MMP’er kan fremme kreft metastase [18], [19], vi neste undersøkte effekten av IL-17A på MMP’er ekspresjon i GC-cellelinjer. Som vist i figur 2 og figur S2, ble uttrykk for MMP-2 og MMP-9 i forhold ved hjelp av Western blotting mellom IL-17A behandlede og ubehandlede celler. Resultatet viste at MMP-2 og MMP-9 ble oppregulert i IL-17A behandlede celler (AGS og BGC-823) (figur 2A og 2B). På samme tid ble de uttrykk for TIMP-1 og TIMP-2 nedregulert (figur 2A og 2B). Gelatin zymografi ble også utført for å vurdere aktiviteten av MMP-2 og MMP-9 i GC-celler behandlet med eller uten IL-17A. Resultatene viste at IL-17A forsterket aktiviteten av MMP-2 og MMP-9 i GC-celler (AGS og BGC-823) (figur 2C og 2D). Lignende resultater har blitt observert i SGC-7901 celler (Figur S2). Disse resultatene antydet at pro-metastase effekten av IL-17A på GC kan være gjennom å regulere MMP /TIMP balanse og bedt oss om å utforske videre virkningsmekanismen.
(A) Uttrykk for MMP i GC-celler ( AGS og BGC-823) ble sammenlignet ved western-blotting mellom celler behandlet med og uten IL-17A (50 ng /ml) i 24 timer. (B) Kvantifisering av protein nivåene av MMP-2 og MMP-9. (C) Effekter av IL-17A på aktivitetene til MMP-2 og MMP-9. (D) Kvantifisering av virksomheten til MMP-2 og MMP-9. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *
p
0,05 og **
p
. 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
IL-17A oppregulerer MMP-2 og MMP-9 uttrykk via Aktivere NF-kB pathway
NF-kB er rapportert som et nedstrøms mål for IL-17A signalveien i mange celler [17], [20], [21], som er i stand til å oppregulere MMP -2 og MMP-9 uttrykkene [14], [17]. Og IL-17A ble også rapportert å øke ekspresjonen av MMP’er via aktivering av NF-kB banen i mange celler [14], [17]. Derfor vi neste sjekket om IL-17A oppregulert MMP-2 og MMP-9 uttrykk i GC cellene gjennom aktivering av NF-kB. Som vist i figur 3, ble ekspresjon og translokasjon av NF-kB-subenhetene i kjernen analysert ved Western blotting. Vi har observert at nivået av p65 og p50 i kjerner ble dramatisk forhøyet i AGS celler etter IL-17A behandling, mens nivået på p65 og p50 har ingen endring (Figur 3A-D). I tillegg ble det nukleære /samlede andel av disse molekyler økt på IL-17A behandling (figur 3E). Lignende resultater ble observert i BGC-823-cellelinjen (figur S3A-E), noe som indikerer at IL-17A aktivert NF-kB i GC-cellelinjer.
(A) Western blot-analyse ble brukt for å påvise generelle p50, p65, P52, c-Rel og relB-ekspresjon i AGS-celler behandlet med IL-17A (50 ng /ml) ved angitte tidspunkter. (B) Kvantifisering av proteinnivåer generelle p50, p65, P52, c-Rel og relB. (C) Western blot-analyse ble brukt for å detektere kjerne p50, p65, P52, c-Rel og relB-ekspresjon i AGS-celler behandlet med IL-17A (50 ng /ml) ved angitte tidspunkter. (D) Kvantifisering av protein nivåer av atom p50, p65, P52, c-Rel og relB. (E) Den relative forholdet mellom atom til total fraksjon av p50, p65, P52, c-Rel og relB. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. **
p
. 0,01, sammenlignet med kontrollgruppen
Videre, når helenalin (5 mm) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), en NF -κB inhibitor, ble tilsatt til AGS eller BGC-823-celler medium før IL-17A behandling ble uttrykket nivåer av MMP-2 og MMP-9 signifikant redusert (figur 4C-D, figur S4C-D). Resultatet viste at IL-17A-indusert MMP-2 og MMP-9-ekspresjon i GC cellen via NF-kB-aktivering. Følgelig kunne IL-17A indusert GC celle invasivitet også blitt blokkert av helenalin
in vitro plakater (Figur 4A-B, Figur S4A-B). Derfor er disse funnene tyder på at IL-17A aktiverer NF-kB vei, deretter regulerer uttrykket av MMP, og dermed påvirker migrasjon og invasivitet av GC-celler.
(A) 1 x 10
6 AGS celler ble forbehandlet med helenalin (5 uM) i 30 minutter og deretter inkubert i nærvær eller fravær av IL-17A (50 ng /ml) i 24 timer. Cellulær invasivitet ble målt ved anvendelse av transwell invasjon analysen. (B) Den prosentvise invasjonen hastigheten ble uttrykt som prosent av kontroll. (C, D) AGS-celler ble behandlet og deretter underkastet Western-blotting for å analysere protein nivåene av MMP-2 og MMP-9. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *
p
0,05 og **
p
. 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
Diskusjoner
GC er en av de mest fatale ondartede sykdommer i verden på grunn av sin høye tilbakefall etter kurativ behandling [3], [22]. GC er nært korrelert med kroniske betennelsessykdommer, hvor mange av inflammatoriske cytokiner infiltrere. IL-17A er en av de viktige inflammatoriske cytokiner i utviklingen av mange inflammatoriske sykdommer, og er også ofte detektert i svulstens mikro [23] – [26]. Forrige studien antydet at uttrykket nivåer av IL-17 i svulsten kan være en uavhengig prognostisk indikator i adenokarsinom i ventrikkelen [27]. Sammenligning av overlevelse mellom pasienter med høye og lave nivåer av IL-17 fant at pasienter med høye nivåer av IL-17 hadde en 5-års overlevelse på 47% sammenlignet med 84% hos pasienter med lave nivåer [28]. Men de molekylære mekanismene for slik sammenheng, som kan hjelpe oss å bedre forstå rollen som IL-17 i utviklingen og fremdriften av GC, er fortsatt ikke klarlagt.
I denne studien fant vi at IL- 17A fremmet invasjonen av GC-celler. Metastase er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall blant GC pasienter. Nedbrytning av ECM av blod eller lymfekar er kritisk for metastasering, fordi tap av ECM tillater kreftceller å invadere blod eller lymfesystemet og spre seg til andre vev og organer [29]. MMP, særlig MMP-2 og MMP-9, er ansvarlig for nedbrytning av ECM [19], [29]. IL-17A har blitt rapportert å fremme invasjon av kreftceller via oppregulering av ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 [17], [26]. Det er generelt akseptert at MMP-aktivitet inhiberes av TIMPs for å forhindre omfattende ECM degradering [29]. For å klargjøre virkningsmekanismen av IL-17A, undersøkte vi hvorvidt den fremmende virkning av IL-17A på celle invasjon er gjennom regulering av de uttrykk for MMP-2, MMP-9, TIMP-1 og TIMP-2. Våre resultater viste at IL-17A forhøyet uttrykk og aktivitetene av MMP-2 og MMP-9, og downregulated uttrykk for TIMP-1 og TIMP-2, noe som ytterligere forklart at IL-17A promotert celle migrasjon i bunnen av sårheling analyse. Derfor kan det hende at pro-metastase effekten av IL-17A på GC være gjennom å regulere MMP /TIMP balanse.
NF-kB er rapportert som et nedstrøms mål for IL-17A signalveien i mange celler [17] , [20], [21], som er i stand til å oppregulere MMP-2 og MMP-9 uttrykkene [14], [17]. Og IL-17A ble også rapportert å øke ekspresjonen av MMP’er via aktivering av NF-kB banen i mange celler [14], [17]. Så vi undersøkt hvorvidt den oppregulering av MMP-2 og MMP-9 indusert ved hjelp av IL-17A er gjennom aktivering av NF-kB pathway. Resultatene viste IL-17A fremmet nukleær translokasjon av P65 og P50 subenheter med GC-celler og deretter oppregulert ekspresjon av MMP-2 og MMP-9. Denne effekten kan være effektivt blokkert av NF-kB-inhibitor, hvilket antyder at aktiveringen av NF-kB er en mulig mekanisme for å oppregulere MMP-2 og MMP-9 med IL-17A.
Som konklusjon, våre funn antydet at IL-17A var i stand til å fremme migrering og invasivitet av GC-celler ved å aktivere NF-kB vei, som senere oppregulert uttrykk for MMP-2 og MMP-9 og derved påvirkes migrering og invasivitet av GC-celler. Ytterligere karakterisering av effekten av IL-17A på GC invasjon og metastasering kan føre til identifisering av nye diagnostiske markører og terapeutiske mål.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Effekten av IL-17A på spredning av BGC-823, SGC-7901 og AGS celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096678.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
IL-17A fremmer uttrykk for MMP-2 og MMP-9 og undertrykker uttrykk for TIMP-1 og TIMP-2 i SGC-7901 celler. (A) Uttrykk for MMP’er i SGC-7901-celler ble sammenlignet ved western-blotting mellom celler behandlet med og uten IL-17A (50 ng /ml) i 24 timer. (B) Kvantifisering av protein nivåene av MMP-2 og MMP-9. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. . *
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
IL-17A aktiverer NF-kB i BGC-823 celler. (A) Western blot-analyse ble brukt for å påvise generelle p50, p65, P52, c-Rel og relB-ekspresjon i BGC-823-celler behandlet med IL-17A (50 ng /ml) ved angitte tidspunkter. (B) Kvantifisering av proteinnivåer generelle p50, p65, P52, c-Rel og relB. (C) Western blot-analyse ble brukt for å detektere kjerne p50, p65, P52, c-Rel og relB-ekspresjon i BGC-823-celler behandlet med IL-17A (50 ng /ml) ved angitte tidspunkter. (D) Kvantifisering av protein nivåer av atom p50, p65, P52, c-Rel og relB. (E) Den relative forholdet mellom atom til total fraksjon av p50, p65, P52, c-Rel og relB. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. . *
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen
doi: 10,1371 /journal.pone.0096678.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Effekter av helenalin og IL-17A på celle invasjon og uttrykk for MMP-2 og MMP-9 i BGC-823 celler. (A) 1 x 10
6 BGC-823-celler ble forbehandlet med helenalin (5 uM) og deretter inkubert i nærvær eller fravær av IL-17A (50 ng /ml) i 24 timer. Cellulær invasivitet ble målt ved anvendelse av transwell invasjon analysen. (B) Den prosentvise invasjonen hastigheten ble uttrykt som prosent av kontroll. (C, D) Protein nivåene av MMP-2 og MMP-9 ble påvist ved western blotting, når BGC-823-celler ble behandlet med helenalin og /eller IL-17A. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. *
p
0,05, sammenlignet med kontrollgruppen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0096678.s004 plakater (TIF)
