Abstract
Forekomsten av spesifikke infeksjoner i UK prostatakreftpasienter ble undersøkt. Serum fra 84 pasienter og 62 kontroller ble testet for nøytralisering av xenotropisk murine leukemi virus-relatert virus (XMRV) Konvolutt. Ingen reaktivitet ble funnet i pasientprøvene. I tillegg ble ytterligere 100 prostata DNA-prøver testet for XMRV, BK virus,
Trichomonas vaginalis Hotell og humant papilloma virus ved nukleinsyre deteksjonsteknikker. Til tross demonstrerer DNA integritet og analyse følsomhet, vi klarte å påvise tilstedeværelse av noen av disse midlene i DNA-prøver, bar en prøve som var svakt positiv for HPV16. Derfor konkluderer vi med at disse infeksjonene er fraværende i denne typiske kohort av menn med prostatakreft
Citation. Groom HCT, Warren AY, Neal DE biskop KN (2012) Ingen bevis for smitte av britiske pasienter med prostatakreft XMRV, BK virus,
Trichomonas vaginalis
eller humant papilloma virus. PLoS ONE 7 (3): e34221. doi: 10,1371 /journal.pone.0034221
Redaktør: Mark Wainberg, McGill University AIDS Centre, Canada
mottatt: 22 november 2011; Godkjent: 24 februar 2012; Publisert: 28 mars 2012
Copyright: © 2012 Groom et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den britiske Medical Research Council [KNB U117592729] og Wellcome Trust [KNB 084955]. KNB er et Wellcome Trust Career Development Fellow. Forfatterne ønsker å takke støtte fra The University of Cambridge, Cancer Research UK, og National Institute for Health Research, som finansierer Cambridge Bio-medisinsk forskningssenter, Cambridge, UK. The Human Forskning Tissue Bank støttes av NIHR Cambridge Biomedical Research Centre. Forfatterne ønsker også å anerkjenne støtte fra National Cancer Research prostatakreft: Mekanismer av progresjon og behandling (spørsmål) samarbeids (tilskudd kode G0500966 /75466), som har finansiert vev og urinsamlinger i Cambridge. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC) bidrar vesentlig til den globale sykdomsbyrden som følge av kreft og er den vanligste kreftformen hos menn i Storbritannia (https://info.cancerresearchuk.org/cancerstats). Nåværende screening metoder og pasient beslutninger blir hindret av en grunnleggende mangel på innsikt i naturhistorie av sykdommen, noe som sannsynligvis vil være flere faktorer. Forskerne foreslo en smittsom årsak så tidlig som på 1950-tallet, og siden da ulike patogener har vært forbundet med sykdommen (Anmeldt i [1]). Selv om epidemiologiske studier indikerer at en historie for å skaffe seksuelt overførbare sykdommer øker risikoen for PC, har ingen definitiv tilknytning til en bestemt infeksjon er vist. Vi bestemte oss for å samtidig undersøke utbredelsen av fire forskjellige smittestoffer som er uavhengig av hverandre vært assosiert med PC. Vi forsøkte å øke sjansene for deteksjon ved å studere prøver fra en godt karakterisert kohort av pasienter med alvorlig PC.
For det første, så vi for det nye gammaretrovirus, xenotropisk murine leukemi virus (MLV) -relaterte virus (XMRV ), som ble isolert fra familial PC pasientens vev i 2006 [2]. En annen, større, kontrollert studie i 2009 antydet at XMRV ble forbundet med høy grad av svulster og var ikke begrenset til familiære PC tilfeller [3]. Imidlertid har flere påfølgende studier fant ingen kobling med XMRV og denne foreningen har vært kontroversielt. . Mens dette manuskriptet var under utarbeidelse en studie av Paprotka
et al
demonstrerte sannsynlig rekombinant opprinnelsen til XMRV [4]; Disse anen virus har siden blitt ytterligere karakterisert [5]. Nylig, Martinez-Fierro og kolleger oppdaget humant papilloma virus (HPV) i 20% av PC tilfeller av PCR [6]. Høy risiko HPV er utløsende agenter i livmorhalskreft og deres E6 og 7 proteiner er i stand til å immortalise prostataceller [7]. Polyomaviruses har også potensial for kreftutvikling og BK-virus (BKV) har vært hyppig påvist i PC-prøver, senest i vev, urin og plasma [8], [9]. Endelig er parasitten
Trichomonas vaginalis plakater (TV) kjent for å forårsake prostatitt og viste en noe økt prevalens på PC i en fersk case-control studie [10]. Derfor er disse tre patogener ble undersøkt i tillegg til XMRV.
Vi undersøkte vev PC DNA for XMRV, BKV, TV og HPV-nukleinsyre i tillegg til testing av PC-pasientsera for nærværet av nøytraliserende antistoffer til XMRV Env. Til tross for beviser analysene var svært sensitive, var ingen av de pasientprøver positive for infeksjon, med unntak av en HPV-positive DNA-prøve. Våre resultater tyder derfor på at det ikke er noen sammenheng med noen av agenter og PC, og at kliniske tilnærminger bør ikke fokusere på å motvirke disse smittestoffer hos menn.
Resultater
Eighty-fire britiske PC pasient og 62 kontrollsera (fra menn med lav prostata-spesifikt antigen (PSA) eller høy PSA med en negativ biopsi) ble testet for tilstedeværelse av anti-XMRV antistoffer ved hjelp av en nøytraliser assay som tidligere er blitt beskrevet [11]. Til tross for validerte monoklonale antistoff-kontroller som viser reproduserbar nøytraliserende aktivitet i denne analysen, er ingen av PC-pasientsera viste noen tegn på anti XMRV antistoffer. En serumprøve fra en kontroll, Q2, viste spesifikk reaktivitet mot XMRV ved høye serumkonsentrasjoner (figur 1).
smittsomhet av XMRV etter inkubasjon med pasientserum eller monoklonalt suspensjon. Smittsomhet (målt som relativ β-galaktosidase-enheter) er plottet mot den resiproke verdi av serumfortynningen (sorte symboler) eller monoklonalt suspensjon (blå datapunkter, monoklonalt 603, negativ kontroll, røde datapunkter, 83A25 «, positiv kontroll). Stiplet linje indikerer nivået av infektivitet i fravær av serum /monoklonalt. Q1-10 er tålmodige betegnelser. Q2 utstillinger nøytralisering.
Dessverre, DNA var ikke tilgjengelig fra samme kohort av pasienter testet over og så DNA ble ekstrahert fra ytterligere ett hundre prostata kreft vevsprøver fra en annen tilsvarende godt karakterisert kohort. DNA-prøver ble testet for integritet av
hgapdh
PCR og 96 viste detekterbart produkt etter en enkelt runde (en undergruppe er vist i figur 2A). De fire prøvene som ikke klarte å forsterke produktet ble inkludert i ytterligere tester som kontroller for analysen forurensning. Ekstraherte DNA ble testet for XMRV ved bruk av en nestet PCR-amplifisering av det virale
gag
-genet som tidligere beskrevet [2]. Dette PCR detekterer en pålitelig måte enkle kopier av plasmid-kontroll fortynnet i et overskudd av humant DNA i hvert eksperiment (figur 2B). Dette PCR er også i stand til å detektere beslektede gammaretroviruses (MLV), inkludert de som finnes som endogene virus i mus. Seks av 100 PC-DNA-prøver ga et produkt med forventet størrelse (figur 2C). Som XMRV er relatert til endogene retrovirus som er tilstede i mus, kunne nærværet av forurensende muse-DNA fører til et positivt resultat i denne PCR. For å kontrollere for dette, ble positive prøver også testet med hensyn til murint DNA ved anvendelse av en PCR som er spesifikke for muse-endogene retroviral element intracisternal A-partikler (IAP) [12]. Dette PCR kan påvise lave nivåer av mus-DNA på grunn av den høye frekvensen av IAP i mus genomer (figur 3A). Alle seks prøver som var positive for XMRV
gag
var også positive med IAP PCR (figur 3B, Bord 1 og S1). For å klargjøre opprinnelsen til disse bandene mer presist, ble amplikonene klonet og sekvensert. Fylogenetisk analyse av sekvensert «
gag
» amplikonene støttet påstanden om at de var hentet fra forurensende murine nukleinsyre (figur S1).
Paneler A-C viser 1% agarosegel farget med etidiumbromid. For alt tyder M markør, W indikerer vann, tallene på venstre angir størrelsen på markører i basepar, piler indikerer forventet bandet størrelse for hver PCR. A) Påvisning av
hgapdh
i DNA isolert fra PC vev DNA-prøver 1-24 bruker enkelt runde PCR. Forventede PCR produktstørrelse, 225 basepar. B) Standard kurve for å bestemme deteksjonsgrensen for XMRV
gag
nestet PCR. Ti-ganger seriefortynninger fra 10
6 til 1 molekyl per ul av XMRV plasmid (pcDNA3.1 /VP62) ble tatt opp i en bakgrunn av et overskudd av humant genomisk DNA. Andre runde forsterkning produkter av
gag
nestet PCR vises. Tall over baner indikerer innspill antall molekyler. Forventede PCR produktstørrelse 413 basepar. Sekvensering av den langsommere migrere svakt bånd i «0» lane (humant genomisk DNA alene), viste at dette skal være ikke-spesifikk amplifikasjon av humane gener (data ikke vist). C) Påvisning av XMRV
gag
sekvenser i DNA isolert fra prostata kreft vevsprøver. Andre runde amplifiseringsprodukter fra en undergruppe av pasienter er vist som i (B). Prøvene 4, 8 23, 60, 62 og 72 er positive.
Paneler A og B viser en% agarosegel farget med etidiumbromid. For alt tyder M markør, tallene til venstre indikerer størrelsen på markører i basepar, W indikerer vann, piler indikerer forventet bandet størrelse for hver PCR. Produkter fremstå som en sverte grunn av varierende amplicon lengder. For referanse, er det ca tusen IAP eksemplarer per musegenomet. A) Intra-cisternal A-type partikkel DNA ble amplifisert fra serielle fortynninger av mus DNA (0,001 til 10
3 genomekvivalenter, enten C56BL /6 eller
Mus Spretus
). Produkter fra enkelt runde forsterkning vises. Tall over baner angir antall musegenomekvivalenter i PCR-reaksjonen. B) Produkter fra PCR oppformering av intra-cisternal A-type partikkel DNA fra valgt PC vev DNA-prøver. Tall over baner indikerer pasient betegnelser. Prøvene 4, 8, 23, 60, 62, 70 og 72 er positive. +/- Indikerer positivt eller negativt resultat i
gag
PCR (figur 2).
DNA-prøver ble også testet for tilstedeværelse av BKV av nestet PCR. Til tross for pålitelig deteksjon av en molekyl av BKV plasmid i gjentatte forsøk (pBR322-Dunlop, figur 4A), vil ingen av pasientprøvene ga et bånd med passende størrelse (undergruppe vist i figur 4B). Tilsvarende pasientprøvene var negative for TV ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig real-time PCR-testing kit (Figur 4C). Denne analysen var i stand til på en pålitelig måte å detektere ti kopier av TV (figur 4C + D). Disse negative resultatene var ikke på grunn av en svikt i ekstraksjonsprosedyren som en intern kontroll ekstraksjon ble vellykket amplifisert. Alle DNA-prøver ble deretter testet for HPV og alle prøvene, men en, som hadde svak hybridisering til HPV16, ble funnet å være negativ, til tross for vellykket amplifikasjon av humant DNA ved bruk av settet styre sonde i alle bortsett fra en prøve (Prøvene 1-3 er vist i figur 5). En oppsummering av disse resultater for alle 100 PC DNA-prøver er gitt i tabell 1 og S1.
Panelene A og B viser en% agarosegeler farget med etidiumbromid. For begge indikerer M markør, tallene til venstre indikerer størrelsen på markører i basepar, piler indikerer bånd av forventet størrelse for den andre runden (453 bp). A) Serielle fortynninger av BKV plasmid (pBR322-Dunlop) ble fremstilt av 10
6 til 1 molekyl (er) og amplifisert ved nestet PCR. Produkter av andre runde av amplifisering er vist. Tall ovenfor baner indikere antall molekyler i PCR-reaksjonen. B) Produkter fra andre runde av nestet PCR forsterkning av BKV fra en undergruppe av PC vev DNA-prøver. Tall over baner indikerer pasient betegnelser. C) Amplification plott som viser kurver for kvantitative PCR reaksjoner oppdage TV ved hjelp Kvantifisering av Trichomonas vaginalis Avansert Kit. Serielle fortynninger av positiv kontroll er vist, så vel som manglende forsterkning til PC vev DNA-prøvene 1-50 (uten forsterkning og således alt under terskelverdien linje). Innganger var som følger: int, intern ekstraksjon kontroll (detektert på en separat filter), a, 10
6 TV-molekyler, b, 10
5 TV-molekyler, c, ti
4-TV-molekyler, d, 10
3 TV-molekyler, e, 10
2 TV-molekyler, f, 10 TV-molekyler. Plot viser delta Rn mot syklus nummer. D) Plot av Ct-verdier mot log av positive kontrollinngang konsentrasjon demonstrere linearitet, R
2 . 0.99
HPV DNA i PC vev DNA-prøver ble oppdaget ved hjelp INNO-LIPA HPV Genotyping Extra. HPV-DNA ble amplifisert fra prøvene ved anvendelse av primere til konserverte sekvenser genererer biotinylerte produkter. Biotinylerte amplikonene ble deretter hybridisert til strimler peiling bevarte og typespesifikke HPV-prober. Bånd indikerer binding av biotinylert prøve-DNA til målet er angitt. Marker er for å justere strimler, bekrefter konjugat kontroll av reagenser fungerer som de skal, viser hDNA kontroll tilstedeværelsen av menneskelig DNA i prøven, HPV (bred) viser binding av HPV DNA til prober som binder konserverte regioner. Alle andre stiplede linjene viser områder som er bundet av spesifikke HPV f.eks HPV16 (vist). Tall over strimler er pasient betegnelser (kun 3 prøve strimler er vist for klarhet), -, negativ kontroll (vann), +, positiv kontroll (følger med kit). Resultat for enkelt HPV positive vises ikke som den var for svak til å vises på et skannet bilde.
Diskusjoner
En omfattende og kontroversielle litteraturen finnes knytte smittestoffer til PC, spesielt XMRV og HPV [1], [13]. Som vi hadde tilgang til et stort, godt karakterisert kohort av PC pasienter og erfaring med bruk av molekylære teknikker for å oppdage virus, følte vi at det ville være nyttig å undersøke tilstedeværelsen av fire agenter; XMRV, BKV, TV og HPV, i de samme PC-prøvene.
I de senere årene har det vært stor interesse og uenighet i foreningen av XMRV med PC. I et assay utviklet for å påvise en immunrespons mot XMRV, en serumprøve i vår undersøkelse var i stand til å nøytralisere viruset (Q2, figur 1). Men dette serum var fra en lav PSA kontroll individuell og derfor var det ingen sammenheng med PC. Denne nøytralisering assay var lik den som ble anvendt ved Arnold
et al.
, Bortsett fra at pseudotyped viruslignende partikler som ble brukt var basert på MLV snarere enn HIV [14]. Dette representerer tenkes et falskt positivt resultat på grunn av epitop kryss-reaktivitet. Dessverre, verken videre serum for testing reaktivitet av western blot eller DNA for testing av PCR var tilgjengelige for denne personen. Videre fant vi ikke noe bevis for den kanoniske XMRV [2] i PC DNA-prøver av PCR. Seks prøver forsterket et produkt i
gag
PCR, men var også positive for muse-DNA, noe som tyder på at dette PCR hadde forsterket endogene murine retrovirale sekvenser som er til stede i høye kopiantall i mus (figur 2 og 3). Fylogenetisk analyse av amplikonene støtter denne hypotesen (figur S1). I tillegg en
gag
negative prøven var positiv i IAP PCR, som viser at IAP PCR er i stand til å forsterke forurensende muse DNA som ikke ble oppdaget av
gag
PCR.
Sammen vår serologiske og PCR-data viser ingen sammenslutning av gammaretroviruses og PC. Dette stemmer med fersk genetisk bevis bestemme opprinnelsen til XMRV som tyder på at XMRV-relaterte virus er faktisk ikke humane patogener [4], anmeldt i [15]. Til tross for å gjøre vårt ytterste for å isolere DNA og utføre analyser i musefritt anlegg ved hjelp av nytt utstyr kjøpt for denne studien, våre IAP PCR resultatene markere problemet med forurensning av prøver med muse-DNA. Faktisk har det nylig blitt rapportert at tidligere positive prøvene kan skyldes forurensning [16], [17], [18]. Forurensning er et problem mye diskutert i XMRV litteraturen [13]. Forskere ved hjelp av ekstremt følsomme nukleinsyre teknikker for å oppdage patogener i pasientprøver bør være skeptisk til mistolking tilsynelatende positive resultater [19]. I tilfelle av XMRV, flere metoder for forurensning er mulig. Sekvensering av PCR-produkter er viktig, sammen med å se etter tilstedeværelse av muse-DNA som kunne gi opphav til produkter i PCR på grunn av det høye nivået av endogene retrovirus. Men svært beslektede endogene sekvenser eller forurensende plasmid DNA kan ikke bli merket av denne metoden. Spesifikke PCR-analyser konstruert for å oppdage disse forurensninger må brukes [20]. Viral forurensninger eller forurensning med laboratorie avledet infiserte humane celler er umulig å skille fra
bona fide
menneske-smitte. Den eneste måten å bekrefte en tilsynelatende positivt resultat er av uavhengig reprodusere det, det er derfor det er viktig for flere grupper å gjennomføre egne undersøkelser. Mens dette manuskriptet var i fremstillingen to viktige papirer henvisning påvisning av XMRV i kronisk tretthetssyndrom pasientprøver ble trukket tilbake i lys av bevisene for kontaminering [21], [22], [23], [24].
Vi har også benyttet PCR-analyser for å skjerme våre pasientprøver i tre patogener tidligere knyttet til PC. Vi brukte publiserte primere rapportert å oppdage BKV i PC-prøvene [25], og to kommersielle kits til å lete etter TV og HPV. TV-settet er laget for å ha bredest deteksjon profilen mulig mens rester bestemt til TV-genomet. HPV-assay allerede er brukt til å overvåke cervikale vevsprøver og kan identifisere 28 typer av HPV, herunder alle kjente høy-risiko og sannsynlige høyrisiko genotyper, så vel som et antall av lav-risikotyper. Hvis en forening ble funnet med PC og noen av disse patogener da disse analysene vil gi en rask og enkel måte å screene pasienter og identifisere dem for hvem anti-patogen behandlinger kan være fordelaktig. Alle analysene ble validert ved bruk av positive kontroller (figur 4A, C og D), og kvaliteten av DNA ekstrahert fra PC-prøvene ble bestemt ved amplifikasjon av humane gener (figurene 2 og 5, tabeller 1 og S1). Imidlertid har ingen av prøvene testet positivt for BKV eller TV og bare én prøve testet positive for HPV (type 16). Dette tyder på at disse patogenene er ikke vanlig i PC vev og dermed behandling for infeksjoner er usannsynlig å hjelpe pasienter generelt.
Selv om et negativt resultat er vanskelig å påvise entydig, vil vi hevde at våre DNA-prøvene var tilstrekkelig kvaliteten for å amplifisere human kontrollgener og at amplifisering av internkontrollen indikerte at ekstraksjonsprosedyren ikke hemmer PCR. Det er mulig at prosessen med formalinfiksering og forankring parafin førte til fragmentering av DNA. Hvis dette var tilfelle da
hgapdh
kontroll kan bare bekrefte det mulig påvisning av amplikonene kortere enn 225 bp (HPV og TV). Hvis imidlertid forekomsten av XMRV eller BKV var høyt, ville man likevel forvente å detektere virale sekvenser i noen av prøvene, til tross for vilkårlig fragmentering. I tillegg er XMRV, BKV og TV-analyser var i stand til å oppdage en-til-ti genomekvivalenter antyde analysene som ble brukt var overfølsomme. Disse deteksjonsgrenser ble sikkert observert på gjentatte forsøk. Våre data støtter konklusjonene i Sfanos
et al.
Som undersøkte forekomsten av disse midlene i PC-materiale som en del av en større studie fokusert på deteksjon av bakteriell infeksjon i prostata [26]. Disse forfatterne var også ute av stand til å oppdage noen av disse patogener i PC-pasienter med unntak av en positiv BKV resultat.
Studier som fant patogen DNA i prostatavevet kan reflektere forurensning av prostata med patogener knyttet til proksimale vev eller til og med ikke-humane kilder. Den historiske forening av PC med seksuelt overførbare infeksjoner kan reflektere økt betennelse på grunn av infeksjon, men kan ikke kreve infeksjon med en spesiell patogen. Alternativt kan denne studien ikke har tatt med de mest aktuelle patogenet eller være stor nok til å avdekke lite bidrag av hvert av de undersøkte midler. Et generelt redusert eksponeringen mot seksuelt overførbare infeksjoner i nyere tid, i kombinasjon med de relativt små tall i vår studie, kan være til hinder for påvisning av smittede personer. Imidlertid er kohort undersøkt en gruppe av godt karakteriserte pasienter med alvorlig sykdom, og hvis en hvilken som helst av de ovennevnte infeksjoner var sterkt assosiert med PC, og derfor er klinisk relevante, ville man forvente å ha detektert dem i denne studien. Vi konkluderer derfor med at XMRV, BKV, TV og HPV er ikke utbredt i denne PC-kohorten og foreslår at alternative etiologi vurderes til PC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble samlet inn gjennom ledeteksten studie med etisk godkjenning fra Trent Multisenterforskningsetiske senter~~POS=TRUNC komité og med informert, skriftlig samtykke.
Plasmider
HG1 er en replikering inkompetent derivat av pcDNA3. 1 /VP62 med delesjoner i promotorområdet og pakking signal [27]. pLTR-LacZ er en MLV-basert retroviral vektor som koder for β-galaktosidase [27]. PBR322-plasmid Dunlop (ATCC # 45025) ble mottatt fra Mike Imperiale (Ann Arbor) og har blitt tidligere beskrevet [28].
Prøve innsamling og prosessering
Serumprøver fra fire grupper av pasienter ble analysert: 30 lave PSA-kontroller, 32 høy PSA men negative biopsi kontroller og 84 PC-pasienter. DNA ble isolert fra 100 formalinfikserte parafininnstøpte PC skiver ved hjelp av QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner, bortsett fra prøvene ble inkubert i lyseringsbuffer over natten for å sikre fullstendig lysis. DNA ble eluert i 50 ul elueringsbuffer, og konsentrasjonen bestemt ved anvendelse av et Nanodrop spektrofotometer.
Påvisning av nøytraliserende antistoffer i serum XMRV
nøytraliseringsmetoder analyser ved anvendelse XMRV er tidligere blitt beskrevet [11]. Monoklonale antistoffer 83A25 «og 603 ble anvendt som positive og negative kontroller henholdsvis, og cellene ble overvåket for levedyktighet ved visuell inspeksjon ved tidspunktet for høsting.
PCR
Sekvenser av primere alle har vært tidligere rives som sitert og er gitt i tabell 2. Enkelt runde PCR påvisning av
hgapdh Hotell og nestet PCR for XMRV
gag
ble utført som beskrevet i [2] med primere hGAPDH-66F og hGAPDH -291R og GAG-OF, GAG-OR, GAG-IF og GAG-IR. IAP DNA enkelt runde PCR ble utført er beskrevet i [12] og påvisning av BKV ble utført ved nestet PCR som tidligere beskrevet [25] ved anvendelse av primere BKV
for, BKV
rev, BKVnes
for og BKVnes
rev. For å bestemme sensitiviteten, 10 ganger serielle fortynninger 1-10
6 molekyler pcDNA3.1 /VP62 for XMRV, C56BL /6 eller
Mus Spretus
DNA for IAP eller pBR322-Dunlop for BKV, var testet ved bruk av de ovenfor angitte PCR. Produktene av alle enkle runde /nestet PCR ble analysert ved gel elektroforese. For påvisning av
Trichomonas vaginalis
, prøver ble testet ved hjelp av Kvantifisering av Trichomonas vaginalis Advanced Kit (PrimerDesign Ltd) i henhold til produsentens instruksjoner ved hjelp av Mini Precision Low-Rox Mastermix (PrimerDesign) og ABI 7500 Real- Time PCR System (Applied Biosystems). Intern DNA-ekstraksjon kontroller ble brukt for alle deteksjonsmetoder sammen med en positiv kontroll standardkurve og negative kontroller som er egnet for hver analyse. Forsterkning av HPV DNA for typing ble utført ved hjelp av INNO-LIPA HPV genotyping Extra Amp kit i henhold til produsentens instruksjoner. Typing ble så utført ved hjelp av INNO-LIPA HPV genotyping ekstra kit på en
Auto
-LiPA instrument i henhold til produsentens instruksjoner (alle Innogenetics).
Amplicon analyse
PCR-produkter ble klonet inn i pSMART® HCKan vektor bruker CloneSmart HCKan Blunt Cloning Kit (Lucigen) i henhold til produsentens instruksjoner. Bundet pSMART vektorer ble sekvensert ved hjelp av primere vist i Tabell 2. Sekvenser ble justert til riktig region av
gag
i XMRV-sekvenser som er tilgjengelig på PubMed og relevante MLV sekvenser bruker MegAlign (DNASTAR LaserGene 8). Sekvenser er blitt deponert i GenBank (JQ048948-JQ048955). Ytterligere detaljer om sekvenser og deponeringsnumrene er angitt i figuren forklaringen. Modellvalg for fylogenetisk analyse ble utført med Modelgenerator v8.5 [29] og Bayesianske phylogenies ble beregnet med den generelle tiden reversibel modell av nukleotid substitusjon og en gamma-fordelt rente heterogenitet bruke programmet MrBayes [30]. Den MCMC algoritmen ble kjørt for 4.000.000 generasjoner, prøvetaking trær hver 100 generasjoner. ESS verdier ble beregnet ved hjelp av Tracer (https://beast.bio.ed.ac.uk/Tracer). Konsensus tre med avdelings lengder og posterior sannsynlighet verdier som støttes for de interne noder ble visualisert i Figtree (https://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree), heie på MoMLV som en outgroup og redigeres med Adobe Illustrator .
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
fylogenetisk analyse av
gag
sekvens amplikonene. Amplikonene fra
gag
nestet PCR (figur 2) ble klonet, sekvensert og sammenlignet med samme region fra kjente XMRV og MLV sekvenser. Identiske sekvenser i den første panelet ble fjernet fra fylogenetisk analyse for å unngå skjevhet. Deponeringsnummer er som følger: PreXMRV1 (Sannsynlig XMRV doms sekvens, NC_007815.2), murine C-type retrovirus (X94150), AKV (endogen ekotropisk MLV, J01998), DG-75 (xenoptropic Moloney MLV variant, AF221065), murine AIDS virus (S80082), 22Rv1 (XMRV stammer fra 22Rv1 celler, FN692043.2), VP62 (original XMRV isolere fra en PC pasient, DQ399707). Xmv, Mpmv og PMV (xenoptropic, endret polytropisk og polytropisk endogene MLV) sekvensene ble hentet fra Jern
et al. PLoS Genet
2007. FB579966 og FJ907198 rapporteres isolater fra en pasient og 22Rv1 celler henholdsvis. Bayesianske phylogenies ble beregnet med den generelle tiden reversibel modell av nukleotid substitusjon og en gamma-fordelt rente heterogenitet bruke programmet MrBayes. Den MCMC algoritmen ble kjørt for 4.000.000 generasjoner for to samtidige uavhengige analyser, prøvetaking trær hver 100 generasjoner. Ved slutten av analysen PSRF = 1,000 og standardavvik = 0. ESS-verdier var 899 og 959 for de to analysene (bestemt ved bruk av tracer v1.5). Konsensus treet er vist med avdelings lengder og posterior sannsynlighet verdier som støttes for de interne noder visualisert i Figtree v1.3.1, heie på Moloney MLV som en utgruppe. Sekvensert amplikonene er vist i blått. Disse sekvensene er blitt deponert i GenBank (JQ048948-JQ048955). Den opprinnelig beskrevet XMRV sekvens, VP62, vises i rødt. Støtte verdier, og derfor tillit, er begrenset av mangel på divergens i
kneble
, er imidlertid gruppering av amplikonene med endogene retrovirale sekvenser støttende for deres er avledet fra forurensende muse DNA
doi:. 10,1371 /journal. pone.0034221.s001 product: (TIF)
Tabell S1. .
Full nukleinsyre deteksjonsresultater
doi: 10,1371 /journal.pone.0034221.s002 plakater (DOC)
bekreftelser
Forfatterne takker George Kassiotis for å gi C56BL /6 og
Mus Spretus
DNA, Mike Imperiale for pBR322-Dunlop, Asif Tamuri for hjelp med tolkning av fylogenetiske analyser og John Doorbar for nyttige diskusjoner. De synspunkter og meninger uttrykt deri er de av forfatterne, og reflekterer ikke nødvendigvis de av Department of Health.
