Abstract
Bakgrunn
vitamin D reseptor (VDR) veien er viktig i forebygging og potensielt i behandlingen av mange kreftformer. En viktig mekanisme av VDR handlingen gjelder dets interaksjon med Wnt /β-catenin pathway. Agonist-bundet VDR inhiberer onkogene Wnt /β-catenin /TCF veien ved å interagere direkte med β-catenin og i enkelte celler ved å øke cadherin uttrykk som, i sin tur, rekrutterer β-catenin til membranen. Her identifiserer vi TCF-4, en transkripsjonen regulator og β-catenin bindende partner som en indirekte mål på VDR veien.
metodikk /hovedfunnene
I dette arbeidet viser vi at TCF- 4 (gen navn TCF7L2) er redusert i melkekjertelen av VDR knockout mus sammenlignet med villtype-mus. Videre viser vi 1,25 (OH)
2D
3 øker TCF-4 på RNA og proteinnivåene i flere humane kolorektale cancercellelinjer, er effekten av disse helt avhengig av VDR.
I silico
analyse av de menneskelige og mus TCF7L2 arrangører identifisert flere mulige VDR bindende elementer. Selv TCF7L2 promoter journalister reagerte på eksogen VDR, og 1,25 (OH)
2D
3, mutasjon analyse og kromatin immunoutfellingsstudier analyser viste at økningen i TCF7L2 ikke krever rekruttering av VDR til de identifiserte elementene og indikerer at reguleringen av VDR er indirekte. Dette blir ytterligere bekreftet av kravet om
de novo
proteinsyntese for oppregulering.
Konklusjon /Betydning
Selv om det er generelt antatt at bindingen av β-catenin til medlemmer av TCF /LSF familien er kreftfremmende, har nyere studier indikerte at TCF-4 funksjoner i stedet som en transkripsjons repressor som begrenser brystkreft og tykktarmskreft cellevekst. Derfor konkluderer vi at 1,25 (OH)
2D
3 /VDR-mediert økning i TCF-4 kan ha en beskyttende rolle i tykktarm kreft samt diabetes og Crohns sykdom.
Citation: Beildeck ME, Islam M, Shah S, Welsh J, Byers SW (2009) Styring av TCF-4 Expression av VDR og vitamin D i Mouse melkekjertlene og tykktarmskreft cellelinjer. PLoS ONE 4 (11): e7872. doi: 10,1371 /journal.pone.0007872
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: May 15, 2009; Godkjent: 14 oktober 2009; Publisert: 17.11.2009
Copyright: © 2009 Beildeck et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. R01- CA-129-813 (SWB); DoD CDMRP Predoctoral Praksisplass Award: W81XWH-06-1-0786 (MEB) https://cdmrp.army.mil/bcrp/default.htm; Kjernefasiliteter Grant: NIH P30 CA51008 (LCCC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Aktivering av vitamin D veien har vært assosiert med en redusert risiko i utvikling og progresjon av mange kreftformer (anmeldt i [1]). Selv om epidemiologiske studier er mindre klart om sammenslutning av kreftrisiko med serum nivåer av vitamin D og dets metabolitter, molekylærbiologi og dyrestudier støtter en rolle for vitamin D i økt apoptose og celledifferensiering, og redusert cellevekst. Som vitamin D er en forbindelse som er tilgjengelig i kosten (riktignok utilstrekkelig) som et supplement, eller lett-syntetiseres av kroppen, er det et attraktivt kandidat for chemoprevention og kjemoterapi. Dens kliniske fordeler i denne stillingen, men inhiberes av dosebegrensende hyperkalsemi, en side-effekt som utvikler seg fra den primære rolle av vitamin D i kalsium homeostase. I et forsøk på å utnytte vitamin D i klinikken som en anti-kreft agent, har man forsøkt å generere vitamin D-analoger som resulterer i redusert hyperkalsemi. Selv om disse analogene har vist store løftet
in vitro Hotell og i dyremodeller, de bommer i fremkaller en tilsvarende respons i klinikken. Videre kan en vellykket analog utgjøre et særlig problem i sammenheng med kolorektal kreft, den tredje største årsaken til kreft dødsfall hos menn og kvinner i USA. Selv om bevis for vitamin D som et middel mot kreft i dette organet er særlig sterk, er GI-systemet nært involvert i mediering av virkningene av vitamin D på kalsium homeostase. Dette indikerer at i tykktarmen, kan det være vanskelig å frakople de anti-kreft og kalsium homeostatiske effekter av vitamin D. Selv om det i andre studier viser vi at noen vitamin D-partielle antagonister vil aktivere vitamin D-reseptoren på celler som uttrykker høye nivåer av aktivert β-catenin (kreftceller), men ikke i normale celler og kan ha potensial til å gjøre dette [2].
Nuclear hormonreseptorer kan påvirke den kanoniske Wnt signalkaskade ved å samhandle med β-catenin [3 ]. Dette fenomenet kan være særlig aktuelt i tykktarmskreft, hvor 80% av tilfellene er en havn av APC mutasjoner som abnormt aktivere β-catenin [4], som fører til opphopning av aktivert β-catenin i kjernen (Anmeldt i [5]). I kjernen, er β-catenin ansvarlig for samtidig aktivering av transkripsjon av gener som promotorene er okkupert av medlemmer av TCF /LEF familie av transkripsjonsfaktorer. Noen av disse genene som
c-myc product: [6] og
Cyclin D1-product: [7], er involvert i cellesyklusregulering og kan bidra til en onkogen fenotype. Behandling av celler med noen (men ikke alle) nukleær hormonreseptor (NHR) agonister bevirker en oppregulering av NHR-responsive gener og samtidig forårsaker en reduksjon i TCF /β-catenin målgenet transkripsjon. Dette har blitt tilskrevet konkurrerende binding mellom TCF og NHRs for β-catenin [3], [8] – [11], og /eller vanlige ko-aktivatorer slik som p300 [2]. En andre modus for inhibering av Wnt target gentranskripsjon er blitt tilskrevet forebygging av β-catenin nukleær translokasjon ved rekruttering av cytoplasmisk β-catenin til adherens knutepunktene [9], [12], [13]. For det tredje, det er dokumentert at NHRs bind til TCF /LEF familiemedlemmer, direkte, og dermed hemme transkripsjon av TCF /β-catenin responsive gener [14] – [18]. Dette er sannsynligvis på grunn av rekruttering av co-repressors som TLE (Groucho) [19], NCoR og SMRT [20].
Her rapporterer vi en ekstra mekanisme for samhandling mellom β-catenin sti og vitamin D reseptor (VDR) veien. For å klargjøre, vil vi bruke følgende nomenklatur: TCF7L2 i sammenheng med plasmider, DNA og RNA, og TCF-4 i sammenheng med protein, bare. Vi fant ut at TCF-4 er forskjellig uttrykt i celler avledet fra DMBA-induserte mus mammary svulster fra VDR villtype og slå ut mus, og melkekjertlene selv. Ytterligere undersøkelse avslørte en VDR-avhengig oppregulering av TCF7L2 på mRNA og proteinnivåer ved behandling med 1,25 (OH)
2D
3 i CaCo2-celler. Analyse av humane og mus TCF7L2 promoter forutsagte flere antatte vitamin D reseptor-bindende elementer proksimalt for transkripsjonsstartsetet. Selv om kloning av denne promoter-regionen viste regulering av VDR /1,25 (OH)
2D
3, etterfølgende mutasjonsanalyse, kromatin immunpresipitering og proteinsyntese-inhibering forsøk tyder på at denne effekten er sannsynligvis formidlet indirekte, via en VDR /1,25 (OH)
2D
3-sensitive mellomledd. Økninger i TCF-4-proteinnivåer sette økt TopFlash aktivitet etter 24 timers ligandaktivering behandling i CaCo2-celler. Vi foreslår en mekanisme der denne effekten kan hemme onkogene aktivitet
i cellulo
.
Resultater
melkekjertlene fra VDR knockout mus har mindre TCF-4 enn melkekjertlene fra VDR Wild -type mus
VDR145
+ /+ og VDRK240
– /- cellelinjer er avledet fra DMBA-induserte mus mammary svulster fra villtype (WT) og VDR knockout (KO) mus, henholdsvis, og ble beskrevet tidligere [21]. VDR KO mus er mer utsatt for karsinogen-induserte bryst og kolon kreftfremkallende, så vel som andre lesjoner [22], [23]. Innledende forsøk viste at TCF-4 var mer tallrike i WT celler enn KO-celler (ikke vist). Vi utførte western blot-analyse for TCF-4, og bekreftet at VDRK240
– /- celler som har svært lave nivåer av TCF-4 sammenlignet med VDR145
+ /+ celler (figur 1A). Vi neste utførte en pull-down analyse hvor vi brukte to GST-merket β-catenin fusjonsproteiner. WT GST-merket β-catenin binder TCF /LEFs via armadillo gjenta regionen, mens GST-dTCF-β-Cat, som havner mutasjoner ved restene 253, 312, og 435 i armadillo regionen, har dramatisk-redusert affinitet for TCF /LEFs [24]. I samsvar med de vestlige blot data, WT fusjonsprotein trukket ned mer TCF-4 fra VDR145
+ /+ lysatene enn fra VDRK240
– /- lysatene. Den muterte fusjonsprotein trakk ned mye mindre TCF-4 fra VDR145
+ /+ celler og ingen fra VDRK240
– /-. Celler (figur 1B)
(A) Western blot av helcellelysater, i duplikat, fra VDR145
+ /+ (VDR + /+) celler (felt 1 og 2) og VDRK240
– /- (VDR – /-) celler (kolonnene 3 og 4) analysert for TCF-4, VDR og GAPDH. (B) Trekk ned av proteiner i VDR + /+ og VDR – /- lysatene med GST-merket β-catenin konstruerer og analysert for TCF-4. GST-WT-β-catenin (GST-β-Cat) anvendes i banene 1 og 2. mutert β-catenin som ikke vil effektivt binde TCF /LEF proteiner (GST-dTCF-β-Cat) anvendes i kolonnene 3 og 4. Perler alene er brukt i felt 5 og 6. (C) OT aktivitet i VDR + /+ og VDR – /- celler transfektert med
Renilla Hotell og VP16-β-catenin. Dataene er normalisert til
Renilla
. Feilfelt representerer SEM. p-verdier representerer students t-test for significan forskjeller mellom cellelinjer. RLU: relative lysenheter (D) OT aktivitet i VDR + /+ og VDR – /- celler transfektert med
Renilla
, VP16-β-catenin og med eller uten en TCF7L2 plasmid. Feilfelt representerer SEM. Statistikken er student t-test for forskjeller mellom Transfekterte og kontroll-transfekterte celler. * P 0,05; *** P 0,0005. (E) brystkjertelen vev fra VDR WT (toppfeltene) og VDR KO (bunnpaneler) mus farget for TCF-4 vist på tre forstørrelser.
neste brukte OT /AV reporter systemet analysen TCF /β-catenin aktivitet i disse cellene. OT reporter inneholder tre tandem TCF /LSF bindende elementer oppstrøms for en luciferase gen og tilsvarende kontroll reporter (OF) har mutert TCF bindingsseter og representerer bakgrunn bindende. Fordi disse cellene har lav endogen β-catenin aktivitet, VP16-β-catenin ble co-uttrykt med rapportør vektorer i alle prøver. I samsvar med sine reduserte nivåer av TCF-4, VDRK240
– /- cellene hadde mindre β-catenin aktivitet enn VDR145
+ /+ celler (figur 1C). Denne forskjellen var signifikant, men ikke stor, og indikerer at VDRK240
– /- celler som har andre familiemedlemmer TCF som kan kompensere for TCF-4, og /eller lave nivåer av TCF-4 som forblir i disse cellene er tilstrekkelig for aktivering , i det minste i forbindelse med høye nivåer av aktivert β-catenin [25], [26]. Co-transfeksjon med eksogen TCF7L2 reddet redusert β-catenin aktivitet i VDRK240
– /- celler (figur 1D). For å avgjøre om dette fenomenet ble også skjer
in vivo
, farget vi normale brystvevet fra VDR WT og VDR KO mus for TCF-4. I samsvar med resten av dataene i figur 1, bryst vev fra VDR WT dyr har mer fremtredende flekker i forhold til melke vev fra VDR KO dyr (figur 1E). TCF-fire farging er ikke helt fraværende i VDR KO melkekjertler, selv om det er mye sjeldnere og mindre intense (figur 1E, panel nederst til høyre).
CYP24A1 er den beste-preget, nedstrøms målet for vitamin D sti og dens mRNA er utsøkt sensitive til VDR-agonister. CYP24A1 er involvert i metabolismen av aktive vitamin D-forbindelser til inaktive metabolitter. Aktivitet av CYP24A1 reporter var fraværende og ikke påvirkes av 1,25 (OH)
2D
3 i VDRK240
– /- celler, men ble restaurert ved transfeksjon av VDR (figur 2A). Til sammen viser disse data at celler som er null for VDR har lavere basalnivåer av TCF-4, og at dette reduserer β-catenin aktivitet i VDR-null mammary modell.
(A) CYP24-luc-aktivitet i VDRK240
– /- (VDR – /-) og VDR145
+ /+ (VDR + /+) celler som ble transfektert med GFP eller VDR og behandlet med 10
-7 M 1,25 ( OH)
2D
3 eller EtOH-kontroll i 24 timer som angitt. RLU = relative lysenheter. (B) revers transkriptase PCR-analyse av mus CYP24A1 (topplaten), mus og menneske VDR (midtre paneler) og β-aktin (nedre panel) transkripsjoner i respons til eksogen menneskelig VDR uttrykk og 1,25 (OH)
2D
3-behandling som beskrevet i del A. (C) Forskjellige kolorektale cancercellelinjer ble inkubert i 24 timer i 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 eller EtOH, så indikert. Cellulære proteiner ble analysert for TCF-4-ekspresjon (øvre panel) og GAPDH ble overvåket i lik kjørefelt lasting (nedre panel). Begge TCF-4 band representerer forskjellige isoformer av TCF-fire som har forskjellig lengde C-endene. (D) CaCo2-celler ble transfektert med forskjellige mengder av VDR eller siRNA i 24 timer og behandlet med 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 eller EtOH for en etterfølgende 24 timer, så angitt, og undersøkt for TCF-4. NT: Ikke-målretting. (E) Densitometrisk analyse av tre western blots som angitt i del A. Data ble plottet i forhold til hverandre EtOH-behandlet kontrollgruppe. p-verdier ble generert av ensidige t-test: * p 0,05; ** P 0,005; *** P .0005 (F) CaCo2 celler ble transfektert i 24 timer med VDRE-Luc,
Renilla Hotell og siRNA og behandlet for en påfølgende 24 timer med 10
-7 M 1,25 ( OH)
2D
3 som angitt. RLU: relative lysenheter. (G) CaCo2-celler ble transfektert med siRNA i 24 timer og behandlet i en etterfølgende 24 timer med 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 eller EtOH som angitt. CYP24A1 transkripsjoner ble analysert ved qPCR. Dataene er normalisert til GAPDH uttrykk og plottet i forhold til hverandre EtOH kontroll.
VDR /1,25 (OH)
2D
3 Regulerer TCF7L2 mRNA og protein i tykktarmskreft cellelinjer
Vi neste transfektert VDRK240
– /- celler med human VDR og funnet ut at TCF-fire protein og TCF7L2 mRNA var upåvirket av VDR eller 1,25 (OH)
2D
3 (Supplementary Figur S1 A og S1B). Bemerkelsesverdig, selv om aktiviteten til det CYP24A1 reporter var følsom overfor eksogent VDR og 1,25 (OH)
2D
3 i disse celler (figur 2A), som TCF7L2,
endogene
CYP24A1 mRNA var ikke, til tross for transfeksjon optimalisering som mulig for oss å oppnå 60% virkningsgrad (figur 2B). Disse data indikerer at VDRK240
– /- celler som har langvarige endringer i evnen av endogene målgener for å svare på den forbigående gjenopprettelse av VDR. Som eksogent uttrykt arrangører er følsomme, dette er sannsynligvis et resultat av endringer i kromatin organisasjon som ikke kan reverseres ved kortvarig uttrykk for VDR og behandling med 1,25 (OH)
2D
3.
Følgelig, for ytterligere å bestemme effektene av VDR og dens klassiske ligand på TCF-4-ekspresjon, ble analysert vi flere kolorektal kreftcellelinjer for endringer i TCF-4-ekspresjon som reaksjon på 1,25 (OH)
2D
3 (figur 2C, Supplerende Figur S2). Selv om alle disse cellene øket ekspresjon av TCF4 som reaksjon på vitamin D valgte vi å bruke human kolorektal adenokarsinom-cellelinje, CaCo2 av flere grunner. Disse cellene er godt studert i sammenheng med vitamin D-signalisering og deres vekst hemmes av 1,25 (OH)
2D
3 [27]. Videre er de et unikt system som etterligner normal gut epitel som når de blir sammenflytende de skille i kultur [28]. Disse cellene uttrykker også VDR, men ved lavere (dvs. normal) nivåer med hensyn til flere andre tykktarmskreft cellelinjer [29], [30]. Behandling av konfluente CaCo2-celler med 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 med eller uten transfeksjon av VDR fører til en robust og statistisk signifikant økning i TCF-4-protein (figur 2D og E). Virkningene av 1,25 (OH)
2D
3 er moderat forsterket av eksogene VDR, og dette er trolig et underestimat som bare 50-60% av cellene transfektert. Mer viktig er det at økning av TCF-4 induseres av 1,25 (OH)
2D
3 er helt avhengig av VDR, som sin knockdown hemmer ikke bare effekten av 1,25 (OH)
2D
3 på aktiviteten av en VDRE promoter reporter og på CYP24A1 mRNA-induksjon, men også på TCF-4-induksjon (figur 2D-G). I motsetning til VDRK240
– /- celler (Supplementary figur S1B), ble TCF7L2 og CYP24A1 mRNA økt med 1,25 (OH)
2D
3 i CaCo2 celler (figur 3A). Både TCF7L2 og CYP24A1 nivåer ble forhøyet etter 4 timer med TCF7L2 når et maksimum induksjon ved 24 timer (Figur 3B). Denne forskriften er også underlagt celletetthet, som statistisk signifikante forskjeller i TCF7L2 mRNA blir bare sett på høyere tetthet (Supplementary Figur S3). Dette kan være analog med moderat forsterket effekten av eksogent VDR på 1,25 (OH)
2D
3-mediert økning av TCF-4 (figur 2E), i CaCo2-celler er kjent for å oppregulerer VDR upon konfluens /differensiering [31].
(A) qPCR-analyse av CaCo2-celler transfektert og behandlet som beskrevet i figur 2D og 2E. TCF7L2 (venstre panel) og CYP24A1 (panel høyre) transkripsjoner. Dataene er normalisert til GAPDH og plottet i forhold til hverandre EtOH-behandlet kontrollgruppe. p-verdier er hentet fra t-test sammenligning mellom EtOH og D
3 kontroller: * p 0,05; **; p 0,005; *** P .0005 (B) CaCo2 celler ble behandlet ved ulike tidspunkt med 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 opp til 48 timer før samlingen. mRNA for TCF7L2 (venstre panel) og CYP24A1 (høyre panel) ble analysert ved qPCR. Data ble normalisert til GAPDH og plottet som ganger endring i forhold til 0 Hr endepunktet. p-verdier ble avledet fra t-test i forhold til 0 Hr endepunktet: * p 0,05; **; p 0,005; *** P. 0,0005
VDR /1,25 (OH)
2D
3 Regulerer aktivitet av TCF7L2 arrangøren i Mouse melke og menneskelige tykktarmskreftceller
Siden TCF7L2 er regulert av 1,25 (OH)
2D
3 på mRNA nivå i CaCo2 celler, skannet vi musen og menneske TCF7L2 gener omtrent 4000 basepar oppstrøms for transkripsjon start stedet for tilstedeværelse av halv-nettsteder som er i samsvar med VDRE konsensus RGKTSA (R = A eller G, K = G eller T, S = G eller C), eller halv-områder som avviker litt fra konsensus, men som har blitt beskrevet som funksjonell VDRE halv steder i litteraturen. Vi identifiserte flere mulige VDREs kodet på TCF7L2 promoteren av både humane og mus-genet (Supplemental Tabell S1 [32] – [41]). Siden mus og det humane TCF7L2 promotoren del mer enn 80% sekvensidentitet i de første ~2000 basepar, klonet vi to deler av mus promoter inn i et luciferase-konstruksjon (figur 4A). En reporter, -1037-Luc, inneholder området mellom +522 og -515 basepar i forhold til transkripsjon start stedet og inneholder 5’UTR og spådd TATA-boksen på -25 basepar. Den -2068-Luc reporter dekker området mellom 430 og -1542 forhold til transkripsjonsstartsetet. Plasmidet navn og deretter nevnte VDREs refererer til avstanden fra startkodonet og ikke transkripsjonsstartsetet siden database transkripsjonsstartsider variere. Halv områder av -187 /-177 DR4 elementer, (to heksahalvsider arrangert som direkte repetisjoner fordelt etter fire nukleotider) å dele en halv-språk mellom dem.
(A) To mus TCF7L2 promoter konstruksjonene ble klonet oppstrøms for en luciferase reporter. De fire antatte VDRE steder i forhold til translasjonsstartsetet er betegnet, og alle VDREs er kodet på den ikke-kodende tråd. De -177 og -187 VDREs er overlappende og dele en halv-området mellom dem. Den -1037 konstruksjon (-1037-Luc) inneholder regionen -1 til -1037 i forhold til oversettelse start området og besitter -177 /-187 VDRE, bare, mens -2068 reporter (-2068-Luc) inneholder region mellom -96 og -2068 forhold til translasjonsstartsetet av musen TCF7L2 promoteren, og besitter alle de fire mulige VDREs. (B) CaCo2 celler ble transfektert i 24 timer med
Renilla Hotell og journalister som angitt samt ulike mengder av p53. Dataene er normalisert til
Renilla Hotell og å tømme reporter uttrykk. RLU = relative lysenheter. (C) -1038-Luc eller tomme vektorkonstruksjoner ble transfektert inn CaCo2 celler med
Renilla Hotell og ulike mengder av VDR, som indikert. 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet i ytterligere 24 timer med 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 eller EtOH bærerkontroll. Feilfelt representerer SEM. Statistikken ble hentet fra to-veis ANOVA for forskjeller mellom EtOH- og 1,25 (OH)
2D
3-behandlede prøver: * p 0,05; **; p 0,005; *** P 0,0005. (D) CaCo2-celler ble transfektert, behandlet og analysert som i del C, under anvendelse -2068-luc istedenfor -1038-luc. Statistikken ble generert av to-veis ANOVA for signifikante forskjeller mellom mengden av VDR transfektert: *** p 0,0005. Feilfelt representerer SEM. RLU. Relative lysenheter
Reporter -1037-Luc inneholder kun den første antatte, sammensatte VDRE, mens -2068-Luc reporter inneholder alle fire VDREs. p53 reduserer aktiviteten av en human TCF7L2 reporter og vi har funnet at p53 inhiberte også aktiviteten til både -2068-luc og -1037-Luc mus reportere [42], [43] (figur 4B). Videre basal aktiviteten til -2068-luc reporter var markert mindre enn den -1037-luc reporter som indikerer nærvær av en sterk repressor element i denne regionen (figur 4B). I CaCo2-celler, reagerer den -1038-Luc konstruktet moderat, men betydelig, til tilsetningen av liganden, men virkningen var ikke forsterkes av eksogent VDR (figur 4C, venstre panel). I kontrast, svarer -2068-Luc sterkt til eksogen VDR, men ikke på behandling med 1,25 (OH)
2D
3 i CaCo2 og VDRK240
– /- celler (figur 4C, høyre panel og analytiker Figur S4A, henholdsvis). Disse dataene indikerer at VDR og behandling med 1,25 (OH)
2D
3 påvirkninger aktiviteten i TCF7L2 arrangøren, men de kommer ikke vise at effekten er direkte.
Antatte VDREs innenfor mus TCF7L2 Arrangøren er ikke viktige for regulering av VDR i mus melke og menneske kolorektal kreft celler
for å teste hypotesen om at de antatte VDREs var viktige i å formidle responsen fra TCF7L2 arrangøren til VDR, tredje og fjerde nukleotider i hver halvdel stedet ble mutert til doble alanine rester (figur 5A). 5 «halvstedet -187 ble ikke mutert siden 3’half-området hvis dette VDRE deles med -178 VDRE, og ble mutert i denne konstruksjonen. Disse mutasjonene endre de halv-områder slik at de ikke svarer til den VDRE konsensussekvensen, og må ikke binde VDR. Mutasjoner ble generert slik at hver VDRE (som inneholder to halv-sider, hver) ble mutert i alle syv mulige kombinasjoner av enkelt-mutasjoner, dobbel mutasjoner, og en trippel mutasjon. Transfeksjon av disse konstruksjonene avslørte at de beholdt respons på eksogene VDR i CaCo2 celler og VDRK240
– /- (figur 5B og Supplerende Figur S4B, henholdsvis). Vi neste utførte kromatin immunoprecipitation (chip) analyser for å teste rekruttering av VDR til de seks antatte VDREs identifisert i menneske TCF7L2 promoter (figur 5C). CaCo2-celler ble sådd ut ved høy tetthet og behandles i 4 timer med 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3. Både Retinoid X-reseptor (RXR) og VDR ble rekruttert til de publiserte VDREs på CYP24A1 promoteren (figur 5D, felt 1 og 2), men verken NHR ble rekruttert til en hvilken som helst av de antatte VDREs i menneske TCF7L2 promoter-regionen. Disse dataene tyder på at økningen i TCF7L2 uttrykk er ikke på grunn av rekruttering av VDR til disse antatte VDREs i mus og menneske TCF7L2 arrangører. Dette kan bety at enten VDR blir rekruttert til andre regioner i genomet og kontrollere transkripsjon av TCF7L2 direkte, eller VDR er å regulere dette fenomenet gjennom et 1,25 (OH)
2D
3-sensitive mellommann .
(A) grafisk fremstilling av de fire mulige VDREs løpet av de første ~1500 basepar av mus TCF7L2 promoteren og deres sekvenser. DR3: direkte gjenta ispedd av tre nukleotider. 2xDR4: to, overlapp direkte gjentar ispedd av fire nukleotider. Selv om de antatte VDREs er kodet på den ikke-kodende kjede, er deres sekvenser skrevet på revers-komplement slik at VDREs kan identifiseres som er kompatible med RGKTSA konsensus. (B) -2068-Luc konstruksjon som inneholder alle tre sett med halv-sete-mutasjoner (d1502 /d1153 /d177) ble transfektert inn CaCo2 celler og behandlet med ligand som beskrevet i figur 4C med bare tre konsentrasjoner av VDR (lav, middels og høy ). Feilfelt representerer SEM. Statistikk representerer analyse ved hjelp av to-veis ANOVA: * p 0,05. RLU-relative lysenheter. (C) Visning av de seks mulige VDREs identifisert innenfor 4000 basepar oppstrøms for transkripsjonsstartsetet av det humane TCF7L2 promoter-regionen og er navngitt i forhold til deres avstand fra translasjonsstartsetet (+ være nedstrøms, og velvære oppstrøms). Alle regioner unntatt 88 (merket med) blir kodet på den ikke-kodende tråd. (D) Chromatin immunoprecipitation av VDR og RXR-bundet DNA-fragmenter fra CaCo2 celler behandlet i 4 timer med 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 (D-partalls baner) eller EtOH (E-oddetalls-baner). Regionene som forsterker VDRE holdige områder er merket langs toppen av banene. CYP produkt forsterker en region av det humane CYP24A1 promoter som er kjent for å binde VDR og RXR i nærvær av ligand, og fungerer som en positiv kontroll. IgG representerer uspesifikk amplifikasjon. Input demonstrerer tilsvarende materiale som brukes i hver prøve.
Regulering av TCF7L2 av VDR /1,25 (OH)
2D
3 vil sannsynligvis mediert av en indirekte Mechanism i kolorektal kreft celler
For å teste den siste hypotesen, benyttet vi oversettelsen inhibitor, cycloheximide (CHX). CaCo2-celler ble forbehandlet med forskjellige mengder av CHX i 30 minutter og deretter behandlet med 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 til 24 timer. I CaCo2-celler, ved konsentrasjoner så lave som 12,5 ug /ml, CHX var i stand til i betydelig grad å blokkere induksjonen av TCF7L2 mRNA by1,25 (OH)
2D
3, som er DKK-4, en annen indirekte vitamin D mål som er negativt regulert (figur 6) [44]. Disse dataene indikerer kravet til
de novo
proteinsyntesen for regulering av 1,25 (OH
) 2D
3. Den CYP24A1 mRNA-induksjon med 1,25 (OH)
2D
3 blir også markert inhibert av CHX, men fremdeles induseres ~ 20 ganger med 1,25 (OH)
2D
3 i høyeste konsentrasjon av CHX (Supplementary fig S5), et fenomen som har blitt vist for en annen direkte vitamin D målgen, E-cadherin [9]. Reguleringen av CYP24A1 er så dramatisk at det sannsynligvis krever fortsatt syntese av co-aktivator proteiner for å støtte en induksjon av denne størrelsesorden. Samlet utgjør disse dataene antyder at reguleringen av TCF7L2 av VDR /1,25 (OH)
2D
3 er indirekte.
CaCo2 celler ble forbehandlet i 30 minutter med ulike konsentrasjoner av den proteinsynteseinhibitor Cycloheximide (CHX) før tilsetning av 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 eller EtOH i 24 timer, som angitt. Analyse av mRNA overflod av TCF7L2 (topplaten) og DKK4 (nedre panel) ble analysert ved qPCR. Feilfelt representerer SEM. * P. 0,05 via t-test for signifikante forskjeller mellom D
3 versus EtOH behandlede celler
1,25 (OH)
2D
3 Øker TCF Reporter aktiviteten i kolorektal kreft celler
Selv om reguleringen av TCF7L2 er viktig for mange patologiske utfall, ønsket vi å se på det i sammenheng med kreft. Vi valgte å se på effekten av VDR-mediert TCF-4 oppregulering via den klassiske TopFlash reporter system som har blitt beskrevet tidligere (TopFlash, i motsetning til OT, benytter et minimum
c-fos
promoter). CaCo2-celler har en somatisk mutasjon APC som lar β-catenin å akkumulere og translocate til kjernen. I tilfelle av over-rikelig, aktiv β-catenin kan vi forvente en økning i ekspresjon TCF7L2 å resultere i økt TopFlash aktivitet. Faktisk har vi gjentok samme VDR titrering eksperimenter som beskrevet i de TCF7L2 promoteren rapportør eksperimenter (figur 4C), ved hjelp av TopFlash (normalisert til kontroll plasmid, FopFlash) i stedet, og har observert en konsekvent, betydelig økning i TopFlash aktivitet med 24 timer med 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 i CaCo2 celler (figur 7) som, som protein data (figur 2D og 2E) forsterkes av VDR. Disse data understøtter en rolle for VDR-avhengige, 1,25 (OH)
2D
3-mediert økning av TCF-4 i mus bryst og humane kolorektale svulstceller, kan effekten av differensielt som regulerer β-catenin aktivitet
in vivo
.
CaCo2 celler ble transfektert i 24 timer med TopFlash,
Renilla Hotell og ulike mengder VDR og behandlet for en påfølgende 24 timer med 10
-7 M 1,25 (OH)
2D
3 eller EtOH. Luciferasepreparater data ble normalisert til
Renilla Hotell og FopFlash og plottet i forhold til hverandre EtOH-behandlet kontrollutvalget. Feilfelt representerer SEM. p-verdier som angis er fra student t-test. RLU. Relative lysenheter
Diskusjoner
Vitamin D har vist store løftet som et middel mot kreft i både molekylære og dyrestudier, samt noen epidemiologiske studier (Anmeldt i [45]). I et forsøk på å frikoble den anti-kreft effekt av vitamin D fra de kalsemiske effekter som begrenser dens nytte i klinikken, er mange laboratorier dissekere nedstrømsaktiviteter. Flere molekylære mekanismer som bidrar til den potensielle terapeutiske virkningen av vitamin D involvere interaksjon med β-catenin pathway. En direkte interaksjon mellom β-catenin og en NHR, i dette tilfellet, retinsyre reseptoren ble først beskrevet i 1999 [3]. Siden da har mange studier funnet tilsvarende interaksjoner for androgen reseptor [8], [10], [11], peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor [18], og VDR [2], [9]. Disse studiene viser at NHR og TCF /LEF familiemedlemmer konkurrere om binding til p-catenin og /eller vanlige tilleggsaktivatorer, slik som P300. I nærvær av ligand, β-catenin og /eller P300 favoriserer binding til NHR, forårsaker en synergistisk oppregulering (i forbindelse med NHR ligand) av NHR-regulerte gener, samt en samtidig ned-regulering av TCF /β -catenin responsive gener.
