Abstract
Bakgrunn
Hedgehog (HH) signalering spiller en avgjørende rolle i normale cellulære prosesser, normal pattedyr gastrointestinal utvikling og differensiering, og i onkogenese og vedlikehold av den ondartede fenotype i en rekke humane krefttyper. Økende bevis impliserer ytterligere involvering av HH signalisering i onkogenese og metastatisk oppførsel av tykktarm kreft. Men genomiske tilnærminger for å belyse rollen til HH signalisering i kreft generelt mangler, og data som er utledet på HH signalisering i tykktarm kreft er svært begrenset.
metodikk /hovedfunnene
For å identifisere unike nedstrøms mål av GLI gener, transkripsjons regulatorer av HH signalering, i sammenheng med tykktarmskreft, ansatt vi et lite molekyl hemmer av både GLI1 og GLI2, GANT61, i to human tykktarm kreft cellelinjer, HT29 og GC3 /c1. Cellesyklusanalyse viste akkumulering av GANT61-behandlede celler i G1 /S-grensen. cDNA microarray genuttrykk profilering av 18,401 gener identifisert forskjellig uttrykt Genes (degs) både vanlige og unike til HT29 og GC3 /c1. Analyser ved hjelp GenomeStudio (statistikk), Matlab (varme kart), Oppfinnsomhet (kanonisk pathway analyse), eller ved QRT-PCR, identifisert p21
Cip1 (CDKN1A) og p15
Ink4b (CDKN2B), som spiller en rolle i G1 /S sjekkpunkt, som opp-regulerte gener på G1 /S-grensen. Gener som bestemmer videre cellecyklusprogresjonen på G1 /S inkludert E2F2, cyclin E2 (CCNE2), CDC25A og CDK2, og gener som regulerer passering av cellene gjennom G2 /M (cyclin A2 [CCNA2], CDC25C, cyclin B2 [CCNB2] CDC20 og CDC2 [CDK1], ble nedregulert. i tillegg ble nye gener involvert i stressrespons, DNA-skade respons, DNA replikasjon og DNA-reparasjon identifisert etter hemming av HH signalering.
Konklusjon /Betydning
Denne studien identifiserer gener som er involvert i HH avhengig cellulær proliferasjon i tykktarm kreft celler, og etter sin hemming, gener som regulerer cellesyklusprogresjon og hendelser nedstrøms for G1 /S-grensen.
Citation .:. Shi T, Mazumdar T, DeVecchio J, Duan ZH, Agyeman A, Aziz M, et al (2010) cDNA microarray Gene Expression Profilering av Hedgehog signalveien Hemming i Human Colon kreft celler PLoS ONE 5 (10): e13054. doi: 10,1371 /journal.pone.0013054
redaktør: Terence Lee, University of Hong Kong, Kina
mottatt: 6 juni 2010; Godkjent: 02.09.2010; Publisert: 01.10.2010
Copyright: © 2010 Shi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte fra National Cancer Institute utmerkelser RO1 CA 32613 (jAH), RO1 108929 (jah), og fra Cleveland Clinic. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hedgehog (HH) signalering spiller en avgjørende rolle i en rekke av normale cellulære prosesser. Det er avgjørende i embryogenese, regulering av epitel-til-mesenchymale overgang, mønstring av et variert utvalg av virveldyr strukturer i en rekke organer, vedlikehold av voksent vev homeostase, vevsreparasjon, cellulær proliferasjon, og i celleoverlevelse [1] , [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Den kanoniske HH veien er også kritisk for normal utvikling hos pattedyr gastrointestinal, hvor det er involvert i koordinatsystemet reguleringen av differensiering av normale tarmtottene [10], [11], [12]. Således, i den normale mage- og tarmkanalen, er HH ligander indusert i de differensierte cellene rundt villøse overflate, genererer en negativ tilbakekoblingssløyfe for å hemme kanoniske WNT signalering i basalceller av krypten, og dermed beskytte differensierte celler fra de proliferative virkninger av WNT [ ,,,0],1. 3]. Aktivering av den kanoniske HH signalveien omfatter bindingen av ligander til HH membranen reseptoren Patched (PTCH1), som blir internalisert som fører til aktivering av den signalmolekyl glattes (SMO) via frigjøring fra PTC-mediert undertrykkelse. SMO aktiverer den endelige dommer av HH signalering, den GLI familie av transkripsjonsfaktorer som bindes til GACCACCCA lignende konsensus bindende element i promotersekvenser for å regulere transkripsjonelt HH målgener [3], [14], [15]. GLI1 og GLI2, de transkripsjonsaktivatorer av HH signalering, har distinkte samt overlappende funksjoner som involverer aktivator (GLI1 og GLI2) eller repressor (GLI2) aktiviteter [16]; imidlertid sine roller i reguleringen av HH-drevet mobil spredning, overlevelse eller celledød prosesser dårlig forstått. Historisk GLI1 har vært ansett som den mest pålitelige markør av HH pathway aktivitet, men GLI2 synes å være den primære aktivator av HH signalering, med GLI1 som en transkripsjonen mål for GLI2 [3], [7], noe som fører til økning av HH signale begge kvantitativt og kvalitativt [16]. Et viktig trekk ved GLI proteiner er at deres biologiske aktivitet er kontekstavhengig, påvirket av den cellulære miljø [17], [18].
Aktivering av den kanoniske HH signalkaskade er avvikende aktivert og vel kjent for å spille en kritisk rolle i onkogenesen og vedlikehold av den ondartede fenotypen i flere typer kreft hos mennesker. En slik aktivering involverer amplifisering av GLI1 eller GLI2, mutasjoner i PTC eller SMO, eller feilregulert genekspresjon [3], [4]; disse ondartede celler er også følsom for lite molekyl-inhibitor som er rettet mot SMO, cyclopamine [4], [19], [20], [21], [22], [23]. Colon Kreftsvulster antas å stamme fra konstitutiv aktivering av WNT signalering ved mutasjon av APC eller β-catenin gener, mens involvering av HH signalveien er ikke så klart. I gastrointestinale maligniteter, har transkripsjonen oppregulering av HH ligander har blitt identifisert som den dominerende aktivator av HH signalisering i disse sykdommene (oversikt i [3]). I tillegg er det frem bevis for at HH signalering er involvert i tykktarmskreft [24], [25], colon carcinoma stamcelleselvfornyelse, og i den metastatiske adferd av avanserte coloncancere [26]. Imidlertid genomiske tilnærminger for å klargjøre rollen til HH signalisering i kreft generelt mangler, regulatoriske gener nedstrøms for GLI1 og GLI2 som fungerer i cellulær proliferasjon, overlevelse, og opprettholdelse av den ondartede HH fenotypen forblir ufullstendig karakterisert v [5], og data utledet på HH signalering i tykktarmskreft er svært begrenset.
Cellulær proliferasjon er drevet av progresjon av celler gjennom cellesyklus bestående av sekvensielle passasje gjennom G1, S, G2 og M fasene. Cyclin-avhengige kinaser (CDK) forbinder med cykliner å drive cellesyklusen maskiner [27], [28]. Dermed CDK2 forbinder med Cyclin E på G1 /S overgang og med cyklin A i S-fase, CDK4 og CDK6 binder seg til Cyclin D under progresjon på G1 /S, mens CDC2 komplekser med cyclin A på G2, og med cyclin B under G2 /M overgang. CDC25 familiemedlemmer også regulere cellesyklusprogresjon gjennom defosforylering av CDK [29], [30]. CDK-inhibitorer, inkludert p21
Cip1 [29], [31] og p15
Ink4b [[32], bindes til cyklin-CDK-komplekser i løpet av cellesyklusen overgang, særlig ved G1 /S (p21
Cip1, p15
Ink4b [32]) og G2 /M (p21
Cip1 [29]), og kan også forårsake cellesyklus arrest i G1 /S-grensen etter cytostatisk signaler gjennom funksjonelle hemming av cyclin- CDK komplekser. E2F-familien av transkripsjonsfaktorer også regulerer ekspresjon av gener som er nødvendige for G1 /S overgang, spesielt gener som er involvert i aktiveringen av DNA-replikasjon maskineri, og DNA-reparasjon [33].
cDNA mikromatriser har gitt muligheten til å studere uttrykket av tusenvis av gener samtidig, og er et viktig verktøy i disseksjon av signaltransduksjonsveiene. For HH signalkaskade, har HH /GLI target genekspresjon undersøkt følgende EGF stimulering [6] eller induserbar GLI1 [16] eller GLI2 [9] genaktivering i humane keratinocytter, eller i GLI1-indusert celletransformasjon [7]. For å identifisere unike nedstrøms mål for de GLI gener som fungerer i cellulær proliferasjon i sammenheng med kolon karsinom, benyttet vi et lite molekyl inhibitor av både GLI1 og GLI2, GANT61, identifisert i et cellebasert lite molekyl skjerm for inhibitorer av GLI1-mediert transkripsjon [34]. GANT61 opptrer i kjernen for å blokkere GLI1 funksjon, hemmer både GLI1- og GLI2- mediert transkripsjon, og demonstrerer en høy grad av selektivitet for HH /GLI signalering [34]. Dermed fungerer GANT61 nedstrøms cyclopamine (målretting SMO) for å hemme den endelige determinants av HH transkripsjonsregulering.
I to menneskelige kolon carcinoma cellelinjer, HT29 og GC3 /c1, hemmer HH signalveien ved hjelp GANT61 redusert uttrykk av GLI1, GLI2 og HH ligandreseptoren, PTCH1, og inhiberte proliferasjon ved å indusere cellulær akkumulering ved G1 /S-grensen 24 timer etter behandling, bestemt ved strømningscytometrisk analyse. På ytterligere detaljert analyse ved hjelp av cDNA microarray gene expression profilering og kvantitativ Real-Time PCR, p21
Cip1 (CDKN1A) og p15
Ink4b (CDKN2B), som kan lokke fram G1 /S sjekkpunkt, ble oppregulert, mens gener som videre bestemmer oppføring fra G1 til S-fase inkludert E2F2, cyclin E2 (CCNE2), CDC25A og CDK2 ble redusert i uttrykket. Samtidig med redusert G1 til S-fase progresjon, redusert ekspresjon av cyclin A2 (CCNA2), CDC25C, syklin B2 (CCNB2), CDC20 og CDC2 (CDK1), som regulerer passasjen av celler gjennom G2 /M ble også demonstrert. Andre nye gener som er involvert i stressresponsen, og responsen på DNA-skade, som ikke tidligere er sett som følge av opphør av HH signalisering i humane kreftceller, omfatter tidlig responsgener DDIT2 (GADD45G), DDIT3 (GADD153), DDIT4 (REDD1), PPP1R15A (GADD34) og ATF3 som var signifikant oppregulert. Gener involvert i DNA-syntese og reparasjon (TYMS, TOP2A, TK1, POLE, POLE2), og flere nye gener som er involvert i S-fase progresjon eller DNA skade respons som var betydelig nedregulert, inkluderer KIAA0101 (p15 [PAF]), Replication faktor C varianter 2, 3, 4, 5, CDT1, E2F transkripsjonsfaktorer CDCA4 og TFDP1, MDC1, FANCD2, PCNA, og gener som er involvert i DNA-reparasjon, RAD51C (XRCC3), RAD54B, RAD51 og HELLS. Denne studien har derfor identifisert gener som er regulert under avslutningen av HH avhengig cellulær proliferasjon og overlevelse i tykktarm kreft celler, og involverer gener assosiert med G1 /S-fase arrest, DNA-skade og stressresponser.
Resultater
GANT61 induserer nedregulert uttrykk for GLI gener og opphopning av menneskelige tykktarmskreft celler i G1 /S
i HT29 og GC3 /C1 celler behandlet med GANT61 (20 mm) for opp til 48 hr, uttrykk for målgener GLI1 og GLI2 var både nedregulert, og også HH ligand reseptor PTCH1, som bestemmes av QRT-PCR (figur 1A). Deretter HT29 eller GC3 /C1-celler ble behandlet, i duplikat, med GANT61 (20 uM) etterfulgt av farging PI og flowcytometrisk analyse for bestemmelse av cellesyklusfordelingen mellom G1, S og G2 /M-faser (figur 1B). I begge cellelinjer, cellene samlet i G1, 24 timer etter behandling med GANT61. I GANT61-behandlede HT29-celler, ble en 20% økning i G1-fase-celler assosiert med en tilsvarende reduksjon i celler i G2 /M-fase (14%) og i S-fasen (5%), i samsvar med et G1 /S sjekkpunkt arrest. I GC3 /C1-celler, en økning på 8% i G1-fase-celler ved 24 timer etter behandling GANT61 også samsvarer med en tilsvarende reduksjon i celler i G2 /M-fasen av cellesyklus (figur 1B).
celler ble behandlet i opptil 48 timer med GANT61 (20 uM) eller med 0,2% DMSO (bærerkontroll). (A) QRT-PCR av GLI1, GLI2 og PTCH1 gener fra tid 0-48 timer. (B) DNA ble ekstrahert ved 24 timer etter behandling, farget med propidiumjodid, og deretter analysert for virkningene av hemming av HH-signalering for fasefordeling av celler i cellesyklusen ved flowcytometri.
cDNA microarray analyser identifisere endringer i genuttrykk både vanlige og unike til HT29 og GC3 /c1 følgende GANT61 behandling
for å avgrense endringer i genuttrykk i HT29 og GC3 /C1 human colon carcinoma cellelinjer i respons på behandling med den GLI1 /GLI2 antagonist, GANT61, ekspresjonen av 18,401 humane gener ble profilert i kontrollceller behandlet med bærer (0,2% DMSO) og i celler behandlet med GANT61 (20 uM) i 24 timer. Gener med en falsk Discovery Rate (FDR) -adjusted p-verdi på 0,001 og fold change 1.5 ble vurdert forskjellig uttrykt gener (degs) indusert ved GANT61 forhold til kjøretøykontroll, hvorav 1,368 gener ble forskjellig uttrykt i HT29 og 1,002 gener i GC3 /C1 celler (figur 2). 755 gener eller 558 gener ble oppregulert, og 613 eller 444 gener ble nedregulert i HT29 og GC3 /C1 celler, henholdsvis. 763 og 397 genene ble uttrykt forskjellig og er unik for HT29 eller GC3 /c1, respektivt. Av de 763 degs unike for HT29, 459 (60%) var oppregulert og 304 (40%) ble nedregulert. På tilsvarende måte av de 397 degs unike for GC3 /C1, 262 (66%) ble oppregulert og 135 (34%), nedregulert. I motsetning til dette ble 605 gener som representerer 3,4% av alle gener forskjellig uttrykt som var felles for begge cellelinjer; Av disse 296 var oppregulert (49%), og 309 (51%) ble nedregulert (figur 2). Alle gener som er felles for både HT29 og GC3 /c1 som var signifikant oppregulert eller nedregulert (p 0,001). Er oppført i tabell 1 og 2, henholdsvis
Celler ble behandlet med GANT61 (20 pM) eller vehikkel alene (0,2% DMSO) i 24 timer, og total RNA ble ekstrahert som beskrevet i Materialer og Metoder. Endringer i genekspresjon ble bestemt av cDNA microarray genet profilering ved hjelp av Illumina Human-ref8 V3.0 Bead-Chip array. Gener med en falsk Discovery Rate (FDR) -adjusted p-verdi (p 0,001) og fold change 1,5 ble vurdert degs. Øvre panel: oppregulert gener. Nedre panel: nedregulert gener. Differential uttrykk for den totale, unike oppregulert, unike nedregulert, felles oppregulert, og felles nedregulert degs, vises.
Modulation av kanoniske signal trasé følgende hemming av HH signale
Gener med vesentlige endringer i uttrykk følgende GANT61 behandling ble tildelt ulike kanoniske signalveier og utsatt for Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA), hvor den resulterende 1,368 degs i HT29 og 1,002 degs i GC3 /c1 ble kartlagt til nettverk definert av IPA database (figur 3). For de kartlagte degs inkludert både opp- og ned-regulert gener, de 15 mest vesentlig endrede kanoniske trasé i HT29 demonstrert -log (p-verdi) spenner 2,045 til 9,025, og i GC3 /c1 2,32 til 7,509. Av de 15 baner som involverer gener vesentlig nedregulert, 12 var felles for begge cellelinjer. De 3 vanligste trasé med størst differensial nedregulert uttrykk inkluderer gener involvert i DNA-skade respons, cellesyklus sjekkpunkt kontroll, og mitose. Andre veier nedregulert involvert G1 /S og G2 /M DNA-skade sjekkpunkter, DNA forløper stoffskifte og cellesignalisering som involverer ulike veier, inkludert de som er involvert i krefttyper, som også viser 3 signaturer unik for enten HT29 eller GC3 /c1 (figur 3 ). Av de 15 baner som involverer gener som er den mest signifikant oppregulert, 8 er felles for begge HT29 og GC3 /c1, og 7 representerer unike veier for hver cellelinje, viser mer mangfold i mønstre av opp-regulert genekspresjon (figur 3 ). UP-regulert trasé som er felles for begge cellelinjer omfatter metabolisme-relaterte som steroider, pyruvat, glykolyse glutation, eller glycerolipid, og ikke er direkte relatert til kontroll av celleproliferasjon.
De 15 beste kanoniske signalveier , bestemmes av IPA, som var signifikant oppregulert eller nedregulert ved GANT61 behandling i HT29 og GC3 /C1 celler, vises. De 1,368 degs i HT29 og 1,002 degs i GC3 /c1 ble kartlagt til IPA- definert nettverk. Betydningen p-verdier som bestemmer sannsynligheten for at sammenhengen mellom gener i datasettet og den kanoniske veien er ved en tilfeldighet alene ble beregnet ved Fishers eksakte test, og er uttrykt som -log (p-verdi). A. Pathways med beriket nedregulert gener. B. Pathways med beriket oppregulert gener. Blå: Pathways felles for både HT29 og GC3 /c1. Red: Pathways unike enten HT29 eller GC3 /c1. Gule firkanter. Forholdet mellom antall degs som tilordnes til en bestemt kanonisk vei delt på totalt antall gener som utgjør den veien
Gener som viser differensial fold endre mønstre i GANT61 behandlet HT29 og GC3 /C1 celler
Brett endre mønstre av de høyest degs i HT29 og GC3 /c1 ble valgt, analysert og vises i en varme kartet for å evaluere og sammenligne likheter og forskjeller i differensial uttrykk mellom de to cellelinjene som ble behandlet med GANT61 (figur 4). I tillegg til gener med ulike funksjoner som ikke er direkte relatert til HH-avhengige spredning, oppregulert gener som påvirker G1 /S overgang og påfølgende cellecyklusprogresjonen, og som er felles for begge cellelinjene, inkluderer CDKN1A og DNA -Skade-induserbare transkripsjoner 3 og 4 (DDIT3 og DDIT4). Et betydelig større antall gener som er involvert i cellulær proliferasjon og cellesyklus overgang gjennom G1 /S-grensen, S-faseprogresjon, og G2 /M overgang, var signifikant nedregulert i ekspresjon, og felles for begge cellelinjer. Disse inkluderer CDC6 (involvert i G1 /S), tre gener som driver innreise og passasje gjennom S-fasen (CCNE2, E2F2) og G2 (CCNA2), gener involvert i DNA replikasjon og reparasjon (TYMS, POLE, TOP2A, TK1, POLE2), og to gener som regulerer mitose (AURKB, CDC20;. figur 4, stjernetegn)
varmen kartet ble generert i Matlab (Mathworks), og sammenligner ganger endring mønstre av de mest aner degs i HT29 og GC3 /C1 celler etter GANT61 behandling. De høyest degs demonstrert en differensial uttrykk p-verdi p 0,001 mellom kjøretøy kontroll (0,2% DMSO) og GANT61-behandlede celler. Venstre panel (red): oppregulert gener. Høyre panel (grønn): nedregulert gener. Gener som er merket med stjerne definere disse gener med spesifikke roller i G1 /S overgangs, S-fase progresjon, DNA replikering eller reparasjon eller regulering av G2- eller M- faseoverganger. Brett endringer av alle nedregulert degs og alle unntatt en oppregulert ° er ≤8 (sentrale fargespekter bar).
Av de 296 oppregulert gener, i tillegg til de genene sammenlign representert i kartet varmen som inkluderer DDIT3 (GADD153) og DDIT4 (REDD1), ble flere nye DNA-skader-induserbar transkripsjoner også identifisert og inkluderer DDIT2 (GADD45G), PPP1R15A (GADD34) og ATF3 (tabell 1). TP53INP1, som kan regulere cellesyklus arrest, og TP53INP2, identifisert i celledød svar, var også oppregulert. Av de 309 genene signifikant nedregulert i respons til GANT61, nye gener er identifisert, er KIAA0101 (p15 [PAF]), Replication Factor C varianter 2, 3, 4, 5, CDT1 faktorer E2F transkripsjon CDCA4 og TFDP1, MDC1, PCNA , FANCD2, og de som er involvert i DNA-reparasjon, RAD51C (XRCC3), RAD54B, RAD51 og HELLS (tabell 2) gener.
Forskjellig uttrykte gener involvert i G1 /S og G2 /M overganger
for ytterligere å evaluere gener som er involvert i kontroll av cellesyklusutvikling i humane colon carcinoma celler etter behandling GANT61, 10 gener involvert i den G1 /S eller G2 /M-overganger, identifisert av IPA, ble valgt ut for videre undersøkelse. Gener som kreves ved G1 /S-grensen for G1 /S overgang, eller for induksjon av et G1 /S sjekkpunkt følgende cytostatisk signaler, omfatter de to cyklin-avhengige kinase-inhibitorer, p21
Cip1 (CDKN1A) og p15
Ink4B (CDKN2B), som ble oppregulert ved 5.2- og 3.1- fold, 24 timer etter GANT61 administrasjon (tabell 3). Andre gener som kreves for G1 /S overgang som ble nedregulert inkluderer E2 transkripsjonsfaktor E2F2 (-4,2 ganger), og andre kritiske gener som ble nedregulert av 2.1- til 3.2- fold, inkluderer Cyclin E (CCNE2) , CDK2 og CDC25A. Ved G2 /M, GANT61 indusert nedregulert ekspresjon av CCNA2 (cyclin A2), cyklin B1 (CCNB1), cyklin B2 (CCNB2), CDK1 (CDC2), og CDC25C ved 2.3- 3.1- å ganger (tabell 3).
for å finne ut hvor robust cDNA microarray gene expression profilering etter behandling av HT29 og GC3 /C1 celler med GANT61 (20 mm) for 24 timer ble QRT-PCR benyttes for å bestemme endringer i uttrykket av den valgte gruppe på 10 degs bestemt fra cDNA mikromatriser. Genene som er involvert og primere syntetisert er vist i tabell 4. QRT-PCR ble utført på cDNA generert ved hjelp av total-RNA uavhengig isolert fra GANT61-behandlede HT29 og GC3 /C1 celler for 0 timer, 16 timer, 24 timer, 38 timer og 48 timers etter behandling. GAPDH ble anvendt for å normalisere alle QRT-PCR-data. Gener fastsatt av QRT-PCR inkluderte uttrykk for E2F2, CCNE2, CDC25A og CDK2 på G1 /S, som ble nedregulert, oppregulering av CDKN1A og CDKN2B på G1 /S, og nedregulering av CCNA2, CDC25C, CCNB2 og CDK1 i G2 /M (figur 5). Den oppregulert eller nedregulert endringer i genekspresjon etter GANT61 behandling og bestemt ved cDNA microarray profilering, ble bekreftet ved QRT-PCR (figur 5).
Celler ble behandlet med vehikkel alene (0,2% DMSO) eller GANT61 (20 uM) i 16 timer, 24 timer, 38 timer eller 48 timer. Totalt RNA ble ekstrahert og QRT-PCR ble utført som beskrevet i materialer og metoder ved hjelp av primersettene som er oppført i tabell 2. Data representerer gjennomsnittet ± SD av 4 bestemmelser, og GAPDH ble brukt til å normalisere de relative mRNA-nivåer.
diskusjon
HH signalveien aktiveres i en rekke humane kreftformer følgende mutasjoner i gener som regulerer kanoniske HH signalering, omfattende reseptoren PTC, og den HH signalmolekyl, SMO, og kan også aktiveres via transkripsjonen oppregulering av de HH ligander (oversikt i [3]). Denne veien er blitt av økende betydning som følge av å få innsikt i dens fremtredende rolle i mange utviklingsmessige prosesser, og i opprettholdelse av den ondartede fenotypen i et bredt spekter av humane kreftformer, hvis vekst er blitt funnet å forebygges ved selektiv inhibering av konstitutiv HH pathway aktivitet [14], [35], [36]. Tumorer i hjerne, prostata, hud, bukspyttkjertel og nyre har vist behovet for HH-GLI signalering, og har reagert på hemming av HH signale målmolekylet SMO ved cyclopamine eller SMOshRNA [4], [19], [20] [21], [22], [23].
transkripsjonsaktivatorer i HH signale omfatter medlemmer av GLI familien av transkripsjonsfaktorer, GLI1 og GLI2, som har både distinkt samt overlappende funksjoner [16 ]. Aktivering av GLI proteinene er en innviklet prosess som involverer modifikasjoner og interaksjoner av en rekke positive og negative sti regulatorer og er ikke fullt ut forstått [1], [14], [35]. Målgener som reguleres av HH signalveien varierer mellom vev og celletyper, i tillegg til å bli påvirket av nærvær eller fravær av regulatoriske faktorer ko-uttrykkes med GLI proteiner som til slutt bestemmer den transkripsjonelle programmer aktiveres av HH signale [6], [37 ]. Således onkogene signaliseringsbaner konvergerer på kanoniske HH signalering ved nivået for de GLI transkripsjonsfaktorer og i tillegg på målgener nedstrøms av GLI1 og GLI2 for ytterligere å drive HH signalveien i cellulær overlevelse i maligniteter [6], [7], [20 ], [38], [39], [40]. HH aliserte fenotypen er derfor betydelig påvirket og i siste instans bestemmes av den ko-ekspresjon av ytterligere regulatoriske faktorer, og følgelig av den cellulære rammen av genekspresjon.
HH signalering spiller en rolle i differensieringen program av normal tarmtottene [11], [12], [41], og det har blitt foreslått nylig at humane tarmkreft epitelceller viser et HH-GLI signale akse i ferd med å karsinogenese [24], [25]. Uttrykk for HH-GLI sti komponenter ble konsekvent vist i en analyse av 40 primære humane tykktarmskreft og svulster metastatisk til leveren [26], i samsvar med funn fra tidligere etterforskere [25], [42], [43]. Dermed brukte QRT-PCR, uttrykk for GLI1, PTCH1, GLI2 og SHH bestemt i alle menneskelige tykktarmskreft undersøkes. Kravet for både GLI1 og GLI2 for vedvarende proliferasjon og overlevelse av humane kolonkarsinom-cellelinjer in vitro, inkludert HT29, ble demonstrert ved anvendelse av siRNA-teknologi [26]. I tillegg knockdown av SMO ved SMOshRNA hindret veksten av HT29-celler i SCID-mus, mens vekt- HT29 subkutane transplantater svarte på cyclopamine ved reduksjon i tumorvolum [26]. Således er kanoniske aktivering av GLI1 og GLI2 via SMO viktig for overlevelsen og proliferasjonen av humane tykktarm carcinoma-celler in vivo.
I denne studien, er funksjonen av både GLI1 og GLI2 nedstrøms for SMO ble hemmet i tilstedeværelsen av GANT61, et lite molekyl-inhibitor som ble identifisert fra et celle-basert skjerm for å spesifikt hemme GLI1-mediert transkripsjon, men som også hemmet funksjon av GLI2 [34]. Dette middel ble valgt for å spesifikt hemme de endelige dommere over HH signalering, de GLI transkripsjonsfaktorer, i klarlegging av den nedstrøms målgener som bestemmer HH-avhengig proliferasjon i humane colon carcinom-celler. To cellelinjer, godt karakterisert i våre laboratorier, HT29 og GC3 /c1, ble behandlet med GANT61 (20 uM) i 24 timer, og ekspresjon av GLI1, GLI2 og PTCH1 mRNA ble nedregulert. Videre, effektene på celleproliferasjon som bestemmes av fordelingen av celler i cellesyklusen og strømningscytometrisk analyse viste akkumulering av celler i G1 etter behandling, med en ledsagende reduksjon av celler fra G2 /M kammer, og i tilfelle av HT29 , også fra S-fase, noe som tyder på induksjon av en G1 /S sjekkpunkt.
HT29 og GC3 /C1 cellene ble deretter behandlet med GANT61 (20 mm) for 24 timer ble RNA ekstrahert, og endringer i genet uttrykket ble bestemt av Illumina cDNA microarray profilering. Etter statistiske analyser, 1368 gener i HT29 og 1,002 gener i GC3 /c1, var fast bestemt på å bli betydelig modulert av GANT61 behandling (FC 1,5; p 0,001). For genene som var oppregulert i uttrykket, 296 gener var felles for begge cellelinjer, og for nedregulert gener, 309 gener var felles for begge cellelinjer. Blokaden av celler i G1 /S-grensen er dokumentert av oppregulert uttrykk for p21
Cip1 og p15
Ink4b som delvis regulerer G1 /S overgang. p15
Ink4b er et medlem av Ink4 familien av CDK-inhibitorer, blir indusert i respons til cytostatiske signaler [32], [44], og komplekser med syklin D /CDK4 og syklin D /CDK6 å mediere G1 faserest hos G1 /S overgang i visse systemer [30], [32]. p21
Cip1 kan binde et bredt spekter av cyklin-CDK-komplekser, med en preferanse for de som inneholder CDK2 (oversikt i [31], [45], og i løpet av en normal cellesyklus, letter aktiv cyklin-CDK-kompleksdannelse for å fremme celleproliferasjon. Men når uttrykt, p21
Cip1 danner en hemmende kompleks med Cyclin E /CDK2, som fører til G1 og dermed S- fase arrest, og dermed danner G1 /S sjekkpunkt [46], [47]. den planlagte tidspunktet for ekspresjon av cykliner E, A og B som driver cellesyklusprogresjon, gjenspeiles i de store endringer i faser av cellesyklusen. Cyclin E blir uttrykt ved maksimale nivåer i celler som gjennomgår G1 til S overgang, avtagende i løpet av S- fase progresjon, slik at G2 /M-celler er Cyclin E-negativ (oversikt i [30]). cyklin A uttrykkes i slutten av G1, viser tydelig ekspresjon i S-fase, og øker etter hvert som cellene forhånd mot G2, med nedbrytning i tidlig mitose; B typen cykliner begynner å bli uttrykt i slutten av S-fase, og drive cellene skjønt G2- og M- faser av cellesyklusen [30]. CDK2 styrer G1 /S overgang ved kompleksdannelse med syklin E, og blir aktivert av CDC25A, som dephosphorylates CDK2 [48]. CDC2 regulerer cellulær inntreden i mitose i G2 /M overgang, for derved å danne komplekser med sykliner A og B, blir aktivert ved CDC25C, og er nedregulert i slutten av M-fase [29]. Alle disse genene er nedregulert i ekspresjon som reaksjon på inhibering av GLI1 /GLI2 funksjon (tabell 2). Således signaler fremkalte for å fremme cellulær akkumulering ved G1 /S fører til undertrykkelse av gener som regulerer ytterligere cellesyklusprogresjon, og p21
Cip1 ekspresjon er vist å utarme ekspresjon av gener som regulerer DNA-replikasjon og reparasjon, og mitose [49], [50], [51]. I denne studien disse genene inkluderer CDC6 (aktiv ved G1 /S overgang og viktig for initiering av DNA replikasjon), TYMS, TOP2A, TK1, POLE og POLE2 (S-fase), og AURKB og CDC20 (mitose [52] , [53]), bestemt ved varmekartanalyse. En skjematisk fremstilling av de som er involvert i GANT61-indusert inhibering av cellesyklusprogresjon ved G1 /S, S-faseprogresjon gener, og regulering under G2- og M-faser, identifiseres fra cDNA mikromatriser, varmekartanalyse, og ved QRT-PCR , er vist i figur 6, og omfatter 5 av de 12 vanlige signalveier bestemt ved IPA analyse.
fra cDNA microarray, varmekartet, og QRT-PCR-analyser, gener som er involvert i ulike faser av cellesyklusen, inkludert G1 /S overgang, og progresjon gjennom S- G2- og M- faser, vises. Genene er identifisert, er CDK-inhibitorer, medlemmer av CDK og CDC-familier, cykliner, gener som er involvert i DNA-replikasjon og reparasjon, og gener som regulerer den mitotiske spindel, og involverer 5 av de 12 vanlige signalveier bestemt ved IPA analyse. Red: Up-regulert gener. Grønn: nedregulert gener. Lys skygge → mørk skygge, øker differensial uttrykk.
Omfattende cDNA microarray genet profilering analyse av gener som bestemmer HH signaliserer fenotype har blitt gjennomført bare i ikke-kreftcellemodeller. I disse systemene har GLI aktivering blitt stimulert med EGF behandling [6], stabil GLI1 eller HA-RAS uttrykk [7], eller ekspresjon av konstitutivt aktivert GLI2 [16]. I disse studiene, cyklin D [6], [7], GADD153 [7], CDKN2B, CDKN1A, CDK2, PCNA, TOP2A, CCNB1, XRCC1 [16], er blitt identifisert som gener aktiverte nedstrøms av GLI.
