Abstract
Den co-hemmende reseptor programmert død-en (PD-1) curtails immunresponser og hindre autoimmunitet, men svulster utnytte denne veien å flykte fra immun ødeleggelse. Den co-stimulerende reseptor OX40 oppregulert på T-celler etter aktivering og øker deres klonal ekspansjon, overlevelse og cytokin produksjon når engasjert. Selv antagonistisk anti-PD-1 eller agonistiske anti-OX40 antistoffer kan fremme avvisningen av flere murine svulster, noen dårlig immunogene svulster var refraktære til denne behandlingen. I denne studien, vurderte vi antitumor effekter og mekanismer for kombi PD-en blokade og OX40 utløser i en murine ID8 eggstokkreft modell. Selv om individuelle anti-PD-1 eller OX40 mAb behandling var ineffektiv i tumor beskyttelse mot 10-dagers etablert ID8 tumor, kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb behandling markert inhibert tumorutvekst med 60% av musene tumorfri i 90 dager etter tumorinokulasjon . Tumor beskyttelse var assosiert med en systemisk immunrespons med hukommelse og antigenspesifisitet og krevde CD4
+ celler, og CD8
+ T-celler. Den anti-PD-1 /OX40 mAb behandling økt CD4
+ og CD8
+ celler og redusert immundempende CD4
+ foxp3
+ regulatoriske T (treg) celler og CD11b
+ Gr- 1
+ myeloide suppressor celler (MDSC), som gir opphav til betydelig høyere forholdstall på både effektor CD4
+ og CD8
+ celler til treg og MDSC i bukhulen; Kvantitative RT-PCR-data ytterligere demonstrert induksjon av en lokal immunstimulerende miljø ved hjelp av anti-PD-1 /OX40 mAb behandling. Miltens CD8
+ T-celler fra kombineres mAb-behandlede mus produserte høye nivåer av IFN-γ ved tumor antigen stimulering og oppviste antigen-spesifikk cytolytisk aktivitet. Så vidt vi vet, er dette den første studien teste antitumoreffekten av anti-PD-1 /OX40 mAb i en murine eggstokkreft modell, og våre resultater gir en begrunnelse for kliniske studier som evaluerte eggstokkreft immunterapi ved bruk av denne kombinasjonen av mAb.
Citation: Guo Z, Wang X, Cheng D, Xia Z, Luan M, Zhang S (2014) PD-1-blokkaden og OX40 Utløsende synergi Beskytter mot tumorvekst i en murine modell av eggstokkreft. PLoS ONE 9 (2): e89350. doi: 10,1371 /journal.pone.0089350
Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie Universitetet Graduate School of Medicine, Japan
mottatt: 10 november 2013; Godkjent: 20 januar 2014; Publisert: 27 februar 2014
Copyright: © 2014 Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Free forskerprosjekt av Shengjing Hospital (No.200806). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Bakgrunn
ovarialcancer (OC) er den mest dødelige kreftformen hos kvinner, med 22,280 nye tilfeller og 15,460 dødsfall anslått i USA for 2012 [1]. Den høye frekvensen av dødelighet fra OC er først og fremst på grunn av avansert stadium av sykdommen ved diagnose. Tidlig stadium kreft kan bli kurert på opptil 90% av pasienter med dagens behandling [2], men denne prisen faller vesentlig ved avansert sykdom med ca 30% av pasienter med avansert stadium OC overleve 5 år etter første diagnosen [3]. Standard behandling for eggstokkreft er kirurgisk debulking etterfulgt av platina-taxan basert kjemoterapi [4]. Selv om de fleste pasienter er lydhør overfor kjemoterapi i starten, vil de fleste av dem til slutt har et tilbakefall og dø av sykdommen. Derfor er nye strategier sterkt behov for å forbedre resultatene av eggstokkreft.
Samler bevis tyder på at immunterapi bør være effektiv for OC behandling [5]. For det første, OC-celler uttrykker mange tumorassosierte antigener mot hvilke spesifikke immunresponser er blitt oppdaget [6] – [10]. Dernest studiene utviklet av Coukos og kolleger indikere svulst immunrespons er en kritisk faktor for kliniske utfall av pasienter med OC støttes av nær sammenheng mellom overlevelse av disse pasientene og tumorinfiltrasjon med CD3
+ T-celler i det store kommentert klinisk prøvene [11]. For det tredje, selv om OC er en ødeleggende sykdom, metastaser er ofte begrenset til bukhulen, hvor svulsten mikromiljøet er direkte tilgjengelig, noe som unngår behovet for systemisk levering av immunstimulerende behandlinger [12]. Til tross for rikelig bevis som støtter OC immunterapi, har klinisk suksess med immun-basert terapi for OC generelt vært beskjeden [13].
programmert død 1 (PD-1) protein er en viktig coinhibitory reseptoren på T-celler med en struktur lik den til CTLA-4, men med en tydelig biologisk funksjon og spesifisitet ligand [14]. PD-1 fungerer primært i perifert vev, hvor T-celler kan støte på det immunsuppressive PD-1 ligander PD-L1 (B7-H1) og PD-L2 (B7-DC), som uttrykkes av tumorceller, stromaceller, eller begge deler [15], [16]. Blokkering av interaksjonen mellom PD-1 og PD-L1 forsterker T-celle immunresponser in vitro og medierer preclinical antitumoraktivitet [16] – [18]. PD-L1 er den primære PD-1 ligand som er oppregulert i solide svulster, hvor det kan inhibere cytokinproduksjon og den cytolytiske aktiviteten til PD-1
+ tumor-infiltrerende CD4
+ og CD8
+ T-celler [14], [19]. Disse funksjonene gjør PD-1 /PD-L1 pathway en lovende intervensjon mål for svulst immunterapi, som er godkjent av det nylig rapportert resultater fra to kliniske studier som viser mAb’er spesifikke for PD-1 og PD-L1 utløse en imponerende antitumor effekt i ikke- småcellet lungekreft, melanom og nyrecellekreft med fullstendig regresjon oppnådd hos noen pasienter [20] – [22]
OX40 (aka CD137) er et kostimulerende molekyl som hører til TNF-reseptorfamilien uttrykt primært på. aktivert effektor T (T eff) celler og naive regulatoriske T-celler [23]. Ligering av OX40, først og fremst på CD4
+ T-celler, aktiverer NF-kB veien og opp-regulerer antiapoptotic molekyler av Bcl-2-familien, fører til T-celle klonal ekspansjon, aktivering, hukommelse, og cytokinproduksjon [24] – [26]. OX40 engasjement på CD4
+ foxp3
+ Treg celler fører til utvidelse, deaktivering, eller celledød avhengig av lokalmiljøet [27] – [30]. Gitt at OX40 utløser kan potent stimulere T-celler og potensielt blokkere /eliminere regulatoriske T-celler, har OX40 agonister blitt undersøkt i flere prekliniske tumormodeller [31] – [34] og et anti-humant OX40 monoklonalt antistoff blir for tiden evaluert i kliniske forsøk (klinisk utprøving registreringsnumre NCT01303705, NCT01416844, NCT01862900, NCT01644968 og NCT01642290).
Selv om antagonist PD-1 eller agonistiske OX40 antistoffer kan fremme avvisning av noen muse svulster, men dårlig immunogene svulster som ID8 eggstokkreft ikke svare på antistoffer alene [35]. Vi antok at kombinert PD-en blokade og OX40 aktivering vil fremme antitumor immunitet. Her, ved hjelp av ID8 murine eggstokkreft modell, viser vi at kombinerte anti-PD-1 /OX40 mAb behandling undertrykte betydelig 10 dager etablert peritoneal ID8 tumorvekst, noe som resulterer i 60% av behandlede mus tumorfri i 90 dager etter tumorinjeksjon. Nærmere undersøkelser viste at kombinerte anti-PD-1 /OX40 mAb tydelig økte effektor-T-celler og dempes de immunsuppressive cellene i tumor områder med induksjonen av systemisk antigen-spesifikke CTL-respons.
Methods
Mus
Kvinne C57BL (6-8 wk gamle) ble kjøpt fra Animal Experimental Center of China Medical University. Animal bruken ble godkjent av Institutional Review Board of China Medical University
Cell Culture
ID8, en klone av MOSEC ovarialcancer av C57BL /6 opprinnelse var en gave fra Dr. George Coukos ( university of Pennsylvania, Philadelphia, USA) [36]. Murine B16 melanomceller, TC1 lungekreft og T-celle lymfom EL4-celler ble anskaffet fra ATCC (Manassas, VA). Tumorceller ble dyrket i komplett DMEM-medium supplert med 10% FBS (Thermo Scientific, Rockford, IL), ble 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin før cellesuspensjoner fremstilt og transplantert til mus. De EL4 celler og splenocytter ble opprettholdt i et fullstendig medium RPMI-1640 supplert med 10% FBS, 25 mM HEPES, 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.
Monoclonal Antibodies ( mAbs)
Terapeutisk anti-OX40 (Clone OX-86, Catalog #: BE0031), anti-PD-1 (Clone RMT3-23; Catalog # BE0115), anti-CD4 (Clone GK1.5; Catalog #: BE0003-1), anti-CD8 (Clone 2,43; Catalog #: BE0061), anti-NK1.1 (Clone PK136, Catalog #: BE0036) og kontroll rotte IgG2a mAb (Clone 2A3, Catalog #: BE0089) ble kjøpt fra BioXcell (West Lebanon, NH). Antistoffer brukes for flowcytometri ble kjøpt fra Tianjing Sungene (Tianjing, Kina) og eBioscience (San Diego, California).
Dyreforsøk
Mus (5 eller 10 mus /gruppe) ble injisert intraperitonealt (ip) med 1 x 10
6 ID8-celler i 0,1 ml PBS. På dagene 10, 14 og 18 etter tumor-inokulering, hver mus fikk i.p. injeksjon av 200 ug av kontroll, anti-PD-1, anti-OX40 eller anti-PD-1 /OX40 mAb i 200 ul PBS. Musene ble veid to ganger ukentlig og sjekket daglig for kliniske tegn på hovne magene som indikerer ascites dannelse og for tegn på toksisitet som åndenød, mobilitet, vekttap, diaré, krum holdning, og unnlatelse av å spise mens histopatologi ble utført på viktige organer (dvs. lever, nyre, tarm, lunger, og tykktarm). Etter institusjonelle retningslinjer, ble musene drept da de utviklet ascites og hadde en vektøkning 30%. De peritoneal tumormasser ble samlet og veid, ble overlevelsen av hver mus registrert og total overlevelse ble beregnet.
For immun minne evaluering, sammenslått (2 uavhengig eksperiment) 12 langsiktige overlevende mus (90 dager etter første svulst injeksjon) fra kombinert anti-PD-1 /OX40 terapigruppe eller alders matchet naive mus (som fungerte som kontroll) ble utfordret ip eller subkutant (subkutant) med 1 × 10
6 ID8 celler eller 1 × 10
6 syngene men antigenically forskjellige TC1 celler. Tre vinkeldiameter på subkutant Tumorene ble målt hver andre dag ved hjelp av et skyvelære, og tumorvolumene ble beregnet i henhold til formelen: 1/2-x (lengde) x (bredde)
2. Mus ble avlivet da de syntes døende eller deres tumorer nådde 10 mm i diameter. Overlevelsen av hver mus ble registrert og total overlevelse ble beregnet.
For uttømming av lymfocytter undergrupper, mus ble injisert intraperitonealt med 500 ug av mAb mot CD8, CD4, eller NK1.1, en dag før og to dager etter tumor-felling, fulgt av injeksjon av 200 ug hver 5 dager gjennom hele eksperimentet. Effekten av celleutarming ble verifisert ved farging perifere blodleukocytter for spesifikke undergrupper etter uttømming (data ikke vist).
Evaluering av peritoneale immunceller (PIC)
Mus som hadde fått transplantert i.p. med ID8 celler ble avlivet 7 dager etter at de hadde blitt behandlet med kontroll, enkelt eller i kombinasjon mAb kombinasjon rives som i dyreforsøk. For å oppnå PIC, 3 ml PBS ble injisert i bukhulen til mus med ID8 tumorer umiddelbart etter avliving, deres mage ble massert og væsken ble fjernet, filtrert gjennom en 70 uM cellefilter (BD Biosciences), vasket og immunceller ble isolert ved å bruke en mus lymfocyttisolasjonsmetoder buffer (Cedarlane, Burlington, Ontario) etter produsentens anvisninger og de fleste av resulterende celler ( 95%). var CD45-postive immunceller som bekreftes av flowcytometrisk analyse (figur S1)
strømningscytometrisk farging, ble enkeltcellesuspensjoner av PIC vasket med FACS-farging-buffer og inkubert med mus Fc-reseptorbinding inhibitor (eBioscience) i 10 minutter før farging med mAb (Tianjing Sungene) mot mus CD45 (klon 30-F11), CD3 (klon 145-2C11), CD4 (klone GK1.5), CD8 (klon 53 til 6,7), CD19 (klon eBio1D3), CD11b (klone M1 /70) og Gr-1 (klone RB6-8C5), CD44 ( klon 1M7) og CD62L (klon MEL-14) i 30 minutter. For intracellulær farging av foxp3 (klone FJK-16 s, eBioscience) ble cellene fiksert, permeabilized og farget etter instruksjon av Cytofix /Cytoperm kit (BD Biovitenskap). Flowcytometri ble utført ved hjelp FACSCalibur (BD Biosciences) og befolkningen i immunceller ble valgt av gating CD45-positive celler. Dataene ble analysert ved hjelp av Flow Jo programvare (Tre Star, Ashland, Oregon). All flowcytometri eksperimenter ble utført minst 3 ganger.
Kvantitativ RT-PCR
Total cellulær RNA ble ekstrahert ved hjelp RNeasy Mini Kits (Qiagen, Hilden, GA) og revers transkribert til cDNA ved hjelp av Super III revers transkriptase (Invitrogen). Uttrykk for gener av interesse ble analysert i PIC på dag 7 etter den tredje injeksjon av mAb. De primere for alle gener testet, herunder internkontroll GAPDH, ble syntetisert av Invitrogen, Shanghai, Kina. Primer sekvenser var som follows:GAPDH:For:5′-GTGGAGATTGTTGCCATCAACG-3′,Rev:5′-CAGTGGATGCAGGGATGATGTTCTG-3′;T-bet:For:5′-CGGTACCAGAGCGGCAAGT-3′, Rev: 5′-AGCCCCCTTGTTGTTGGTG-3 «; Foxp3: For: 5»-CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG-3 «, Rev: 5′-CATTTGCCAGCAGTGGGTAG-3′; IFN-γ: For: 5»-AAAAACCTAAAAAATCTAAATAACT-3 «, Rev: 5′-ATCAACAACAACTCCTTTTCCACTT-3′; IL-10: For: 5»-CTCTTACTGACTGGCATGAGG-3 «, Rev: 5′-CCTTGTAGACACCTTGGTCTTGGAG-3». Kvantitativ real-time PCR ble utført via ABI PRISM 7500 Real-Time PCR systerm (Applied Biosystems) med en × SYBR Grønn Universal PCR Mastermix (Takara). Transkripsjonsnivåer ble beregnet i henhold til den 2-ΔΔCt metode, normalisert til ekspresjon av GAPDH, og uttrykt som gangers endring i forhold til kontrollen.
Analyse av IFN-γ og IL-10-produksjon av PIC
Mus injisert ip med 1 × 10
6 ID8 celler 10 dag tidligere ble injisert tre ganger på 4 dager intervall med 200 mikrogram av kontroll eller anti-PD-1 /OX40 mAb. Syv dager etter den siste injeksjonen mAb, sammenslått PIC (2 x 10
6 /brønn) høstes fra behandlede mus ble deretter stimulert med 50 ng /ml PMA og 1 ug /ml ionomycin i 6 timer før analyse av IL- 10 og IFN-γ sekresjon i kultursupernatantene ved Mouse IFN-γ /IL-10 Quantikine ELISA Kit i henhold til bruksanvisningen. (R alt fra GenScript, Nanjing, CA) i 3 dager. IFN-γ i supernatantene ble bestemt ved mus IFN-γ Quantikine ELISA-sett (R 0,05
Resultater
Kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb induserte behandlingen en synergistisk antitumor effekt i ID8 tumorbærende mus
evaluerte effekten av antitumor enkelt eller kombinert anti-PD-1 og anti-OX40 mAb i C57BL /6 mus transplantert ip 10 dager tidligere med 1 × 10
6 ID8 celler. Ubehandlede mus og mus behandlet med en kontroll mAb utviklet ascites ca 30 dager etter tumorinokulasjon og måtte ofres som beskrevet tidligere [38]. Som vist i figur 1A, enten enkelt mAb hadde liten effekt på veksten av 10 dager etablerte tumor ID8 fører til ascites dannelse på nesten samme tid som ubehandlede eller kontroll-mAb-behandlede mus; Men kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb behandling betydelig økt total overlevelse av mus med 60% (6 av 10 mus) av mus tumor gratis (bekreftet av laparotomi) 90 dager etter tumorinjeksjon (p 0,001, kombinert mAb sammen til én eller kontroll-mAb), og til og med mus bukket under for tumor-vekst også hadde betydelig forlenget midlere overlevelsestid (MST) sammenlignet med kontroll eller enkelt mAb-behandlede mus (figur 1B; MST 30,90, 34,00, 75,75 34.00and dager for kontroll, anti- PD-1, anti-OX40 og anti-PD-1 /OX40 gruppe; p 0,001, kombinert mAb sammenlignet med enkel eller kontroll mAb). Vekten av tumormasser fra mus behandlet med kombinert mAb også sterkt redusert sammenlignet med den fra styre eller enkelt mAb-behandlede mus (figur 1C). En gjentagelse av forsøket ga lignende resultater (data ikke vist). I disse dyreforsøk, har vi ikke observere noen åpenbar toksisitet, f.eks vekt eller håravfall hos mus som fikk én eller kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb. I tillegg har vi også ikke oppdage noen ekspresjon av PD-1 og OX40 molekyler og deres respektive ligander PD-L1 /PD-L2 og OX40L på overflaten av ID8 eggstokkkreftceller (data ikke vist), med unntak av muligheten for at inhibering av ID8 tumorvekst
in vivo
er direkte formidlet av anti-PD-1 eller anti-OX40 mAb.
En, mus (10 mus per gruppe) transplantert ip med 1 × 10
6 ID8 celler 10 dagen før ble behandlet tre ganger med 200 mikrogram av kontroll, anti-PD-1, anti-OX40 og anti-PD-1 /OX40 mAb på 4 dager intervall og total overlevelse av mus var innspilt. B, Gjennomsnittlig overlevelsestid for mus med tumorvekst ble beregnet. C, De peritoneale tumormasser ble veiet når mus ble avlivet med hver prikk representerer hver mus. D, Langsiktig overlevende (90 dager etter første svulst utfordring) mus (4 mus per gruppe) fra to mAb behandlingsgruppen ble gjenopptatt bruk ID8 celler gitt ip eller subkutant eller med syngene urelaterte TC1 celler transplantert subkutant, og deretter total overlevelse av mus ble registrert. E, mus (5 mus pr gruppe) ble behandlet med kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb ble også injisert med et anti-CD4, anti-CD8, anti-NK1.1, eller kontroll mAb med 500 ug av hvert mAb pr mus en dag før og to dager etter tumor-felling, fulgt av injeksjon av 200 ug hver 5. dag deretter for varigheten av forsøkene. Tumorbærende ubehandlede mus var som negative kontroller (UNT). Total overlevelse av mus ble registrert. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter med unntak av D og E, som var fra ett eksperiment. *** P 0,001, kombinert mAb vs kontroll eller enkelt mAb behandlet mus i A-C; *** P 0,001, subkutan eller i.p.ID8 vs s.c.TC1 i C; * P 0,05, kontroll eller NK1.1 vs UNT, CD4 eller CD8 i D.
Mus avvise ID8 celler etter kombinasjonsbehandling var resistente mot en etterfølgende reintroduksjon i.p. eller subkutant med den samme cellelinje, men ikke s.c. med urelaterte TC1 lungekreft celler (figur 1D). Disse resultater indikerer at kombinert behandling induserer en spesifikk og langvarig antitumorimmunrespons hos behandlede mus. Lymfocytt undergruppe uttømming eksperimenter vist at tumor beskyttelse av anti-PD-1 /OX40 mAbs var avhengig av CD4
+ og CD8
+ T-celler som fjernelse av CD4
+ eller CD8
+ T-celler men ikke NK-celler helt avskaffet antitumor effekt gitt av anti-PD-1 /OX40 mAb behandling (figur 1E).
Kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb behandling øker prosenter av både CD4 og CD8 T betydelig celler til treg og MDSC
for å utforske mekanismene bak synergi mellom PD-en blokade og OX40 aktivisering, analyserte vi effektene av enkel eller kombinert mAb på tumor infiltrere peritoneal immunceller (PIC) høstet fra behandlede mus 3 eller 7 dager etter siste mAb injeksjon. Sammenlignet med kontroll eller enkel mAb, kombinert Mab betydelig økt prosenter av effektor CD4
+ foxp3
– (middelverdi for kontroll, anti-PD-1, anti-OX40 og anti-PD-1 /OX40 gruppen: 8,24%, 8,20%, 8,70%, 18,78% på dag 3 og 7,66%, 8,02%, 12,22%, 22,80% på dag 7; p 0,05) og CD8 + (middelverdi 6,62%, 6,74%, 7,20%, 23,24% på dag 3 og 5,88, 7,22, 12,90, 29,26 på dag 7; p 0,01) T-celler og redusert hyppigheten av CD11b
+ GR-1
+ myeloide-avledet suppressor celler (MDSC; middelverdi 12,58% , 10,86%, 13,62%, 6,53% på dag 3 og 14,58%, 10,28%, 14,20%, 3,28% på dag 7; p 0,05 og 0,01 for dag 3 og 7 henholdsvis) i PIC på dag 3 etter behandling og endringer ble mer fremtredende på dag 7 etter behandling (figur 2A-D); Det ble imidlertid ikke endring i andelen av CD4
+ foxp3
+ regulatoriske T-celler (Treg) observert i kombinerte mAb behandlede mus på to tidspunkter evaluert. Disse motstridende endringer i effektorceller og immunosuppressive celler ga opphav til vesentlig forhøyede prosenter av både effektor CD4
+ og CD8
+ T-celler til Treg og MDSC i bukhulen til mus som fikk kombinasjons mAb behandling (figur 2E-H) . Med hensyn til individuelle mAb behandling, OX40 engasjement betydelig forhøyet prosentandel av CD4
+ foxp3
+ Treg (1,01%, 0,93%, 1,33%, 1,03% på dag 3 og 1,07%, 0,84%, 1,84%, 0,97% på dag 7; p 0,05 på dag 7) med beskjeden økning i andelen av effektor CD4
+ foxp3
– og CD8 + T celler på dag 7 etter behandling; imidlertid enkelt PD-en blokade mildt svekket nivåene av immunsuppressive Treg og MDSC i bukhulen. Vi merket en økning i absolutt antall totale immunceller fra 2 mAb behandlede mus på to tidspunkter analysert (middelverdi (× 10
6 /mus): 3,5, 3,7, 3,8, 5,6 på dag 3 og 3,7, 3,8, 4,0, 6,2 på dag 7, p. 0,05) og endringer i absolutte antall av hver undergruppe hadde en lignende trend til sine prosenter (data ikke vist)
mus (5 mus per gruppe) injisert ip med 1 × 10
6 ID8 celler 10 dag tidligere ble injisert tre ganger på 4 dager intervall med 200 mikrogram av kontroll, single eller kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb. Tre eller syv dager senere, ble peritoneale LAVAGES fra behandlede mus analysert ved hjelp av strømningscytometri ved sammensetningen av forskjellige immun undergrupper. Prosentene av CD4
+ foxp3
– T-celler, CD8
+ T-celler, CD4
+ foxp3
+ Treg og CD11b
+ GR-1
+ MDSC i CD45
+ peritoneale immunceller er vist i A, B, C og D henholdsvis med hver prikk representerer data fra hver mus. Forholdet mellom begge CD4
+ og CD8
+ T-celler til Treg og MDSC er vist i E, F, G og H henholdsvis med hver prikk representerer data fra hver mus. Dataene er representative for 2 uavhengige eksperimenter, * P 0,05, ** P 0,01
Videre fenotype analyse viste at betydelig økt andel av CD44
+ CD62L
– effektor /minne. (middelverdi for kontroll, anti-PD-1, anti-OX40 og anti-PD-1 /OX40 gruppe: 9,4%, 10,3%, 14,0%, 33,4% og 18,6%, 21,6%, 26,2%, 53,0% etter CD4 og CD8 celler; p 0,01 for begge cellene) og CD44
+ CD62L
+ sentral minne (35.%, 40,9%, 42,8%, 54,2% og 37,7%, 36,7%, 34,6%, 36,9 % av CD4 og CD8-celler; p 0,05 for CD4 celler)-celler ble observert i peritoneale CD4 + og CD8 + T-celler fra anti-PD-1 /OX40 mAb-behandlede mus sammenlignet med den fra styre eller enkelt mAb-behandlede mus (figur 3A, B- ), som PIC inneholdt høyere nivåer av naive CD4
+ og CD8
+ T-celler (48,2%, 44,1%, 37,2%, 9,73% og 32,7%, 33,6%, 27,1%, 6,3% for CD4 og CD8 celler; p 0,01 for begge celler) med CD44
-CD62L
+ fenotype (figur 3C). De representative dotplots ble vist i figur 3D.
Mus (5 mus per gruppe) injisert intraperitonealt med 1 × 10
6 ID8 celler 10 dag tidligere ble injisert tre ganger på 4 dager intervall med 200 mikrogram av kontroll, single eller kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb. Syv dager senere, uttrykket av CD44 og CD62L på peritoneal CD4
+ og CD8
+ T-celler fra behandlede mus ble analysert ved flowcytometri. Frekvensen av CD44
+ CD62L
– effektor /minne, CD44
+ CD62L
+ sentral minne og CD44
-CD62L
+ naive celler i peritoneal CD4
+ og CD8
+ T-celler er vist i A, B og C henholdsvis. De representative dotplots er vist i D med øvre, midtre og nedre paneler viser isotype, CD44 og CD62L farging i gated CD4 henholdsvis
+ og CD8
+ T-celler. Dataene er representative for 2 uavhengige eksperimenter, * P 0,05, ** P. 0,01
I sammendraget, disse resultatene indikerer at samtidig PD-en blokade og OX40 trigging skaper høyere forhold mellom effektor T-celler til immunsuppressive celler i bukhulen av behandlede mus, som representerer forskyvning av normalt undertrykkende svulst miljøet til et mer stimulerende tilstand som er mer ettergivende for immun mediert svulst ødeleggelse.
Kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb behandling fostret en lokal immunstimulerende mikro
for å underbygge denne skiftende av svulstens mikromiljø, vi neste undersøkt uttrykk av immun knyttet gener i nylig isolerte PIC på dager 3-7 etter mAb behandling. Ved hjelp av kvantitativ RT-PCR, faktorer forbundet med aktivering av immunsystemet (T-bet og IFN-γ) og de som er forbundet med immunsuppressive /regulerende aktivitet (foxp3 og IL-10) ble vurdert for deres relative nivåer av uttrykk. På dag 3 etter behandling, i en tid da økt frekvens av T-effektorceller ble observert, transkripsjonsnivåer for T-bet og IFN-γ gener ble dramatisk forbedret i den kombinerte behandlingsgruppen (figur 4A, B). I motsetning til dette genekspresjon av immunosuppressiv cytokinet IL-10 ble kraftig redusert mens foxp3 gen forble uendret (figur 4C, D), som var i overensstemmelse med endringen av treg og MDSC i PIC. Den endring i ekspresjon av T-bet, IFN-γ og IL-10-genene var mer uttalt på dag 7 etter behandling. Basert på prosenter av de stimulerende å regulerende genet transkripsjoner (forholdstall på både T-bet /foxp3 og IFN-γ /IL-10), konkluderte vi med at kombinert behandling fostret en lokal immunaktive svulstens mikromiljø (figur 4E, F ). Enkelt OX40 utløser moderat økt ekspresjon av alle fire gener imidlertid ingen økning av både T-bet /foxp3 og IFN-y /IL-10-forhold ble observert.
Mus (fem mus pr gruppe) injisert i.p. med 1 × 10
6 ID8 celler 10 dag tidligere ble injisert tre ganger på 4 dager intervall med 200 mikrogram av kontroll, single eller kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb. Tre eller syv dager senere ble ekspresjon av Th1-assosierte T-bet og IFN-γ gener og immunoregulatoriske foxp3 og IL-10-gener i PIC fra behandlede mus analysert ved kvantitativ RT-PCR. Ekspresjon av T-bet, IFN-γ, foxp3 og IL-10-genene er vist i A, B, C og D respektivt. Forholdene både T-bet /foxp3 og IFN-γ /IL-10 er vist i E og F henholdsvis. Nylig isolerte PIC fra behandlede mus ble stimulert med 50 ng /ml PMA og 1 ug /ml ionomycin i 6 timer (som beskrevet i Materialer og Metoder), og supernatantene ble undersøkt for nivåer av IL-10 (G) og IFN-γ (H ). Data ble uttrykt som M ± SEM av 5 mus og representant for 2 uavhengige eksperimenter, * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001
For å sikre at endringer i IFN -γ og IL-10 RNA-ekspresjon korrelert med forandringer på proteinnivå, ble PIC isolert på dagene 3 til 7, etter behandling, og stimulert in vitro før analyse av IFN-γ og IL-10-sekresjons-nivåene ved hjelp av ELISA. Spesielt, PIC isolert 3 og 7 dager etter initiering av kombinert mAb terapi produsert betydelig høyere nivåer av IFN-γ protein og lavere nivåer av IL-10-cytokin sammenlignet høstet fra kontroll eller enkelt mAb-behandlede mus ved de samme tidspunkter (figur 4G , H).
Kombinert anti-PD-1 /OX40 mAb behandling fremkalte en antigen-spesifikk CTL respons
Som ID8 celler uttrykker mesothelin, en godt karakterisert tumor antigen [38], vi høstet splenocytter fra behandlede mus, og det samme antallet splenocytter ble dyrket i nærvær av 10 ug /ml av H-2 dB begrenset mesothelin-spesifikke peptid (aminosyre 406-414) eller kontroll-HPV E7-peptid (aminosyrene 49 -57) i 3 dager og analysert IFN-γ produksjon i kultursupernatantene ved hjelp av ELISA. Sammenlignet med den fra styre eller enkelt mAb-behandlede mus, splenocytter fra kombinerte mAb-behandlede mus produserte signifikant høyere nivåer av IFN-γ når de ble stimulert med mesothelin peptid (P 0,01; figur 5A). Ingen øket IFN-γ sekresjon ble observert i splenocytter fra alle grupper av mus når de ble stimulert med kontroll HPV peptid, noe som viser induksjon av mesothelin-spesifikk immunrespons hos mus som fikk kombinasjons mAb behandling. Vi evaluerte videre cytolytisk aktivitet splenocytes fra kontroll eller kombinerte mAb behandlede mus. Splenocytter ble restimulert med UV-bestrålte ID8-celler i 4 dager før CTL-analyser ble utført ved anvendelse av EL4-celler pulsert med mesothelin eller HPV-E7 avledet peptid som målceller. Som vist i figur 5B og 5C, splenocytter fra anti-PD-1 /OX40-behandlede mus utviste betydelig høyere nivåer av cytotoksisk aktivitet mot EL4 celle pulset med mesothelin, men ikke med HPV-E7 peptid.
