Abstract
En stor utfordring for onkologer og pharmacologists er å utvikle mer potente og mindre giftige stoffer som vil redusere tumorvekst og forbedre overlevelse av lungekreftpasienter. Salinomycin er en polyeter antibiotika som brukes til å drepe gram-positive bakterier inkludert mykobakterier, protozoer slik som Plasmodium falciparum, og parasitter som er ansvarlige for fjærfe sykdommen coccidiosis. Denne gamle middel er nå en alvorlig anti-kreft medikamentkandidat som selektivt hemmer veksten av kreft stamceller. Vi undersøkte effekten av Salinomycin på overlevelse, kolonivekst, migrasjon og invasjon av differensierte humane ikke-småcellet lungekreft linjer LNM35 og A549. Salinomycin forårsaket treringstrinnet og tidsavhengig reduksjon i levedyktighet av LNM35 og A549-celler gjennom et caspase 3/7-assosiert celledød pathway. Tilsvarende salinomycin (2,5-5 uM i 7 dager) reduserte signifikant vekst av LNM35 og A549 kolonier i bløt agar. Metastase er den viktigste dødsårsaken knyttet til lungekreft. I denne sammenheng, salinomycin induserte en tids- og konsentrasjonsavhengig inhibering av cellemigrering og invasjon. Vi har også påvist for første gang at salinomycin induserte en markert økning i ekspresjon av de pro-apoptotiske protein NAG-1 fører til hemming av lungekreft celle invasjon, men ikke celleoverlevelse. Disse funnene identifisere salinomycin som en lovende ny terapeutisk middel for lungekreft
Citation. Arafat K, Iratni R, Takahashi T, Parekh K, Al Dhaheri Y, Adrian TE, et al. (2013) hemmende effekter av Salinomycin på Cell Survival, Colony vekst, migrasjon og invasjon av human ikke-småcellet lungekreft A549 og LNM35: Involvering av NAG-en. PLoS ONE 8 (6): e66931. doi: 10,1371 /journal.pone.0066931
Redaktør: Ramon Andrade de Mello, Universitetet i Porto, Portugal
mottatt: 16. desember, 2012; Godkjent: 11 mai 2013; Publisert: 21 juni 2013
Copyright: © 2013 Arafat et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Terry Fox fond for kreftforskning (SA og TA) og dels av UAEU-National Research Foundation fond til SA. Virkemiddelapparatet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Lungekreft er den vanligste formen for kreft med en av de høyest dødelighet i verden. De kjemoterapeutiske midler for tiden er i bruk for lungekreft er utilfredsstillende på grunn av tilhørende manglende effekt, medikamentresistens, og co-lateral toksisitet. Målrettet behandling for utvalgte undergrupper av pasienter utgjør en bemerkelsesverdig fremgang i behandlingen av lungekreft. Imidlertid ikke mer enn 50% av lungekreft ikke har noen spesifikke genetiske profil og er således ikke er gode kandidater for målrettet terapi. Til tross for disse fremskrittene, kan dagens behandling av lungekreft forlenge livet ved måneder, men ikke kurere sykdommen [1]; [2]; [3].
Salinomycin er en polyeter antibiotika som brukes til å drepe gram-positive bakterier inkludert mykobakterier, protazoans slik som Plasmodium falciparum, og parasitter som er ansvarlige for fjærfe sykdommen coccidiosis. Det er også ofte matet til drøvtyggere for å forbedre næringsopptak og mate effektivitet [4]; [5]. Denne gamle middel er nå en alvorlig anti-kreft legemiddel kandidat [6]; [7]. For det første har det vist seg at salinomycin selektivt inhiberer brysttumor stamceller, noe som antyder at den kan brukes som et anticancer stoff [8]. Salinomycin ble også identifisert som en selektiv hemmer av leukemi stamceller, osteosarkom stamceller samt kreft i bukspyttkjertelen stamceller [9]; [10]; [11].
Det er blitt rapportert at en rekke kreftbehandlinger, slik som gammastråling, cytotoksiske medikamenter, steroide antiinflammatoriske midler, markert øke ekspresjonsnivået av NSAID-aktiverte genet NAG-1 [12]. NAG-1, også kjent som Macrophage inhiberende cytokin (MIC-1), og vekst og differensieringsfaktor-15 (GDF-15), er et medlem av den transformerende vekstfaktor beta (TGF-β) super-familie som kan mediere apoptose indusert av ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler i celler som ikke uttrykker syklooksygenase [13]; [14]. Generelt, NAG-1 fungerer som en tumor suppressor protein ved å hemme tumorvekst og indusere apoptose i de tidlige stadier av kreft og flere studier viser nag1 induksjon bli assosiert med cellesyklus og apoptose [15].
studien undersøker effekten av salinomycin på overlevelse, kolonivekst, migrasjon og invasjon av differensierte human ikke-småcellet lungekreft celler LNM35 og A549 og potensialet implikasjon av NAG-en i disse effektene.
Materialer og metoder
Cell kultur og reagenser
Menneskelig lungekreftceller LNM35 [16] og A549 ble opprettholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Paisley, UK). Alle media ble supplert med antibiotika (penicillin 50 U /ml, streptomycin 50 ug /ml) (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrike) og med 10% føtalt bovint serum (FBS, BioWest, Nouaille, Frankrike). Salinomycin ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Falla, Frankrike).
Celleviabilitet
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 5000 celler /brønn i 96-brønners plater . Etter 24 timer ble cellene behandlet i ytterligere 24 og 48 timer med forskjellige konsentrasjoner av salinomycin (0,1-50 uM) i tre eksemplarer. Kontrollkulturer ble behandlet med 0,1% DMSO (medikamentet kjøretøy). Effekten av salinomycin på cellelevedyktigheten ble bestemt ved bruk av CellTiter-Glo Luminescent celleviabilitet assay (Promega Corporation, Madison, USA), basert på kvantifisering av ATP, som signaliserer tilstedeværelsen av metabolsk aktive celler. Den luminescerende signalet ble målt ved anvendelse av GLOMAX luminometer system. Resultatene ble presentert som proporsjonal levedyktighet (%) ved sammenligning av salinomycin-behandlede cellene med DMSO-behandlede celler, levedyktigheten av disse er antatt å være 100%.
Caspase 3/7 aktivitet
celler ble sådd med en tetthet på 5000 celler /brønn i 96-brønners plate og behandlet med salinomycin (10 og 50 uM) i 24 timer, i tre eksemplarer. Kontrollceller ble utsatt for DMSO ved en konsentrasjon ekvivalent med den av de salinomycin-behandlede celler (0,1% DMSO). Caspase-3/7 aktivitet ble målt ved hjelp av en selvlysende caspase-Glo 3/7 analysesett følge produsentens instruksjoner (Promega Corporation, Madison, USA). Caspase-reagens ble tilsatt og platen ble blandet og inkubert i 2,5 timer ved romtemperatur. Luminescens ble målt ved anvendelse av et luminometer GLOMAX system.
myk-agar-kolonivekstanalyse
Et lag av agar inneholdende 1 ml 2,4% lav smeltetemperatur Noble agar oppløst i destillert vann ble helt over i brønner av en 6-brønners cellekulturskål og fikk stivne ved 4 ° C i 5 minutter og deretter inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Et andre lag (2,9 ml) inneholdende 0,3% lavtsmeltende Noble agar oppløst i vekstmedium inneholdende celler (5 x 10
3 celler /ml) ble plassert på toppen av det første lag og tillatt å sette ved 4 ° C i 5 minutter og deretter overføre dem til en fuktet inkubator ved 37 ° C i 30 minutter til 1 time. Vekstmedium (2 ml) ble lagt på toppen av det annet lag, og cellene ble inkubert i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 14 dager, og deretter behandlet i ytterligere 7 dager med salinomycin (2,5 og 5 uM). Kontrollceller ble utsatt for 0.1% DMSO. Medium ble endret to ganger i uken. Ved slutten av forsøket ble kolonier farget i 1 time med 2% Giemsa beis, og inkubert over natten med PBS for å fjerne overskudd av Giemsa beis. Koloniene ble fotografert og scoret. Resultatene ble presentert som proporsjonale kolonier (%) ved sammenligning av de salinomycin-behandlet kolonier med DMSO-behandlede kolonier, koloniene av disse er antatt å være 100%.
sårheling motilitet assay
LNM35 og A549-celler ble dyrket i seks-brønners vevskulturskåler inntil sammenflytende. Kulturer ble inkubert i 10 minutter med Moscona buffer. En skrape ble gjort gjennom konfluent monolag med en plastpipette spiss med en diameter på 1 mm. Etterpå ble de retter vasket to ganger og inkubert ved 37 ° C i friskt RPMI inneholdende 10% føtalt kalveserum i nærvær eller fravær av de ikke-toksiske konsentrasjoner av salinomycin (0,1-0,5 mm) for A549 og salinomycin (0,05-0,1 pM ) for LNM35 celler. Kontrollceller ble utsatt for 0.1% DMSO. På undersiden av hver tallerken, ble to vilkårlige steder merkes hvor bredden av såret ble målt med et invertert mikroskop (objektiv x 4). Motilitet ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av differansen mellom målingene ved 0, 6, 24 og 30 timer etter sår.
Matrigel invasjon assay
invasivitet av lungekreftceller LNM35 behandles med salinomycin (0,05-0,1 mm) og A549 celler behandlet med salinomycin (0,1-0,5 mikrometer) ble testet ved hjelp av BD Matrigel invasjonen Chambers (8-mikrometer porestørrelse, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrike) i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble celler (1 x 10
5-celler i 0,5 ml medium og den indikerte konsentrasjon av salinomycin) ble podet inn i de øvre kamrene i systemet, de nederste brønner i systemet var fylt med RPMI supplert med 10% føtalt bovint serum som en chemo-lokkemiddel og deretter inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Kontrollceller ble utsatt for 0.1% DMSO. Ikke-inntrengende celler ble fjernet fra den øvre overflaten av filteret med en bomullspinne. Celler som har migrert gjennom Matrigel ble fiksert med 4% formaldehyd, farvet med DAPI og tellet i 25 tilfeldig feltene under et mikroskop. Analysen ble utført i duplikat, og gjentatt tre ganger for kvantitativ analyse. Resultatene ble presentert som proporsjonal invasivitet (%) ved sammenligning av salinomycin-behandlede cellene med DMSO-behandlede celler, invasjonen av disse er antatt å være 100%.
PCR-amplifikasjon for NAG-1 mRNA
Isolering av total RNA fra celler som ble utført ved anvendelse av en Maxwell 16 Forskning System (Promega) med en total RNA rensing kit (Promega) ifølge produsentens instruksjoner. Konsentrasjonen og renheten av RNA-prøvene ble bestemt ved å måle absorbans ved 260 nm (A260) og forholdet mellom absorbans ved 260 nm og 280 nm (ND-1000, Nanodrop Technologies Inc, Wilmington, DE, USA).
Gene Expression analyse ble utført ved anvendelse av to trinn RT-PCR-reaksjonen. For det første Totalt RNA ble omdannet til cDNA ved bruk av en høykapasitets-cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, integrerte Gulf Biosystems, Dubai, FAE # 4374966) ved en sluttkonsentrasjon på 50 ng RNA i en 20 pl PCR-reaksjon med 10 x RT-buffer 2,0 pl , 25 × dNTP Mix (100 mm) 0,8 mL, 10 × RT Tilfeldige Grunning 2,0 gl, MultiScribe ™ revers transkriptase 1,0 pl RNase inhibitor 1,0 mL, nukleasefritt vann 3,2 mL. Revers transkripsjon ble utført på en termocykler Veriti (Life Technologies), ved hjelp av følgende parametere: 25 ° C i 10 min, 37 ° C i 120 min, og 85 ° C i 5 minutter. Kvantitativ real-time PCR-analyse for det aktuelle genet ble utført i tre eksemplarer på en rask ABI Prism 7900HT sekvens detection system (Life Technologies) ved hjelp av en forhånds Taqman genuttrykk analyse for NAG-en (GDF15 Life Technologies # Hs00171132_m1) og Human hypoxantin fosforibosyl transferase (Hprt1 rRNA) som endogen kontroll (Life Technologies # 4326321E). Fra den fortynnede cDNA ble 4 mL (20 ng) brukes som en mal i en 10 mL singleplex PCR reaksjon inneholder 2X TaqMan ® Rask Universal PCR Master Mix, No AmpErase ® UNG (5 mL) (Life Technologies # 4352042), 20 × TaqMan® Gene Expression analyse (0,5 mL), RNase fritt vann 0,5 mL. PCR termiske Syklusparametrene ble kjørt i rask modus som følger 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 20 s etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C i 1 s og 60 ° C i 20 sek. Resultatene ble opprinnelig analysert med ABI Prism 7900HT SDS program v2, 4, ble alle gjenværende beregninger og statistisk analyse utført av SDS RQ Manager-1.1,4 programvaren ved hjelp av to-ΔΔCt metoden med en relativ kvantifisering RQmin /RQmax tillit satt til 95%
uttrykk for den pro-apoptotiske proteiner NAG-en
LNM35 og A549 celler ble sådd i 100 mm retter på 3 × 10
6 celler /fatet i 24 timer, og med økende konsentrasjoner av salinomycin (1-50 uM) i ytterligere 24 timer. Kontrollceller ble utsatt for 0.1% DMSO. Totale celleproteiner ble isolert ved anvendelse av RIPA-buffer (25 mM Tris * HCl pH 7,6, 1% Nonidet P-40, 1% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 0,5% protease-inhibitorer cocktail, 1% PMSF, 1% fosfatase-inhibitor cocktail) fra kontroll og behandlede celler. Hele cellelysat ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 14.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C for å fjerne uoppløselig materiale og 30 ug av proteiner ble separert ved SDS-PAGE-gel for NAG-1-ekspresjonen (Cellular Signaling Technology, MA, USA). Etter elektroforese ble proteinene overført på en nitrocellulosemembran, blokkert med 5% ikke-fettmelk og probet med NAG-1 (1:200) og β-aktin (1:1000) antistoff over natten ved 4 ° C. Blottet ble vasket, utsatt for sekundære antistoffer og visualisert ved hjelp av ECL-systemet (Pierce).
Etablering av stabile NAG-en stanse i lungekreftceller og dens innvirkning på hemming av celle levedyktighet og invasjon indusert av salinomycin
A549-celler ble sådd ut ved en tetthet på 20.000 celler /brønn i 96-brønners plater i nærvær av serum og latt bli koblet i 24 timer. Cellene ble transfektert med tre ulike utførelser av SMARTvector 2,0 Lentiviral shRNA partikler rettet mot NAG-en eller SMARTvector 2.0 Non-målretting kontroll partikler (Dharmacon Thermo Scientific, USA) som inneholdt en puromycin motstand genet for seleksjon og GFP for identifisering av positive kloner og bassenger til kloner. Valg av celler som stabilt uttrykker NAG-en shRNA og kontroll shRNA startet 72 timer etter transfeksjon følge produsentens instruksjoner (Dharmacon Thermo Scientific, USA). I korthet, ble vekstmedium aspirert fra cellene og erstattet med friskt seleksjonsmedium inneholdende 10 ug /ml puromycin. Puromycin holdig medium ble erstattet hver 2-3days med nylagde utvalg medium, og valg av stabile celler som uttrykker nag1-shRNA eller Ctrl shRNA ble gjennomført i ca 4 uker fra begynnelsen av utvalget. Flere kloner og bassenger til kloner ble utvidet, og GFP positive bassenger av kloner ble analysert ved hjelp av western-blot for å undersøke uttrykket av NAG-en etter behandling med salinomycin fem mikrometer. Deretter undersøker vi invasivitet og levedyktigheten til A549 celler uttrykker nag1-shRNA eller Ctrl shRNA svar på salinomycin.
statistikker
Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av det antall eksperimenter. Forskjellen mellom forsøks- og kontroll-verdier ble bestemt ved ANOVA etterfulgt av Dunnetfs post-hoc multiple sammenligningstest. P 0,05 indikerer en betydelig forskjell
Resultater
Salinomycin hemmer lungekreft celleviabilitet
Eksponering av LNM35 (figur 1A.) Og A549 (Figur 1b.) Celler til. salinomycin konsentrasjoner (0,1-50 uM) i 24 eller 48 timer ble redusert cellelevedyktighet i treringstrinnet og tidsavhengig måte. IC
50 konsentrasjoner på 24 timer var i området fra 5 til 10 uM salinomycin for begge cellelinjer. Etter 48 timers behandling, IC
50 konsentrasjon redusert til området fra 1,5 til 2,5 uM salinomycin med 90% inhibering av cellelevedyktighet i begge celler ved en konsentrasjon på 50 uM.
Eksponensielt voksende LNM35 (A , C) og A549 (B, D) -celler ble behandlet med bærer (0,1% DMSO) eller de indikerte konsentrasjoner av salinomycin. Det venstre panelet representerer 24 timers eksponering, mens det høyre panelet representerer 48 timers eksponering. Levedyktige celler ble analysert som beskrevet i Materialer og Metoder. Induksjon av caspase-3/7-aktivitet ble analysert i LNM35 (E) og A549 (F) celler behandlet i 24 timer med salinomycin (10 og 50 uM), normalisert til antallet levedyktige celler pr brønn og uttrykt som gangers induksjon sammenlignet med kontrollgruppen. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. * Signifikant forskjellig på P 0,05, ** Signifikant forskjellig på P 0,01, *** Signifikant forskjellig på P . 0.001
Aktivering av caspase-3/7 er viktig i celledød ved apoptose trasé og ble analysert i LNM35 og A549-celler behandlet i 24 timer med salinomycin (10-50 pM), og normalisert til antall celler per brønn. Caspase 3/7 aktivitet har økt med mer enn 17 ganger i LNM35 celler (figur. 1C) og 12 ganger i A549 celler (figur. 1D), etter eksponering for Salinomycin 50 mikrometer. Dette indikerer at salinomycin indusere celledød gjennom en caspase 3/7 assosierte veien.
Salinomycin svekker koloni vekst i myk agar
Salinomycin sterkt hemmet LNM35 (figur. 2A, 2C) og A549 ( fig. 2B, 2D) kolonivekst i bløt-agar på en konsentrasjonsavhengig måte.
LNM35 (A) og A549 (B) celler ble dyrket ved en tetthet på 5000 celler /brønn i bløt agar medium inn i 6-brønns plater. Etter 14 dager ble dannet kolonier ble behandlet i 7 dager med forskjellige konsentrasjoner av salinomycin (2,5 og 5 uM). På slutten kolonier ble farget med Giemsa og scoret. Representative bilder av koloniene dannet i myk agar fra LNM35 (C) og A549 (D) ble fotografert.
Salinomycin svekker lungekreft celle migrasjon og invasjon
lungekreftpasienter er over høy risiko for utvikling av metastasering, som starter med celle migrasjon i den primære tumor, som fører til lokal invasjon vev og trer i lymfe eller blodkarene og til slutt kolonisering av fjerntliggende organer. Evnen til salinomycin å redusere mobilnettet migrasjon ble undersøkt ved hjelp av sårhelende modell. Salinomycin redusert cellulær migrering av LNM35 (fig. 3A) og A549 (fig. 3B) celler i en treringstrinnet og tidsavhengig måte. På samme måte, salinomycin svekket invasjonen av LNM35 (fig. 3C) og A549 (fig. 3D) celler i matrigel invasjon analysen. Salinomycin inhibering av cellulær migrering og invasjon matrigel skjedd uten betydelig reduksjon av cellenes levedyktighet (fig. 1).
Sår ble innført i LNM35 (A) og A549 (B) konfluente monosjikt dyrket i nærvær eller fravær (kontroll) av salinomycin (0,05-0,5 pM). Den midlere avstand at cellene reist fra kanten av skrapet området på 6, 24 og 30 timer ved 37 ° C ble målt på en blindet måte, ved hjelp av et invertert mikroskop. C) LNM35 cellene ble inkubert i 24 timer i nærvær eller fravær av salinomycin (0,05-0,1 pM). D) A549 celler ble inkubert i 24 timer i nærvær eller fravær av salinomycin (0,1-0,5 mm). Celler som invaderte inn Matrigel ble scoret som beskrevet i materialer og metoder.
Salinomycin induserer NAG-1 mRNA og protein uttrykk
Først ble A549 celler eksponert for ulike konsentrasjoner av salinomycin ( 0,5-10 pM) i 2 24 timer og total RNA ble ekstrahert og undersøkt for NAG-1 mRNA-ekspresjon. Som vist i figur 4A, induserer salinomycin en markert tids- og konsentrasjonsavhengig induksjon av NAG-1 mRNA-ekspresjon med en ti ganger økning nås ved 24 timer etter eksponering for 10 uM salinomycin (fig. 4A). Deretter ble LNM35 og A549-celler eksponert for forskjellige konsentrasjoner av salinomycin (1-50 uM) i 24 timer og de totale proteiner ble evaluert med hensyn til NAG-1-ekspresjon. I begge LNM35 og A549-celler, induserer salinomycin en markert konsentrasjonsavhengig induksjon av NAG-1-protein ekspresjon (fig. 4B).
Celler ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av salinomycin, og total RNA ble ekstrahert etter 2 og 24 timer og analysert med hensyn til NAG-1-mRNA-ekspresjon i A549-celler (A) og etter 24 timer for protein ekspresjon i både A549 og LNM35-celler (B).
NAG-en stanse oppheve anti- invasiv virkning av salinomycin
Som vist i figur 5A, stanse av NAG-1 (NAG-1-shRNA1) reversert induksjon av NAG-1 proteinekspresjon etter behandling med 5 uM av salinomycin. Lignende resultater ble oppnådd med de to andre utførelser av shRNA (NAG-1-shRNA2 og NAG-1-shRNA3) (data ikke vist). Selektiviteten av denne lyddemping ble bekreftet ved det faktum at ingen innvirkning på NAG-1-protein-ekspresjon ble observert i celler transfektert med shRNA kontroll partikler (kontroll-shRNA) i sammenligning med de ikke-transfekterte celler. Stanse av NAG-1-induksjon ved bruk av tre ulike utførelser av NAG-1-shRNA (1, 2 og 3) ikke klarte å redusere muligheten for salinomycin til induserte A549 celledød (figur 5B), men fullstendig reversert anti-invasiv effekt av salinomycin (figur 5C). Alle sammen, disse resultatene sterkt at NAG-en formidler anti-invasiv, men ikke celledød effekten av salinomycin.
stanse av NAG-en undertrykket økt uttrykk av NAG-en indusert av salinomycin (A ) uten effekt på inhibering av A549 cellelevedyktigheten indusert av salinomycin (B) som fører til fullstendig undertrykkelse av anti-invasiv potensialet av salinomycin (C).
diskusjon
Lungekreft er den vanligste typen kreft over hele verden og har også den høyeste dødeligheten. Det var 1,61 millioner tilfeller av lungekreft (12,7% av total kreftbyrden) i 2008 med 1,38 millioner dødsfall (18,2% av alle kreftdødsfall) i samme år [17]. Dessverre, til tross for fremskritt innen molekylær biologi for lungekreft, bedre diagnose og til og med optimale målrettet terapi, de nåværende protokoller for behandling av lungekreft er fortsatt utilstrekkelig til å gi klare og vedvarende kliniske fordeler og herdingen av lungekreftpasienter forblir mislykket. Pasienter ofte utvikler resistens mot dagens målrettede terapi narkotika og disse stoffene er også svært kostbart og ikke tilgjengelig for de fleste lungekreftpasienter i verden [18].
I denne studien undersøkte vi effekten av salinomycin på to differensierte humane ikke-små lungekreftceller (LNM35 og A549) overlevelse, kolonivekst, migrasjon og invasjon og den potensielle rolle NAG-en i de potensielle anti-kreft effekt av salinomycin.
salinomycin ( 0,1-50 pM) ble redusert levedyktighet av LNM35 og A549-celler differensieres i en treringstrinnet, tidsavhengig og caspase-assosiert måte. Disse resultater er på linje med tidligere publiserte resultater som viser at lave konsentrasjoner av salinomycin hemme levedyktigheten av brystkreft stamceller, leukemi stamceller, osteosarkom stamceller, så vel som kreft i bukspyttkjertelen stamceller [8]; [9]; [10]; [11]. Under utarbeidelsen av denne studien, en annen gruppe demonstrerte mot kreft aktiviteter salinomycin
in vitro
mot stamcelle sub-populasjon i A549 celler [19]. For å bekrefte denne anticancer virkning av salinomycin, undersøkte vi dets virkning på veksten av etablerte kolonier. Vi demonstrerte at syv dagers behandling med lav konsentrasjon av salinomycin sterkt inhibert LNM35 og A549 kolonivekst i bløt agar. Disse resultatene
in vitro
er på linje med andre studier som viser at salinomycin hemmer brystkreft, osteosarkom, bukspyttkjertelkreft, så vel som leverkreft vekst hos mus [8]; [10]; [11]; [20]. Dosene av salinomycin som brukes i disse
in vivo
studiene var mellom 4 og 8 mg /kg /IP som er lavere enn den LD
50 dose av salinomycin som var 18 mg /kg intra-peritonealt og 50 mg /kg oralt [4]. Alt sammen tyder på at salinomycin kan være en gyldig og trygt middel mot kreft og videre studier vil avgjøre effekten av lavdose av salinomycin på LNM35 og A549 tumorvekst
in vivo
i nakne mus.
i denne studien, bare den høyeste konsentrasjonen av salinomycin (50 uM) var i stand til å indusere en aktivering av kaspase 3/7 fører til celledød både i lungecancerceller LNM35 og A549. Disse resultatene er i tråd med vår nylig publisert arbeid viser at høy konsentrasjon av salinomycin (50 mm) induserte en aktiverings caspase 3/7 og PARP cleavage fører til apoptose av brystkreftceller MDA-MB-231 [21]. Men begge studier av lungekreftceller og tidligere publisert studie på brystkreftceller viser at lave konsentrasjoner av salinomycin (≤10 uM) resulterte i mer inhibering av celleproliferasjon i stedet for celledød [21]. Tilsvarende har det blitt demonstrert at salinomycin hemmer proliferasjon og incudes apoptose av humane leverkreft [20].
Cancer progresjon er forbundet med oppheving av de normale kontroller som begrenser cellemigrering og invasjon, til slutt fører til metastase. Siden metastaser er den viktigste dødsårsaken hos kreftpasienter, er utviklingen av nye behandlingsregimer som reduserer invasjon og metastase svært viktig for kreftbehandling. I denne sammenheng, demonstrerte vi at salinomycin induserte en meget betydelig tids- og konsentrasjonsavhengig inhibering av cellemigrering og invasjon
in vitro
av de to differensierte lungecancercellelinjer LNM35 og A549. Disse resultatene er i samsvar med tidligere studier som viser at salinomycin selektivt hemmer brystkreft stamceller metastaser
in vivo product: [8] og prostata kreft celle migrasjon
in vitro product: [22].
anti-kreft molekylære virkningsmekanisme salinomycin er blitt undersøkt i flere studier. I denne sammenheng har det blitt demonstrert at salinomycin er et effektivt antikreftmiddel som indusert apoptose i humane kreftceller er uavhengig av tumor suppressor protein p53 og caspaser aktivering [9]. Disse resultatene er i overensstemmelse med våre nylig studie viser at salinomycin betydelig redusert levedyktighet av villtype p53 MCF-7 og T47D samt mutant p53 MDA-MB-231 og T47D humane brystcancercellelinjer i tids- og konsentrasjonsavhengig oppførsel [21]. Det ble også vist at salinomycin utløser apoptose av PC3 prostata kreftceller ved å heve det intracellulære ROS nivå, som fører til translokasjon av Bax protein til mitokondriene, cytokrom c frigjøring, aktivering av kaspase-3, og spaltning av PARP [23]. Salinomycin induserer også caspase avhengig celle-død i RKO, SW480 og SW620 tykktarmskreftceller [24]. Det er også blitt vist at salinomycin er en effektiv inhibitor av osteosarkomceller stamceller så vel som lymfocytiske leukemiceller delvis gjennom nedregulering av Wnt /μ-catenin selvfornyelse veien [10]; [20]; [25]. En annen studie viste at salinomycin hemmet prostatakreft cellevekst ved å redusere aldehyd dehydrogenase og kjernefysiske faktor-μB aktiviteter [22]. Tilsvarende har det blitt demonstrert at salinomycin inhiberer Akt /NF-kB vei som fører til apoptose i cisplatin-resistente eggstokkreft celler [26]. Det har også blitt vist at salinomycin induserer autofagi i tykktarm og bryst kreft celler [24]. Økt fosforylering av DNA-skade-relaterte proteiner (f.eks pH2AX, p53BP1, pBRCA1, pChk1) proteiner indikerer større DNA-brudd og skader [27]. Salinomycin øker DNA-trådbrudd og induserer fosforylering av DNA-skade-relatert protein, H2AX [28].
NSAID-aktiverte genet (NAG-1, GDF-15, og MIC-1) blir indusert ved flere apoptose-induserende midler i tykktarm, prostata, og lungekreftceller [15]; [29]. NAG-1 var involvert i den synergistisk induksjon av apoptose ved kombinert behandling av natriumsalicylat og PI3K /MEK1 /2 inhibitorer i A549 humane lunge adenokarsinom-celler [30]. De NAG-1 ekspresjonsnivåer vesentlig økning i kreftceller, serum, og /eller spinalfluid under progresjonen av forskjellige humane aggressive kreftformer, som intrakraniale hjernesvulster, melanom, gastrointestinal, bukspyttkjertelen, kolorektal, prostata, bryst og lunge epiteliale kreftformer . Klinisk interesse, har en forbedret NAG-1 uttrykk er positivt korrelert med dårlig prognose og pasient overlevelse [29]; [30]; [31]; [32].
Vi antok at NAG-en er involvert i anti-kreft effekt av salinomycin og vi demonstrert for første gang at Salinomycin indusert en klar tids- og konsentrasjonsavhengig induksjon av NAG-1 uttrykk . Vi har også tydelig vist at NAG-1 bidrar til hemming av lungekreft celle invasjon, men ikke for induksjon av celledød mediert av salinomycin. I motsetning til dette er det blitt rapportert at NAG-1-ekspresjonen var assosiert med en mer invasive magekreft cellelinje fenotype og kan forårsake økt magekreftcelle invasjon
in vitro product: [33].
Det har blitt vist at salinomycin forbedre effektiviteten av gemcitabin å utrydde kreft i bukspyttkjertelen [11]. Salinomycin sensitizes også brystkreftceller til virkningene av doxorubicin og etoposid behandling ved å øke DNA-skade [28]. I samme forbindelse, kombinasjonsbehandlingen av oktreotid modifisert paclitaxel aktive rettet mot miceller og Salinomycin passive rettet mot miceller forbedre behandlingen av brystkreft gjennom å utrydde brystkreft celler sammen med brystkreft stamceller [34]. Tilsvarende kombinasjonsterapi av trastuzumab og salinomycin var overlegen i forhold til enkelt behandling med hvert medikament i behandlingen av HER2-positiv brystcancerceller, så vel som brystcancer stamceller [35]. Vi har nylig rapportert
in vitro
, som salinomycin var også i stand til å forsterke kreft effekter av 4-Hydroxytamoxifen og frondoside A på brystkreftceller MCF-7 og MDA-MB-231 henholdsvis [21]. Bygger på disse nevnte resultatene, og vite fra kliniske forsøk som monoterapi behandlinger sjelden resultere i kliniske fordeler for kreftpasienter, og at kombinasjonsterapi er i vanlig nødvendig for effektiv behandling av svulster, vi undersøkte den terapeutiske fordelen med kombinasjon av cisplatin, (en første linje terapeutisk for lungekreft), med salinomycin i både LNM35 og A549-celler. Dessverre fant vi at cisplatin var ikke i stand til å forbedre hemming av tumorceller lunge levedyktighet indusert av salinomycin (Attoub et al, upubliserte data).
Den nåværende funn identifiserer salinomycin som en lovende ny terapeutisk middel, ikke bare for uttømming av kreft stamceller, men også for de differensierte lungesvulster
takk
Vi takker Dr. Katarina Hostanska fra institutt for Complementary Medicine.; Universitetssykehuset Zurich, Sveits for å gi A549 celler.
