Abstract
Cdc37 er en 50 kDa molekylære anstand som retter seg mot egen ustabile protein kinaser til den molekylære anstand HSP90. Det er også et overuttrykt oncoprotein som formidler karsinogenese og vedlikehold av den ondartede fenotype ved å stabilisere de kompromitterte strukturer av mutert og /eller overuttrykt onkogene kinaser. Her kan vi rapportere at Cdc37 ikke er begrenset intracellulært, men i stedet er det også til stede på overflaten av MDA-MB-453 og MDA-MB-231 humane brystcancerceller, hvor det er vist å delta i kreftcelle motilitet prosesser. Videre demonstrerer vi ved hjelp av et anti-Cdc37 celle ugjennomtrengelig antistoff, som på samme måte som dens intracellulære motstykke, denne overflate pool av Cdc37 interagerer spesifikt med HSP90, så vel som kinase-reseptorene HER2 og EGFR på celleoverflaten, sannsynligvis som virker som en ko-faktor i HSP90 sin ekstracellulære chaperoning aktiviteter. Til slutt viser vi at funksjonell inhibering av overflate HSP90 ved hjelp av mAb 4C5, en celle ugjennomtrengelig monoklonalt antistoff mot dette protein, ikke bare fører til forstyrrelse av Cdc37 /HSP90-komplekset, men også til hemming av Cdc37 /ErbB-reseptorer komplekser. Disse resultatene støtter en viktig rolle for overflate Cdc37 i samråd med HSP90 på celleoverflaten i løpet av cancerceller, invasjonsprosesser og styrke det terapeutiske potensialet til mAb 4C5 for behandling av kreft
relasjon:. El Hamidieh A, Grammatikakis N , Patsavoudi E (2012) Cell Surface Cdc37 Deltar i ekstracellulær HSP90 mediert Cancer Cell invasjon. PLoS ONE 7 (8): e42722. doi: 10,1371 /journal.pone.0042722
Redaktør: Wanjin Hong, Institutt for molekylær og cellebiologi, Singapore
mottatt: 29 mars 2012; Akseptert: 10. juli, 2012; Publisert: 17 august 2012
Copyright: © El Hamidieh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. AEH mottatt et fellesskap fra Hellenic Pasteur Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
HSP90 er en molekylær anstand som fungerer i forbindelse med en kohort av co-anstand for å lede stabilisering og aktivering av en rekke signalnettverk proteiner, inkludert onkogene kinaser, transkripsjonsfaktorer og hormonreseptorer [1], [2 ]. Cdc37 (Celledeling syklus protein 37) regnes som en viktig del av denne multi anstand maskiner, spiller en spesialisert og uunnværlig rolle i modning og /eller stabilisering av en stor undergruppe av protein kinaser, innblandet i signaltransduksjon, spredning og overlevelse [ ,,,0],3]. Ved å blokkere lukking av den N-terminale HSP90 ATP-bindingssetet, hemmer Cdc37 ATPase aktiviteten til HSP90 [4] og bistår lasting av kinase klient proteiner på anstand maskineri [4], [5]. Ιn Spesielt Cdc37 fungerer som en adapter eller stillas, tilrettelegging klient kinase interaksjon med HSP90 [6] og deretter ved å rekruttere disse klient kinaser inn i HSP90 komplekse, det stabiliserer og /eller vedlikeholder dem i en sammenleggbar-kompetent konformasjon [7]. I tillegg fremmer Cdc37 montering av HSP90-proteinkinase-komplekser [8] og ekspresjon av en dominant-negativ form som mangler HSP90-bindende domene inhiberer kinase aktivering i pattedyrceller [9]. Mange klient proteiner samhandle direkte med både Cdc37 og HSP90 og deres folding, modning og stabilitet avhenger av aktiviteten til begge anstand. Derav Cdc37 formidler dannelsen av HSP90-Raf1 [9] og HSP90-Cdk4 komplekser [10], og disse interaksjonene er nødvendige for proteinstabilitet og kinase funksjon. Det komplekse forholdet mellom Cdc37 og HSP90 er illustrert ved det funn at deres interaksjon er stabilisert ved klienten proteinet [11]. I løpet av de siste årene har det vært økende bevis som viser at intracellulær HSP90 spiller en sentral rolle i anskaffelse og vedlikehold av ondartede fenotype [12], [13], [14], [15]. Følgelig er det økende interesse for Cdc37 i sammenheng med kreft [16], [17] siden Cdc37 også regulerer flere onkogene kinase klienter. Faktisk Cdc37 nivåer er funnet økt i mange kliniske kreft [17]. Spesielt Cdc37, økes i prolifererende vev, og er sterkt uttrykt i visse krefttyper, inkludert anaplastisk stor cellelymfom [18] akutt myelocytisk leukemi [19], hepatocellulært karsinom [20] og multippel myelom [21]. Videre data er presentert som indikerer at Cdc37 kan fungere som et onkogen, som mus konstruert for å over-uttrykke Cdc37 utvikle tumorer med en høy frekvens [22], som tyder på at etableringen av protein-kinase-reaksjonsveier mediert av HSP90 /Cdc37 kan være en hastighet -limiting hendelse i epitelceller transformasjon [22]. I den senere tid har det blitt vist at Cdc37 er essensielt for å opprettholde prostata tumorcellevekst [23]. I tillegg er blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor-alfa som er oppregulert og aktivert i flere maligniteter som danner et kompleks med HSP90 og co-anstand Cdc37 in ovarian, glioblastom, og lungekreftceller [24]. Sammen utgjør disse resultatene støtter målretting av Cdc37 for kreftbehandling.
Vi og andre har tidligere identifisert et ekstracellulært pool av HSP90 både i normale celler og kreftceller som ble vist å være involvert i migrasjon og invasjon prosesser, henholdsvis [ ,,,0],25], [26], [27], [28], [29], [30]. Videre, og ved å utnytte den funksjon blokkerende egenskaper til en celle-ugjennomtrengelig monoklonale antistoff med navnet mAb 4C5, spesielt rettet mot HSP90 har vi vist at ekstracellulær HSP90 interagerer med HER-2 på celleoverflaten [28] samt metalloproteinaser MMP-2 og MMP-9 [29]. Selv om et økende antall HSP90 co-anstand som HSP70, Hop og p23 ble også funnet på celleoverflaten [31], [32], [33], deres handlinger og underliggende mekanismene er ikke klarlagt ennå. Tar de ovennevnte hensyn, i dette arbeidet vi utforske celleoverflaten lokalisering av Cdc37 og vi undersøke dens mulige engasjement i kreftcelleinvasjons prosesser så vel som dens potensielle samvirkende partnere i løpet av denne prosessen, ved hjelp av MDA-MB-453 og MDA- MB-231 human brystkreftcellelinjer og en kommersielt tilgjengelig polyklonale antistoff mot Cdc37. Videre og tar hensyn til tidligere rapportert data som viser at mAb 4C5 hemmer kreft celle invasjon ved å forstyrre sammenslutning av ekstracellulært HSP90 med HER2 [28] og metalloproteinaser MMP2 og MMP9 [29] i dette arbeidet vi undersøke den mulige effekten av denne cellen ugjennomtrengelig anti-HSP90 antistoff på interaksjoner av overflate Cdc37 med HSP90 og ErbB-reseptorer.
Materialer og metoder
antistoffer og reagenser
MAb 4C5 ble produsert i vårt laboratorium, som tidligere beskrevet [ ,,,0],34]. I den foreliggende undersøkelse, ble mAb 4C5 anvendt som konsentrerte serum-fri supernatant i alle eksperimenter utført. Polyklonale antistoffer mot EGFR, ble HER-2 og monoklonalt antistoff mot Cyclin D1 oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). To anti-Cdc37 antistoffer, fra Santa Cruz Bioteknologi og Abcam erkjenner ulike epitoper ble brukt. Polyklonale antistoffer mot HSP90 var fra Chemicon International. DMEM, RPMI og føtalt bovint serum (FBS), var fra Invitrogen. Alle andre materialer var fra kilder som tidligere beskrevet [25].
Cellekulturer og immunofluoresence
HER-2-over-uttrykke MDA-MB-453, EGFR-over-uttrykke MDA-MB- 231 brystkreft cellelinjer og ikke cancerous epithelial bryst celler MCF-12A ble kjøpt fra American Type Culture Collection. MDA-MB-453 og MDA-MB-231-celler ble holdt i RPMI og DMEM, henholdsvis, supplert med 10% FBS. MCF-12A-celler ble opprettholdt i DMEM-HAM F12 supplert med 20 ng /ml human EGF, 100 ng /ml hydrokortison, 0,01 mg /ml bovint insulin og 10% FBS.
For immunfluorescens studier, ble cellene platet på poly-L-lysin-belagte dekkglass, i en tetthet på 5 x 10
4 celler /brønn i en 48-brønners plate og dyrket i passende medium supplert med 10% FBS. Etter 24 timer ble cellene flyttet til serumfritt medium i 18 timer. Lev MDA-MB-453, MDA-MB-231 og MCF-12A cellene ble merket ved indirekte immunfluorescens som tidligere rapportert [28]. Kort sagt ble ufikserte celler inkubert med 2 ug /ml anti-Cdc37-antistoff i 2 timer. Cellene ble deretter vasket, fiksert i iskald aceton og merket med Alexa488-konjugert sekundært antistoff.
Fremstilling av cellelysater, Western blot-analyse og Co-immunutfelling
Celler ble dyrket i 25- cm
2 kolber i dyrkningsmedium supplert med 10% FBS inntil sub-konfluens, forskjøvet i serumfritt medium i 24 timer og deretter eksponert for anti-Cdc37 og /eller mAb 4C5 i 16 timer. Kontrollkulturer ble dyrket enten i dyrkningsmedium alene eller i kulturmedium inneholdende 200 ug /ml av et IgG2a monoklonalt antistoff mot ikke-relaterte proteinet BM88 [35]. Overskudd av ikke-bundet antistoff ble deretter fjernet ved vasking med friskt medium. Kulturene ble umiddelbart vasket to ganger med iskald PBS og lysert som tidligere beskrevet [28].
Cellular fraksjonering ble utført i cellekulturer fremstilt og behandlet som beskrevet ovenfor, ved hjelp av compartment proteinekstraksjon kit (Chemicon), i henhold til produsentens instruksjoner.
Total og /eller compartment protein lysater ble kvantifisert, og like mengder av totalt protein ble underkastet SDS-PAGE, fulgt av Western blot med de aktuelle antistoffer. Immunoreaktive bånd ble påvist ved anvendelse av et ECL-kjemiluminescens-reagens (Amersham Biosciences) og X-Omat AR-film (Eastman Kodak Co.) som beskrevet av produsenten.
Co-immunoutfelling ble utført som tidligere beskrevet [25]. I korte, like mengder forhånds ryddet cellulære lysater ble inkubert med de aktuelle antistoffene i 18 timer ved 4 ° C. De immunkomplekser ble deretter inkubert i 2 timer ved romtemperatur med protein G-Sepharose og vasket tre ganger med lyseringsbuffer. Bundede proteiner ble analysert ved gel elektroforese etterfulgt av Western blot som beskrevet ovenfor. For alle immunoutfellingsstudier eksperimenter ble utført ved anvendelse av negative kontroller irrelevant IgG.
Antibody Assay Internalisering
Antistoff internalise eksperimenter ble utført som tidligere beskrevet [28]. I korthet ble cellene inkubert mens i kultur med 200 ug /ml anti-Cdc37-antistoff i 16 timer. Cellene ble deretter vasket og fiksert i kald aceton i 3 min. For påvisning av mulig internalisering av antistoff, ble cellene permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i PBS og deretter inkubert med Alexa488-konjugert sekundært antistoff (Molecular Probes). For alle forsøkene, ble kontroller utført ved hjelp av mAb 4C5 som er celle ugjennomtrengelig og den kommersielle anti-HSP90 som er internalisert [27].
RNA interferens
Plasmid pLL3.7 med innsetting målretting Cdc37 var brukt. Cdc37 ble slått ned ved hjelp av korte hårnål RNA. Til dette formålet «WI siRNA Selection Program» fra Whitehead Institute for Biomedical Research ble brukt, til å utforme og velge siRNA rettet mot Cdc37. For å skape en stilk-løkke struktur, ble et avstandsstykke (TTCAAGAGA) innsatt i sense- og antisense-sekvenser. DNA-oligomerer ble glødet og klonet inn i plasmidet pLL3.7. Innsettingen ble bekreftet ved sekvensering. MDA-MB 453 og MDA-MB 231-celler ble dyrket ved en tetthet på 70% og deretter transfektert med 3 ug plasmid-DNA med de innskutte sekvensene, eller ikke (kontroll), ved hjelp av Xfect Transfeksjon reagens fra Clontech, i henhold til produsentene protokoll. 72 timer etter transfeksjon, ble cellene samlet opp, lysert og utsatt for Western blot-analyse. For immunfluorescens deteksjon av Cdc37, ble cellene sådd ut på poly-L-lysin-belagte dekkglass og transfektert med plasmid-DNA som beskrevet ovenfor. 72 timer etter transfeksjon, ble levende celler vasket med PBS, inkubert med anti-Cdc37 antistoff i 2 timer, festes med iskald aceton og merket med Alexa647-sekundært antistoff.
Wound Healing motilitet Assay
analysen ble utført som tidligere beskrevet [28]. I korthet, ble MDA-MB-453 og MDA-MB-231-celler sådd ut i en 48-brønns plate ved en densitet på 1,5 x 10
5-celler /brønn og 5 x 10
4 celler /brønn, respektivt, og ble satt hen i 24 timer i serumholdig medium, uten ytterligere behandling. Mediet ble deretter skiftet til serumfritt, og 16 timer senere, et celle-fritt område ble dannet ved forsiktig skraping av cellemonolaget med en steril gul Gilson-pipette, noe som resulterer i dannelsen av et 1 mm bred celle -gratis området. Umiddelbart etter riper, ble mediet erstattet med friskt medium, eller i medium inneholdende det anti-Cdc37-antistoff. Kontrollkulturer ble dyrket enten i dyrkningsmedium alene eller i kulturmedium inneholdende 200 ug /ml av et IgG2a monoklonalt antistoff mot ikke-relaterte proteinet BM88 [35].
Migrering av brystkreftceller inne i gapet ble overvåket mikroskopisk hos gitte tidsintervaller, ved hjelp av et Leica DM IL invertert mikroskop, utstyrt med en LEICA DM300 videokamera koblet til en datamaskin. Inhibering av migrering ble beregnet ved å anskaffe og å analysere digitale bilder, ved bruk av Image Pro Plus software analyse [36] og evaluert med to forskjellige måter, avhengig av cellelinjen studert. Mer spesifikt for MDA-MB-453-celler ble uttrykt som prosentandelen av avstanden dekket av celler i kontrollkulturer, mens for de MDA-MB-231-celler ble uttrykt som prosentandelen av celler observert innenfor åpningen av såret i kontrollkulturer Statistiske analyser ble utført ved hjelp av Student
t
test.
Resultater
Cdc37 uttrykkes på celleoverflaten av MDA-MB-453 og MDA-MB-231 brystkreft celler
for å undersøke celleoverflaten lokalisering av Cdc37, ufiksert MDA-MB-453 og MDA-MB-231 humane brystcancerceller ble inkubert med anti-Cdc37-antistoff. Cellene ble deretter vasket, fiksert og merket med Alexa488-konjugert sekundært antistoff. Således det primære antistoff hadde tilgang bare til den ytre overflaten av cellen. Den observerte farging bekreftet celleoverflaten lokalisering av Cdc37 i både humane brystcancercellelinjer undersøkt (Fig. 1). Som positiv kontroll mAb 4C5 som spesifikt binder seg til overflaten HSP90 hvis nærvær har tidligere vært vist i begge cellelinjer [28] [26] ble anvendt. På dette punktet er det av interesse å merke seg at immunofluorescence Forsøkene viste, som forventet, fravær ikke bare av Cdc37 men også av HSP90 på overflaten av voksne ikke cancerous MCF-12A-celler (fig. S1). Andre positive kontroller ble brukt, ved hjelp av antistoffer mot HER-2 og EGFR for MDA-MB-453 og MDA-MB-231 celler, henholdsvis. Endelig antistoffer mot EGFR og HER2 ble anvendt som negative kontroller i MDA-MB-453 og MDA-MB-231-celler, henholdsvis (fig. 1A og B). De ovennevnte resultater ble bekreftet ved Western blot ved anvendelse av membranfraksjoner utledet fra de to cellelinjer (Fig. 1C og D). (1D Fig.) Antistoffer som positiv kontroll anti-HER2 (fig. 1C) og anti-EGFR ble anvendt, i MDA-MB-453 og MDA-MB-231-membran cellelysater, respektivt. I de cytosoliske fraksjoner og som forventet anti-Cdc37 ga positiv farging mens antistoffer mot ErbB-reseptorer var negative. Videre er de cytosoliske fraksjoner av begge cellelinjer ga positiv farging når immunobloted med antistoff mot det intracellulære protein Cyclin D1, mens membranfraksjoner var negative (fig. 1C og D), noe som bekrefter renheten av fraksjonene som brukes her og i immunoprecipitaion eksperimentene beskrevet nedenfor.
En, Indirekte immunfluorescens av levende MDA-MB 453 celler ved hjelp av anti-Cdc37 antistoff. Den immunolabeling avslører overflaten lokalisering av Cdc37. Anti-HER2 og mAb 4C5 ble anvendt som positive kontroller. Anti -EGFR antistoff ble anvendt som negativ kontroll. B, Indirekte immunfluorescens av levende MDA-MB 231 celler ved hjelp av anti-Cdc37 antistoff. Anti-EGFR og mAb 4C5 ble anvendt som positive kontroller. Anti -HER2-antistoffer ble anvendt som negativ kontroll. C, Cell fractionization av MDA-MB-453-celler, etterfulgt av Western blot-analyse bekreftet tilstedeværelsen av Cdc37 i cellemembranfraksjoner. Anti-HER2-antistoffer ble anvendt som positive og negative kontroller i membranen og cytosoliske fraksjoner hhv. D, Cell fractionization av MDA-MB-231-celler, etterfulgt av western blot-analyse bekreftet tilstedeværelsen av Cdc37 på cellemembranfraksjoner. Anti-EGFR-antistoffer ble anvendt som positive og negative kontroller i membranen og cytosoliske fraksjoner hhv. I C og D antistoff mot det intracellulære protein Cyclin D1 ga positiv og negativ farging i de cytosoliske og membranfraksjoner fra begge cellelinjer, henholdsvis. CF, cytosoliske fraksjon; MF, membranfraksjon. Scale bar = 20 mikrometer.
For å bekrefte spesifisiteten av kommersielle anti-Cdc37 antistoff som brukes i våre studier, ble siRNA teknologien anvendt. Mer spesifikt, når MDA-MB-453 og MDA-MB-231cells transfektert med siRNA målretting Cdc37 ble immunfarget som beskrevet ovenfor med den anti-Cdc37-antistoff, ble det observert en svært svak merking sammenlignet med celler transfekterte med kontroll-vektor (fig. 2 A og B). Likeledes da ble utført western blot-analyse ved å bruke anti-Cdc37-antistoff i totale cellelysater avledet fra de ovennevnte celler, en betydelig redusert immunfarging ble oppnådd i lysatene av transfektert med siRNA rettet mot Cdc37 i forhold til contols (fig. 2C og D ).
A, B, immunfluorescens med levende MDA-MB 453 og MDA-MB henholdsvis 231-celler, ved anvendelse av anti-Cdc37-antistoff. Cellene ble transfektert med siRNA rettet mot Cdc37 (shRNA Cdc37) eller med plasmid DNA uten innsetting (kontroll). ShRNA Cdc37 transfekterte celler utviser ekstremt lave nivåer av overflate immunofluorescens flekker, sammenlignet med kontrollene. Scale bar = 20 mikrometer. C, D, Western blot-analyse av totale cellelysater avledet fra MDA-MB-453 og MDA-MB henholdsvis 231-celler, ved hjelp av anti-Cdc37-antistoff, i celler transfektert med siRNA målretting Cdc37 og kontrollcellene. Nivået av Cdc37 detekteres er betydelig lavere i begge cellelinjene transfektert med siRNA målretting Cdc37, sammenlignet med kontrolltransfeksjoner.
den anti-Cdc37-antistoff er celle-ugjennomtrengelig
Cellen ugjennomtrengelige natur av anti-Cdc37 som ble benyttet ble undersøkt ved inkubering av MDA-MB-453 og MDA-MB-231-celler, mens i kultur med antistoffet i 16 timer. Cellene ble deretter grundig vasket, og binding av antistoffet ble analysert etter fiksering og celle permeabiliseringen, ved hjelp av en Alexa488-konjugert sekundært antistoff. Vi har observert at det for begge cellelinjer anti-Cdc37-antistoff ble ikke internalisert og forble bundet på celleoverflaten (fig. 3). MAb 4C5 og det polyklonale anti-HSP90 som tidligere er blitt vist å forbli på overflaten og bli internalisert henholdsvis [27], ble anvendt som kontroller (fig. 3). Det bør bemerkes at når de ovenfor nevnte celler ble inkubert med kulturmedium alene som en negativ kontroll ble ingen immunofarging erholdt (data ikke vist).
Anti-Cdc37-antistoff internalisering ble undersøkt både i MDA-MB 453 og MDA-MB 231 celler. Levende celler fra de to cellelinjene ble dyrket på dekkglass og inkubert ved 37 ° C i 16 timer med anti-Cdc37. MAb 4C5 og anti-HSP90 ble anvendt som positive og negative kontroller respektivt. For påvisning av antistoff internalisering ble cellene fiksert og permeabilisert som beskrevet i materialer og metoder, og antistoffer ble påvist ved konfokal mikroskopi ved anvendelse av en Alexa 488 sekundært antistoff. Ingen internalisering av den anti-Cdc37-antistoff ble observert selv i begge cellelinjer. Scale bar = 20 mikrometer.
Surface Cdc37 er involvert i brystkreft cellemotilitet
Etter å ha fastslått at anti-Cdc37 antistoff ikke er internalisert, men i stedet forblir spesifikt bundet til celle- overflaten når inkubert med levende MDA-MB-453 og MDA-MB-231-celler, vi neste undersøkte mulig involvering av Cdc37 overflate på motiliteten av disse brystkreftceller, ved hjelp av sårheling analysen. Kontrollkulturer ble dyrket enten i dyrkningsmedium alene eller i kulturmedium inneholdende 200 ug /ml av et antistoff mot ikke-relaterte proteinet BM88 [35]. Det er viktig å merke seg at ble ikke observert noen statistisk signifikant forskjell mellom de to typer av kontroller som brukes. Styreverdien som er vist er middelverdien av de to typer av kontroll. Som vist på fig. 4A, og fig. 5A nærvær av anti-Cdc37-antistoff i kulturmediet av både MDA-MB-453 og MDA-MB-231-celler, førte til en signifikant langsommere for sårheling, sammenlignet med kontrollkulturer dyrket i dyrkningsmedium alene. Nærmere bestemt ble en 57,7% og 35,8% hemning av kreftcelle motilitet ble oppnådd når 200 ug /ml anti-Cdc37 ble inkludert i dyrkningsmediet av henholdsvis MDA-MB-453 og MDA-MB-231-celler (fig. 4C og 5C). Trypanblått-farving utført ved sluttpunktet for sårheling analysen, viste at dødsraten av celler behandlet med antistoffet var lik den som er observert i kontrollkulturene for begge cellelinjer (fig. 4B og 5B). Dette resultatet støtter videre at den nedsatte cellemotilitet observert i nærvær av anti-Cdc37-antistoff som ikke er internalisert ikke er forårsaket av celledød, men i stedet ved inhibering av overflaten pool av Cdc37. På dette punkt er det viktig å merke seg at i denne analysen, blir effekten av anti-Cdc37 antistoff rettet mot celleinvasjon og ikke mot celleproliferasjon, siden svært lav ( 7%) BrdU-inkorporering ble observert i både human brystkreft cellekulturer behandlet som ovenfor med ingen åpenbare forskjeller mellom de forskjellige eksperimentelle betingelser (data ikke vist).
A, sårheling analysen. Bilder oppnådd ved 0 timer og 24 timer etter scratch formasjon. Celler ble la til å migrere i kontrollbetingelsene eller i nærvær av 200 ug /ml anti-Cdc37-antistoff. B, Ved enden av tidspunktet cellene ble farget med trypanblått. Ingen signifikant celledød er observert i begge tilfeller. C, Kvantitative effekten av Cdc37 i celle migrasjon. Tilsetningen av 200 ug /ml anti-Cdc37-antistoff i cellekulturmediet resulterte i en 57,7% inhibering av sårheling sammenlignet med kontrollen som ble ansett som 100% lukking av sår (P 0,005). Kolonne er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± SE. Innenfor et enkelt eksperiment hver tilstand ble testet i triplikat. Skala barer A = 165 mikrometer, B = 80 mikrometer.
En, sårheling analysen. Bilder oppnådd ved 0 timer og 24 timer etter scratch formasjon. Celler ble la til å migrere i kontrollforhold som beskrevet i Materialer og Metoder, eller i nærvær av 200 ug /ml anti-Cdc37-antistoff. B, Ved enden av tidspunktet cellene ble farget med trypanblått. Ingen signifikant celledød er observert i begge tilfeller. C, Kvantitative effekten av Cdc37 i celle migrasjon. Tilsetningen av 200 ug /ml anti-Cdc37-antistoff i cellekulturmediet resulterte i 35,8% inhibering av celler som invaderer gapet når sammenlignet med kontrollen som ble ansett som 100% lukking av sår (P 0,005). Kolonne er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± SE. Innenfor et enkelt eksperiment hver tilstand ble testet i triplikat. Skala barer A = 165 mikrometer, B = 80 mikrometer.
Surface Cdc37 samhandler med HSP90 i begge brystkreftcellelinjer og med HER-2 og EGFR i MDA-MB-453 og MDA-MB- 231cells henholdsvis
Tatt i betraktning den ovenfor vist involvering av overflaten Cdc37 i kreftcelleinvasjons prosesser vi neste undersøkt mulige interaksjoner av dette molekylet med HSP90 og ErbB kinase reseptorer. For dette formål utførte vi co-immunoutfellingsstudier forsøk under anvendelse av membranfraksjoner avledet fra MDA-MB-453 og MDA-MB-231 celler dyrket i enten kontrollmedium som nevnt i materialer og metoder, eller i nærvær av 200 ug /ml anti- Cdc37-antistoff i 16 timer og immunopresipitert med anti-Cdc37-antistoff. Western blot-analyse ved bruk av henholdsvis anti-HSP90, anti-HER2 og anti-EGFR-antistoffer, viste at anti-Cdc37 antistoff som spesifikt forstyrrer overflaten interaksjonen av Cdc37 med HSP90, og begge reseptorer i de to cellelinjene undersøkt (Fig. 6A) siden en redusert mengde av disse molekylene ble observert i de behandlede kulturer sammenlignet med kontrollene. På dette punkt er det viktig å merke seg at den observerte avbrudd bekrefter celleoverflaten lokaliseringen av de molekylære interaksjoner undersøkt, siden slik det er vist ovenfor, er den anti-Cdc37-antistoff ikke internalisert og forblir bundet til celleoverflaten når inkludert i dyrkningsmediet.
A, ble Membran proteinfraksjoner fra MDA-MB 453 og MDA-MB 231 celler (kontroll) immunoprecipitaded med anti-Cdc37 antistoff. Analyse av bundne proteiner ved Western blot med anti HSP90 antistoffer og anti-HER-2 og anti -EGFR antistoffer henholdsvis, avslørte at Cdc37 samvirker ikke bare med HSP90, men også med begge ErbB-reseptorene ble studert. Nærvær av 200 ug /ml av celle ugjennomtrengelig anti-Cdc37 i 16 timer i dyrkningsmediet fra de to cellelinjene, etterfulgt av immunoutfelling og Western blot-analyse som ovenfor viste at anti-Cdc37-antistoff forstyrrer assosiasjon av Cdc37 med HSP90 og ErbB-reseptorer i de to cellelinjene. B, MDA-MB 453 og MDA-MB 231-cellene ble behandlet eller ikke med 200 ug /ml mAb 4C5 i 16 timer. Membranproteinfraksjoner avledet fra disse kulturene ble immunoprecipitaded med anti-Cdc37 etterfulgt av Western blot-analyse ved anvendelse av anti-HER2 henholdsvis og anti-EGFR-antistoffer anti-HSP90 og. C, Membran proteinfraksjoner fra MDA-MB-231 celler dyrket i fravær eller nærvær av 200 ug /ml mAb 4C5 i 16 timer ble immunopresipitert med anti-EGFR-antistoff. Analyse av bundne proteiner ved western blot med anti-HSP90 antistoff viste at overflaten HSP90 samhandler med EGFR og at dette samspillet er forstyrret av mAb 4C5. Irrelevante IgG tjente som negativ kontroll for alle de ovennevnte eksperimenter. D, Densitometry kvantifisering av de observerte reduserte interaksjonene i nærvær av anti-Cdc37 i kulturmediet av MDA-MB 453 og MDA-MB-231-celler resulterte i en nedgang med HSP90 33% og 59% og HER-2 henholdsvis med hensyn til MDA -MB 453-celler og i en nedgang med HSP90 og EGFR henholdsvis angående MDA-MB-231-celler 56% og 47%. Tilstedeværelse av mAb 4C5 i kulturmediet av MDA-MB 453 og MDA-MB-231-celler resulterte i en nedgang med HSP90 og 60% og 58% HER-2 henholdsvis angående MDA-MB-453-celler og i en 88% og 70% avta med HSP90 og EGFR henholdsvis vedrørende MDA-MB 231 celler.
MAb 4C5 forstyrrer spesielt overflaten samspill av Cdc37 med HSP90 og ErbB reseptorene
Etter å ha fastslått at på samme måte som sin intracellulær motstykke, overflate Cdc37 er fysisk forbundet med overflate HSP90, ved forsøkte vi å undersøke effekten av funksjonsblokkerende anti-HSP90 monoklonalt antistoff, mAb 4C5, i denne interaksjonen. For dette formål, ble membranfraksjoner avledet fra MDA-MB-453 og MDA-MB-231 kulturer som ble behandlet med 200 ug /ml mAb 4C5 i 16 timer immunoutfelt med de anti-Cdc37-antistoff. Western blot-analyse ved å bruke anti HSP90 viste at mAb 4C5 spesifikt forstyrrer overflaten interaksjonen av Cdc37 med HSP90 i begge kreftcellelinjer som brukes (fig. 6B). Mer spesifikt anti-Cdc37 antistoff co-immunopresipitert lavere nivåer av HSP90 i mAb 4C5 behandlede kulturer sammenlignet med kontrollene.
Vi har tidligere vist ved hjelp av mAb 4C5 at overflaten HSP90 spesielt samhandler med ekstracellulære domenet av HER -2 i MDA-MB-453-celler [28] .I den foreliggende arbeid, og for å ytterligere undersøke virkningsmåte av overflate Cdc37 i de to cellelinjene som er undersøkt, var det nødvendig først å undersøke den mulige interaksjon av overflaten bassenget av HSP90 med EGFR. For dette formål membranfraksjoner avledet fra MDA-MB-231 kulturer behandlet i fravær eller i nærvær av 200 ug /ml mAb 4C5 i 16 timer, ble immunpresipitert med anti HSP90-antistoff og immunoblottet med anti-EGFR. Som vist på fig. 6C EGFR samhandler spesielt med HSP90. Den observerte reduksjon i nærvær av cellen ugjennomtrengelige mAb 4C5 indikerer celleoverflaten lokalisering av denne interaksjonen Etter å ha vist foreningen av overflate HSP90 og EGFR og i tillegg at Cdc37 samvirker ikke bare med HSP90, men også med HER2 og EGFR vi neste søkt å undersøke mulig effekt av mAb 4C5 på co-anstand interaksjon med ErbB reseptorer. Følgelig membranfraksjon avledet fra MDA-MB-453 og MDA-MB-231 kulturer behandlet eller ikke med 200 ug /ml mAb 4C5 i 16 timer ble immunoutfelt med de anti-Cdc37-antistoff. Western blot-analyse ved anvendelse av anti-HER2 og anti-EGFR-antistoffer henholdsvis, viste at mAb 4C5 forstyrrer spesifikt overflate interaksjonen av Cdc37 med begge reseptormolekyler fordi lavere nivåer av ErbB-reseptorer ble observert i de mAb 4C5 behandlede kulturer (fig. 6B).
diskusjon
i det foreliggende arbeid viser vi at det ko-anstand Cdc37 er lokalisert på overflaten av MDA-MB-453 og MDA-MB-231 brystkreftceller, hvor det er behov for motiliteten av disse cellene, og på samme måte som dens intracellulære motstykke den vekselvirker spesifikt med molekyl anstand HSP90. Videre våre funn viser at denne overflaten pool av Cdc37 samhandler direkte med medlemmer av ErbB familien av vekstfaktorreseptorer muligens opptrer som en co-faktor i HSP90 ekstracellulære chaperoning aktiviteter involvert i kreftcelle invasjon prosesser og at anti-HSP90 antistoff mAb 4C5 forstyrrer disse interaksjoner.
Cell overflaten lokalisering av Cdc37 ble demonstrert av både immunocytochemistry på live MDA-MB-453 og MDA-MB-231 brystkreftceller og western blot ved hjelp av membranfraksjonen lysates avledet fra disse cellelinjene.
inhiberingen av MDA-MB-453 og MDA-MB-231 brystkreftcelle motilitet, av den anti-Cdc37-antistoff ble vist ved hjelp av sårtilheling analysen. Nærvær av dette antistoffet i kulturmediet betydelig redusert motilitet frekvensen av begge cellelinjer som ble studert. På dette punktet er det interessant å merke seg at når anti-HSP90 antistoff mAb 4C5 og anti-Cdc37 antistoff ble inkludert enten separat eller kombinert i kulturmediet av de ovennevnte cellene ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert i såret nedleggelser.
