Abstract
Kliniske data indikerer at prognostisk lagdeling av radikalt resected tykktarmskreft basert på sykdom scenen bare kan ikke alltid være tilstrekkelig. Prekliniske funn tyder på at kreftstamceller kan påvirke det biologiske oppførsel av tykktarmskreft uavhengig av scenen: Hensikten med studien var å vurdere om et panel av stemness markører ble korrelert med klinisk utfall i resected stadium II og III tykktarmskreftpasienter. Et panel av 66 markører for stemness ble analysert og således pasientene ble delt inn i to grupper (A og B) med de fleste pasienter clustering på en måte som er forenlig med forskjellig tid til tilbakefall ved hjelp av en statistisk algoritme. I alt 62 pasienter ble analysert. Trettiseks (58%) fikk tilbakefall i løpet av oppfølgingsperioden (range 1.63-86.5 måneder). Tolv (19%) og 50 (81%) av pasientene ble allokert til gruppe A og B, respektivt. En vesentlig forskjellig median tilbakefall overlevelse ble observert mellom de 2 gruppene (22.18 vs 42,85 måneder, p = 0,0296). Blant alle gener testet, de med høyere «vekt» for å bestemme annen prognose var CD44, Alcam, DTX2, HSPA9, CCNA2, PDX1, MYST1, COL1A1 og ABCG2. Denne analysen støtter ideen om det, annet enn scenen, biologiske variabler, for eksempel uttrykk nivåer av tykktarmskreft stamcelle gener, kan være relevante ved fastsettelse økt risiko for tilbakefall i resected pasienter med kolorektal kreft
Citation. Giampieri R, Scartozzi M, Loretelli C, Piva F, Mandolesi A, Lezoche G, et al. (2013) Cancer Stem Cell Gene profil som prediktor for tilbakefall hos High Risk Stage II og trinn III, Radikalt resected Colon kreftpasienter. PLoS ONE 8 (9): e72843. doi: 10,1371 /journal.pone.0072843
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 18 mars 2013; Godkjent: 16 juli 2013; Publisert: 04.09.2013
Copyright: © 2013 Giampieri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av AIRC (italiensk Association of kreftforskning). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kirurgi er fortsatt bærebjelken i behandling av ikke-metastatisk kolorektal kreftpasienter og i ca 50% stadium III resected pasienter, helbrede oppnås ved kirurgi alene. Adjuvant behandlingsstudier som MOSAIC [1] eller XELOXA rettssaken [2] viste at kombinasjonskjemoterapi med 5-FU /Capecitabine og oksaliplatin gir en overlevelsesfordel i de områder av 10-15% for stadium III resected pasienter.
i stadium II pasienter, data er enda mer begrenset: adjuvant kjemoterapi er vanligvis foreskrevet på grunnlag av risikofaktorer eller «onkolog valg»: andelen av scenen II pasienter inkludert i kliniske studier er for liten til å gjøre definitive forutsetninger om nytten av adjuvant behandling i denne undergruppen av pasienter [3] -. [5]
hittil har TNM staging system kategoriene er den mest pålitelige måten å håndtere pasientenes risiko for tilbakefall for beslutninger om klinisk ledelse. En mulig rolle for kreft stamceller har vært foreslått som potensielle prediktor for høy risiko for tilbakefall i resected pasienter med kolorektal kreft. Disse cellene har blitt identifisert som prediktor for dårlig resultat og antydet å ha en rolle i progresjon av kreft og utvikling av metastaser, muligens som en konsekvens av deres hypotetisk høy replikasjonspotensial [6], [7].
kanonisk, kolorektal kreft stamcelle befolkningen kan i hovedsak deles inn i 2 hovedklasser: en typisk subtype av kolorektal kreft stamceller, vanligvis identifisert av CD133 positive flekken og en heterogen befolkning av ikke-CD133 positive stamceller. Men begge klasser synes å ha en like effektiv evne til å spre seg under visse vilkår [8] – [10]. På grunn av deres biologiske egenskaper kreftstamceller representerer en nesten ubegrenset ressurs for tumorvekst og progresjon og er tenkt å være ansvarlig for å opprettholde en slags beskyttet reservat nisje for kreftceller. En ytterligere eiendommelighet kreft stamceller er deres relative evne til å unnslippe kjemoterapi-indusert celledød, og dermed forsterke sin rolle som en selvfornyende kreftceller kilde for svulster [11] – [13]
Basert på disse. forutsetninger vi kan hypoteser som kreftstamcelle befolkningen kan være ansvarlig for de biologiske egenskapene til kreftceller og kan til slutt påvirke klinisk oppførsel av solide svulster selv under cellegiftbehandling.
i en tidligere analyse av Gerger et al. [14] forfatterne var i stand til å identifisere felles kreftstamcelle genvarianter som prediktive faktorer for tilbakefall i radikalt resected tykktarmskreftpasienter. I denne studien kimlinje-polymorfismer av et begrenset antall av mulige stamceller markører er blitt analysert. Men det er mulig at stamcelle-genet profil i tumorer kan avvike fra det som kan observeres ved kimlinje-nivå. Videre stamcelle genekspresjon i tumorer kan også være biologisk relevant.
I vår studie vi vurdert om et panel av 66 gener, er angitt å ha en rolle i vekst og proliferasjon av tykktarmskreft stamceller, kan gjøre det mulig å lage et mer nøyaktig anslag på sannsynligheten for tilbakefall i resected ikke-metastaserende tykktarmskreftpasienter. Det endelige målet var å identifisere en stemness baserte risikokategori og for å indikere mulige stamceller-koblede molekylære mål for fremtidig utvikling av stamcellestyrt behandlingsstrategier.
Materialer og Metoder
Pasienter Selection
Radikalt resected kolon kreftpasienter som får adjuvant kjemoterapi ved vår avdeling 2005-2007 ble ansett kvalifisert for vår studie.
pasienter skal ha presentert enten med en klinisk definert høy risiko stadium II eller med en stadium III helt resected kolon svulsten
Høy risiko stadium II ble definert i nærvær av minst ett av følgende:. pT4, dårlig differensiert histologi, tarmobstruksjon eller perforering på presentasjonen, histologisk påvist vaskulær, lymfatisk eller perinevral invasjon . Vi ekskludert fra analyse pasienter som får kjemoterapi adjuvant utelukkende på grunnlag av en ikke tilstrekkelig lymfeknute sampling (lymfeknute prøvetaking mindre enn 12).
Hver enkelt middel 5-FU (eller kapecitabin) eller 5-FU (eller kapecitabin) i kombinasjon med oksaliplatin ble ansett som akseptable alternativer. Oppfølging skjedde i henhold til institusjonelle retningslinjer. Historie, fysisk undersøkelse, en komplett blodprosent, CEA og CA 19-9 besluttsomhet ble utført på tre-måneders intervaller i tre år, og deretter ved seks måneders intervaller på år 4 og 5 etter operasjonen. CT av brystkassen og magen ble gjort hver 6. måned ved årets 1 til 3 og årlig deretter ved år 4 og 5. kolonoskopi ble gjennomført ved utgangen av året en og deretter hver 3 og 5 år. Området og dato for første tilbakefall og dødsdato ble registrert. For studieformål pasientenes data ble retrospektivt analysert. Denne studien ble godkjent av vår Institutional Etisk Komité (Comitato Etico Azienda Ospedaliera – Ospedali Riuniti, Ancona, Via Conca 71, Italia). Alle pasienter ga sitt skriftlige samtykke til studiet.
Prøver Behandling og kvantitativ PCR-analyse
Gene uttrykk profilanalyse ble utført av laboratoriepersonell blindet for pasientens status.
Multiple deler av formalinfikserte, parafininnstøpte vevsblokker (25 til 30 mg av primærtumor, manuell microdissected vev) ble oppsamlet; parafinvoks ble fjernet og total RNA ble ekstrahert ved RT
2 FFPE RNA Extraction Kit (SABiosciences Corporation, Frederick, MD, USA), etter produsentens anvisninger. RNA-prøvene ble kvantifisert og kvalitets testet for tilstedeværelse av protein og /eller organiske løsemidler forurensninger ved en spektrofotometrisk assay.
Fem hundre nanogram fra hver prøve ble reverstranskribert til cDNA og pre-amplifisert ved å bruke RT2 FFPE forforsterker cDNA Synthesis Kit og primer mix spesifikke for den tilpassede Stem Cell RT2Profiler PCR Array (SABiosciences Corporation).
Kvantitativ real Time PCR-analyse ble utført på en 7300 real-Time PCR System (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA) ved en SYBR® grønn metode. Target og referanse gener og kontroller som er valgt for analyse av genuttrykk kom fra stamcelle genene satt av stamceller RT2Profiler PCR Array (# CAPH09495-PAHS-405, SABiosciences Corporation). Også på grunn av mangel på standard PCR rekke stamcelle genmarkører mer riktig å kolorektal kreft stamceller, de spesifikke gener Alcam (også kjent som CD166), PROM1 (CD133), CD24 og LGR5 ble lagt til.
En fullstendig liste over de genene som ble testet kan finnes i tabell 1.
data Processing and Statistical Analysis
Relativ genekspresjon ble kvantifisert ved hjelp av komparative ΔCt metoden. Vi brukte funksjonen «PCR Array Data Analysis Web Portal» (https://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php) på produsentens nettsted for å utføre datakvalitet tester, beregninger på qPCR data og data normalisering. Særlig alle terskel sykluser verdier større enn 35, eller ikke oppdages, ble ansett som negativt anrop. Vi beholdt prøver med negativt genomisk DNA-kontroll, klar revers transkripsjon kontroll og positive PCR kontrollverdier, i henhold til produsentens angivelser.
For å evaluere ulike mønstre av genuttrykk, gjennomførte vi clustering analyse av K-midler (K = 2 ) metoden [15]. Dette bestemte clustering analyse algoritmen ble valgt til å teste det muligens kan finnes 2 forskjellige mønstre av genuttrykk, knyttet til forskjellig prognose. Tar spesielt sikte på K-midler metode for å danne forhåndsdefinert antall (K) fordeles i en klynge av forskjellige observasjoner i et datasett, ved fremgangsmåten ifølge den nærmeste middelverdien. Clustering analysene ble utført ved MEV (MultiExperiment Viewer) verktøyet.
Statistisk analyse ble utført med MedCalc Package (MedCalc® v9.4.2.0)
primære endepunktet i studien var å identifisere mellom 2 prognostiske grupper en signifikant forskjell i median tid til tilbakefall (TTR), beregnet som intervall fra diagnosedato til dato for svulst tilbakefall. TTR ble sensurert på tidspunktet for død eller siste oppfølging hvis pasienten ikke fikk tilbakefall.
I den primære hypotesen om at pasienter med reseksjon av høy-risiko stadium II-stadium III kolorektal kreft har omkring 60% tilbakefall-fri risikoen ved 2-års observasjon tid og at pasienter med dårlig prognostisk poengsum har 30% tilbakefall fritt risiko på 2-år, forutsatt at alfa-sannsynlighet feil på 0,05 og beta-sannsynlighet feil på 0,10, er et minimum av 53 pasienter måtte teste hypotesen.
Sammenhengen mellom TTR og kreft stamcelle genetiske profilen ble anslått av Kaplan-Meier metoden. Signifikante forskjeller i sannsynligheten for tilbakefall mellom lagene ble evaluert av log-rank test
For hvert gen identifisert ved k-means analyse det ble senere evaluert sammenhengen med tid til tilbakefall. Medianen av den samlede spesifikke gen konsentrasjon ble anvendt som kuttes, på grunn av mangel på andre mer pålitelige og reproduserbare midler til estabilish en skikkelig cut-off.
Resultatene
i alt 62 pasienter ble analysert. Blant dem, 36 hadde en trinn II tarmkreft (58%), mens de resterende 26 (41%) hadde et stadium III sykdom (tabell 2). Median oppfølgingstid var 44 måneder (variasjons 12.5-86.5 måneder). I løpet av denne oppfølgingsperiode 36 (58%) av pasientene tilbakefall.
Blant 26 trinn III pasienter, 10 (38%) tilbakefall i løpet av oppfølgingsperioden, mens i de resterende 36 trinn II pasienter, 26 (72%) tilbakefall ble sett.
median TTR for stadium II pasienter var 23,3 måneder, mens median TTR ikke ble nådd for stadium III pasienter. Denne forskjellen var ikke statistisk signifikant (p = 0,0696).
Ved utførelse av K-betyr analyse (K = 2), gener som hadde en viktig rolle i å bestemme fordelingen inn i en av de 2 forutbestemte grupper var CD44 (p = 0,0004), Alcam (p = 0,003), DTX (p = 0,005), HSPA9 (p = 0,012), CCNA (p = 0,03), PDX1 (p = 0,04), MYST1 (p = 0,04), COL1A1 ( p = 0,03), ABCG2 (p = 0,04). En sammenligning av de forskjellige former for ekspresjon av disse gener i gruppe A og B kan bli funnet i Figur 1.
Forskjellige genekspresjon menes mellom pasienter med radikalt resekterte tykktarmskreftpasienter som viser en ugunstig kreft stamcelle-genet profil, GROUP A, (rød) og radikalt resected tykktarmskreftpasienter som viser en gunstig kreftstamcelle genet profil, GRUPPE B (blå) som stratifisert etter K-midler (K = 2) metoden.
etter clustering analyse to grupper av pasienter ble identifisert. gruppe A (ugunstig kreftstamcelle genet profil) og gruppe B (gunstig kreftstamcelle genet profil)
Tolv pasienter (19%) ble tildelt av K-betyr analyse inn gruppe A, mens de resterende 50 pasienter (81%) ble tildelt i gruppe B. i gruppe A, to fase III (17%) og 10 scene II (83%) av pasientene ble tildelt, mens i gruppe B de resterende 24 (48 %) stadium III og 26 (52%) stadium II pasienter ble tildelt. Alle de andre kliniske kjennetegn analysert resulterte godt balansert mellom de 2 gruppene (tabell 2).
Eleven (91%) pasienter i gruppe A tilbakefall i løpet av observasjonsperioden, mens 25 (50%) pasienter i gruppe B fikk tilbakefall i løpet av samme periode. Denne forskjellen var statistisk signifikant på chi-kvadrat test (p = 0,0214). En signifikant forskjellig median TTR mellom de 2 gruppene ble observert: 22,18 vs 42,85 måneder (HR: 0,46, 95% KI: 0,15 til 090, p = 0,02). (Figur 2)
Kaplan-Meier kurver for median Tiden for tilbakefall (TTR) av radikalt resected tykktarmskreftpasienter som viser en ugunstig kreftstamcelle genet profil, GRUPPE A (-) vs. radikalt resected tykktarmskreftpasienter som viser en gunstig kreftstamcelle genet profil, GRUPPE B (—- —) (22,1 måneder versus 42,8 måneder, p = 0,02).
Når du analyserer effekten av hver enkelt gen identifisert av K-betyr analyse tas enkeltvis, ingen signifikant sammenheng med median TTR var observert. En oppsummering av disse resultatene kan finnes i tabell 3.
Diskusjoner
Identifisere en undergruppe av radikalt resected, ikke-metastatisk kolorektalcancer hos pasienter som har høyere sannsynlighet for tilbakefall har dype implikasjoner. TNM staging system, selv om regnskap for svulst spredning som den viktigste faktoren som påvirker risikoen for tilbakefall ikke står for biologiske egenskaper selve svulsten.
En mulig rolle for kreftstamceller har vært en teori som potensiell prediktor for høy risikoen for tilbakefall i resected tykktarmskreftpasienter [6] – [13]. Disse cellene er vanligvis identifisert som predikator for dårlig utfall og antydet å ha en rolle i kreft progresjon og utvikling av metastaser. I vår analyse foreslo vi at kreftstamcelle genet profil kan være aktuelt å bestemme TTR i høy-risiko stadium II og trinn III radikalt resected colontumorer. Videre risikoen for tilbakefall i vår serie ikke virket korrelert med sykdom stadium, noe som tyder på at biologi mer enn scenen guider naturhistorie for tykktarmskreft. Ved utførelse av K-betyr analyse (K = 2), gener som hadde en viktig rolle i å bestemme fordelingen inn i en av de 2 forutbestemte grupper var CD44 (p = 0,0004), Alcam (p = 0,003), DTX (p = 0,005 ), HSPA9 (p = 0,012), CCNA (p = 0,03), PDX1 (p = 0,04), MYST1 (p = 0,04), COL1A1 (p = 0,03), ABCG2 (p = 0,04).
En rolle for CD44, Alcam, DTX, HSPA9, CCNA, PDX1, MYST1, COL1A1 og ABCG2 uttrykk påvirke tumorresultat, eventuelt gjennom interaksjon med stamceller befolkning, er blitt beskrevet separat i det siste, men dette er, så vidt vi vet , første gang at flere markører er kontrollert samtidig, bekrefter den relative betydningen av hver enkelt av dem.
Men blant de molekylære determinants dukket opp som viktige i vår studie, mener vi at resultatene av CD44, ABCG2 og CD133 bør diskuteres videre, spesielt på grunn av den biologiske eiendommelighet de besitter.
spesielt CD44 genuttrykk syntes å representere den viktigste faktoren som påvirker sannsynligheten for tilbakefall i vår gruppe resected pasienter. CD44 er også kjent som en reseptor for hyaluronsyre og har en viktig rolle i celler i stroma interaksjon [16] – [19]. Selv allerede rapportert som en prediktiv faktor for tilbakefall hos pasienter med kolorektal kreft, foreligger betydelig uenighet om den faktiske effekten av ulike nivåer av CD44 genekspresjon. I et tidligere arbeid av Huang et al. [20] stamceller tatt fra pasienter med kolorektal kreft ble evaluert for gen-ekspresjon av CD44 og CD133 og tumorer som bærer høyere nivåer av både CD44 og CD133 var relatert til økt risiko for utvikling av tidlig levermetastaser.
Tvert imot i et arbeid publisert av Dallas et al. [21] celler som ble utviklet for å være knock-down for CD44 uttrykk hadde nesten 10 ganger økning i metastatisk potensial i både lever og lunge. I tillegg til at CD44-negative celler utviste en større «mekanisk elastisitet» (evnen til cytosol komponenter for å bevege seg fritt gjennom cytosolen seg selv), en egenskap som er ansett som avgjørende i ferd med ekstravasasjon og migrering gjennom blod-strømmen. Globalt disse funnene ser ut til å gå sammen med vår observasjon at lave nivåer av CD44 er relevante for tid til tilbakefall i tykktarmskreft.
Tvert imot høyere nivåer av uttrykk for ABCG2 resulterte oftere til stede i gruppe A pasienter, de med dårligere prognose. ABCG2 (også kjent som CDw338) er et protein på celleoverflaten, er involvert med transport av molekyler på tvers av cellemembraner. Ekspresjon av dette proteinet har blitt knyttet sammen med multi-medikamentresistens og i et siste arbeid av Oh et al. [22] kolorektal kreft celler blir motstandsdyktig mot FOLFOX kjemoterapi utstilt høye nivåer av ABCG2. Dette kan forklare den tilsynelatende redusert effekt av adjuvant kjemoterapi i vår gruppe pasienter med dårligere prognose.
Selv om publiserte data så langt kan tyde på at CD133 representerer en viktig biomarkør i tykktarm kreft stamceller, er dens rolle langt fra å bli fullt ut forstått. Dette proteinet (også kalt Prominin-en eller i forkortet form PROM-1) har en rolle i dannelsen av membranfremspring og vescicular handel [23]. Annet enn dette heller basen funksjonen, er det postulert at PROM-1 samhandler med andre godt og-ikke-så-kjente intracellulære messangers som de som er involvert i WNT /Beta-catenin, PI3K-Akt-mTOR, HIF-1alfa og CXCR4 trasé [24], [25].
i særdeleshet synes høy CD133 uttrykk til å være relatert til dårligere prognose i kolorektal kreft på grunn av sin høyere frekvens i metastaser i stedet for i primærtumor [17].
i vår analyse, ble ulike nivåer av CD133 ikke knyttet til en høyere sannsynlighet for tilbakefall. Faktisk pasienter i gruppe A og B hadde heterogene nivåer av CD133 uttrykk, med ingen signifikante forskjeller mellom de to gruppene. Også når analysere effekten av høy vs lav konsentrasjon av CD133 ble ikke observert noen signifikant forskjell med TTR.
Disse data synes å være i kontrast med de presentert av Artells et al. [26] tyder på at høye nivåer av CD133 genekspresjon ble korrelert med en høyere sannsynlighet for tilbakefall i resected pasienter med kolorektal kreft. Våre resultater kan forklares ved det faktum at i vår analyse av flere ulike faktorer tatt i betraktning, og ikke bare en markør av stemness: på grunn av beskaffenheten av K-betyr analyse, i nærvær av flere biologiske faktorer med en mer klar innvirkning på TTR effekten av CD133 som markør for tilbakefall kan bli utvannet.
Vi vet også at CD133 IHC uttrykk kan være induserbar og at selv tidligere CD133 null stamceller kan gi uttrykk for
de novo
CD133 i forskjellige kultur betyr og under spesielle forhold [27]. Dette kunne i det minste konto for å motsi resultatene av analysen utført på CD133 IHC uttrykk og prognose.
Videre i en annen opplevelse av Shmelkov et al. [8] CD133 null celler ble hypoteser å ha enda en mer aggressiv fenotype enn sitt motstykke CD133 positive. Spesielt når inokulert i SCIV Muser, tumorvekst fra CD133 negative stamceller var markert større enn CD133 positiv cellepopulasjon.
Globalt våre funn tyder på for første gang en potensiell rolle for kreftstamcelle genet profil diskriminerende ulik risiko for tilbakefall uavhengig av sykdom scenen. Disse resultater kan også være aktuelt, etter ytterligere bekreftelse, for identifisering av mulige stamceller bundet molekylære mål for fremtidig utvikling av stamcellestyrt behandlingsstrategier.
