Abstract
Ets-en er en transkripsjonsfaktor som regulerer mange gener involvert i kreft progresjon og i tumorinvasjon. Det er en dårlig prognostisk markør for bryst-, lunge-, kolorektal- og eggstokk karsinomer. Her har vi identifisert poly (ADP-ribose) polymerase-en (PARP-1) som en roman interaksjon partner av Ets-en. Vi viser at Ets-1 aktiveres, ved direkte interaksjon, den katalytiske aktiviteten til PARP-1 og er deretter poly (ADP-ribosyl) rerte i en DNA-uavhengig måte. Den katalytiske hemming av PARP-en forbedret Ets-en transkripsjonen aktivitet og forårsaket sin massive akkumulering i cellekjerner. Ets-1-ekspresjon ble korrelert med en økning i DNA-skader når PARP-1 var hemmet, noe som fører til kreft celledød. Videre PARP-1-inhibitorer forårsaket bare Ets-1-uttrykkende celler for å akkumulere DNA-skade. Disse resultatene gir ny innsikt i Ets-en regulering i kreftceller og dens kobling med DNA reparasjonsproteiner. Videre våre funn tyder på at PARP-1-hemmere vil være nyttig i en ny terapeutisk strategi som er spesielt rettet mot Ets-en-uttrykke svulster
Citation. Legrand AJ, Choul-Li S, Spriet C, Idziorek T, Vicogne D, Drobecq H, et al. (2013) nivået av Ets-1 Protein er regulert av Poly (ADP-Ribose) Polymerase-en (PARP-1) i kreftceller å hindre DNA Damage. PLoS ONE 8 (2): e55883. doi: 10,1371 /journal.pone.0055883
Redaktør: Rajesh Mohanraj, UAE University, De forente arabiske emirater
mottatt: 25 september 2012; Godkjent: 03.01.2013; Publisert: 06.02.2013
Copyright: © 2013 Legrand et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) og med tilskudd fra la Ligue contre le Cancer, Comité du Pas-de-Calais. Den Ministère de la Recherche et de l’Enseignement Supérieur og Fondation ARC pour la Recherche sur le kreft gitt en PhD fellesskap til Arnaud J. Legrand. CNRS og Conseil Regional du Nord-Pas-de-Calais gitt en PhD fellesskap (BDI) til Souhaila Choul-li. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Ets-en er den grunnleggende medlem av familien av transkripsjonsfaktorer kalt ETS. Denne familien er preget av en godt bevart DNA-bindende domene (DBD)
5 som gjenkjenner spesifikke DNA-elementer, kalt ETS-bindingsseter (EBS), som finnes i arrangører av målgener. Ets-en er hovedsakelig uttrykt i embryonale vev. Det er involvert i fysiologiske prosesser som proliferasjon, differensiering, migrasjon, invasjon og apoptose [1] – [6]. Ets-1-ekspresjonen er strengt regulert i voksent vev og dets overekspresjon er ofte relatert til invasive sykdommer, for eksempel reumatoid artritt, glomerulonefritt og mange kreft [7] – [9]. Den patologiske uttrykk for Ets-en er delvis ansvarlig for spredning og invasjons evner av tumorceller. Dette invasivitet er på grunn av gener som kontrolleres av Ets-1 og som koder for proteaser, inkludert den matriks-metallproteaser kollagenase-1 og stromelysin-1 eller urokinase-type plasminogen aktivator (uPA). Derfor Ets-en er antatt som en markør for dårlig prognose i flere krefttyper [10] – [13].
Dessuten, til tross for det faktum at alle ETS familiemedlemmer har samme DBD, har Ets-1 sitt eget DNA-bindende egenskaper som er strengt kontrollert for å sikre en bestemt biologisk virkning. Ets-1 inhiberer sin egen DNA-binding på grunn av tilstedeværelsen av to inhibitoriske domener som flankerer dens DBD [14]. Ets-en trenger å samhandle med partnere for å motvirke denne auto-hemming og binder seg til arrangører av sine mål gener [15]. I enkelte arrangører, slik som de som finnes i
MMP3 plakater (stromelysin-1) og
TP53
gener, to Ets-1 molekyler binder seg til to palindromisk EBS atskilt med 4 bp [16] – [18]. I alle tilfeller, protein-protein interaksjoner synes å være nøkkelen til Ets-en regulering.
Videre Ets-1 er også kontrollert av posttranslasjonelle modifikasjoner, inkludert fosforylering, SUMOylation og ubiquitinering [7], [19]. Imidlertid Ets-1-aksjer de samme signalveier med mange transkripsjonsfaktorer. Dermed er det en utfordring å identifisere de spesifikke funksjonene i trasé som kontrollerer aktiviteten til Ets-en for å bruke dem for terapeutisk målretting.
For å identifisere nye veier, vi tidligere rensede interaksjonspartnere Ets-en ved hjelp av streptavidin pull-down-analyse. Med denne strategien har vi vist den funksjonelle samspillet mellom Ets-1 og DNA-reparasjon komplekse DNA-PK [20].
Her har vi identifisert poly (ADP-ribose) polymerase-en (PARP-1) som en roman interaksjon partner av Ets-en. PARP-1 er et rikt og allestedsnærværende kjernefysisk protein som katalyserer poly (ADP-ribosyl) asjon (PARylation) ved hjelp av NAD + som underlag for å syntetisere forgrenet poly (ADP-ribose) polymerer på target proteiner. PARP-1 spiller ulike roller i mange molekylære og cellulære prosesser, inkludert DNA-skade deteksjon og reparasjon og kromatin modifisering [21]. Selv om PARP-1 ble opprinnelig betegnet som en DNA-reparasjon protein, har mange nyere undersøkelser fremhevet sin rolle i transkripsjonsregulering. PARP-1 er involvert i reguleringen av transkripsjonsfaktorer så som NF-kB, AP-2, p53 og mange andre [22] – [24]. Videre har PARP-1-hemming dukket opp som en ny terapeutisk strategi for kreft [25]. Interessant, synes PARP-1-inhibering å være effektiv i kreftformer som ofte viser overuttrykte ETS proteiner, inkludert ovarie, prostata og bryst kreft [25]. Tidligere studier har vist en funksjonell sammenheng mellom PARP-1 og ETS familiemedlemmer, for eksempel Ese-1, Fli1, Erg og Elk-1 [26] – [28]. Likeledes kan Ets-en være en viktig regulator av
parp1
genet ved å styre sin promoter [29]. Ganske nylig, har interessen for denne funksjonell kobling økt i den grad at det er nå betraktet som en helt ny terapeutisk tilnærming i kreft. Nye rapporter har vist at ETS fusjonsproteiner, som er involvert i mange kreftformer, er narkotika-sensitivity biomarkører av PARP-1-hemming [26], [30], [31]. Høy uttrykk for TMPRSS2: Erg i prostata kreft eller EWS-Fli1 i Ewing sarkom forårsaker DNA-skader som forsterkes av PARP-1-hemming og blir etterfulgt av sterk hemming av kreft progresjon. Likevel, så vidt vi vet, har det ikke vært rapportert noen funksjonelle koblinger mellom Ets-1 uttrykk og sin følsomhet til PARP-1-hemmere.
I denne studien, viser vi at PARP-1 negativt styrer nivå av Ets-1 proteiner i kreftcellene via PARylation. Under PARylation inhibering, er Ets-1 transkripsjonen aktivitet forbedret som korrelerer med Ets-1-proteiner akkumulering i cellekjerner og en økning i DNA-skade som fører til kreft celledød. Derfor våre resultater tyder på at hemming av PARylation kan være en roman terapeutisk strategi for å begrense kreft progresjon i Ets-en-uttrykke svulster
Resultater
PARP-1: a. Roman Ets-en samhandling partner i kreftceller
For å finne nye Ets-1 partnere, gjennomførte vi en
in vitro
affinitet rensing strategi ved hjelp av et streptavidin pull-down analysen. Denne tilnærmingen sikrer storskala identifisering av partnere ved hjelp biotinylerte rekombinante Ets-en immobilisert på streptavidin perler til å beholde sine bindende proteiner som finnes i atom ekstrakter [20], [32]. Her har vi brukt MDA-MB-231-celler, en invasiv brystkreft-cellelinje, for å fremstille kjerneekstrakter; disse cellene endogent uttrykker Ets-en oncoprotein, og dermed tilby en passende cellulær sammenheng. Etter separasjon av de bundne proteiner ved SDS-PAGE, ble en svært synlig proteinbånd med en molekylvekt på 113 kDa ble observert etter kolloidalt farging (fig. 1A, spor 3, angitt med en stjerne (*)), men fraværende i kontrollforhold (fig. 1A, felt 1 og 2). Dette proteinet ble identifisert ved massespektrometri som PARP-1 enzymet (fig. 1B og S1) og sin eksklusive tilstedeværelse i Ets-1-bundne proteiner ble bekreftet ved Western blot (Fig. 1C, spor 3). På grunn av den sterke affinitet av PARP-1 for bretter DNA, ble kjerneekstrakter behandlet med DNase I før inkubering for å fjerne alle spor av nukleinsyrer. Denne behandlingen ikke forstyrre samspillet mellom Ets-en og PARP-1 (Fig. 1D, kjørefelt 4). Dette ble bekreftet ved massespektrometri (data ikke vist). Vi utførte deretter ko-immunoutfellingsstudier eksperimenter ved bruk av et anti-Ets-1-antistoff-konjugat agarose i MDA-MD-231-celler og i en osteosarcoma-cellelinje, MG63, som også uttrykker Ets-1. Etter separasjon ved hjelp av SDS-PAGE og immunblotting med et anti-PARP-1-antistoff, PARP-1 ko-utfelt med Ets-1 fra både MDA-MB-231 og MG63-celler (fig. 1E, kolonne 2). Kontrollforsøk med IgG fra normalt kaninserum mislyktes i å rekruttere PARP-1 (fig. 1E, kolonne 1). Gjensidig co-immunoutfellingsstudier eksperimenter ble utført ved anvendelse av et anti-PARP-1-antistoff-konjugat agarose i MDA-MD-231 og MG63-celler. Ets-en co-utfelt fra både MDA-MB-231 og MG63 celler og var fraværende fra (Fig. 1F) kontrollforsøk. Videre immunfluorescens eksperimenter med anti-Ets-1 og anti-PARP-1-antistoffer har vist at begge proteiner ko-lokalisering i MDA-MB-231-celler kjerner (fig. S2, spor 4).
(A) kolloidalt blå-farget gel for Ets-en-assosierte proteiner fra MDA-MB-231 atom ekstrakter. Biotinylated Ets-1 proteiner som brukes for rullegardin analysen ble lastet alene som en kontroll for å identifisere de biotinylerte proteiner (pilspisser) og deres potensielle nedbrytingsprodukter (spor 1). Pull-ned proteiner oppdaget fra atom ekstrakter (NE) inkubert med ubelastede perler ble ansett for å være ikke-spesifikke produkter (kolonne 2). Den kolloidale blå-farget spesifikk PARP-1 protein trukket ned av biotinylert Ets-en er merket med en stjerne (spor 3). (B) Identifisering av PARP-1 av MALDI-TOF massespektrometri. (C) Western blot analyse bekrefter Ets-1-assosiert protein som PARP-1. Proteiner trukket ned fra MDA-MB-231 nukleære ekstrakter ble analysert ved hjelp av Western blot med kanin-antistoffer rettet mot PARP-1 (H-250). (D) kolloidal blå-farget gel for Ets-1-assosierte proteiner fra MDA-MB-231 nukleære ekstrakter enten ubehandlede (spor 1 og 2) eller behandlet med DNase I i 40 min (banene 3 og 4) og deretter enten inkubert med streptavidin perler lastet med biotinylert Ets-1 protein (pilhoder) (sporene 2 og 4) eller med ubelastede kuler (kolonnene 1 og 3). Stjernene indikerer PARP-1-proteinet påvist i (A). (E) og (F) Co-immunoutfelling utført ved anvendelse av et kanin anti-Ets-1 (C-20) eller et kanin anti-PARP-1 (H-250) antistoff-agarose-konjugat (spor 2) eller normalt kanin-IgG så en kontroll (kolonne 1) og nukleære ekstrakter fra MDA-MB-231-celler eller MG-63-celler. Input (spor 3) inneholder 3% av kjernefysiske ekstrakter som gjennomgikk co-immunoprecipitation. PARP-1 og Ets-1 ble analysert ved Western blot hjelp henholdsvis H-250 og C-4-antistoffer.
Ets-1 samhandler direkte med PARP-1 og er deretter PARylated i et DNA-uavhengig måte
En tidligere studie viste at ETS DBD samhandler med PARP-1 [30]; Likevel er interaksjoner med Ets-en DBD begrenset av Ets-en auto-hemming. Derfor, for å studere samspillet mellom Ets-en og PARP-1, vi brukte to biotinylerte og auto-hemmet isoformer av Ets-1: full lengde form, ganske enkelt kalt Ets-en og en dominant-negative isoform som følge av alternativ spleising , Ets-en p27. Ets-1 p27 ble nylig oppdaget av vår gruppe og mangler treonin-38 (Thr38) rest, samt den spisse (PNT) og transaktivering (TAD) domener (fig. 2A), som alle er nødvendige for transaktivering av Ets -1 målgener. Imidlertid har Ets-en p27 fortsatt de samme DNA-bindende egenskaper som Ets-1 [33]. Etter inkubering av biotinylert Ets-1-isoformer immobilisert på streptavidin kuler med en rekombinant PARP-1 enzymet, PARP-1 spesifikt og direkte interaksjon med Ets-1-isoformer (fig. 2B, kolonnene 2 og 3). Dermed gjør auto-hemming av Ets-en ikke forstyrre direkte interaksjon mellom DBD og PARP-1. For å undersøke om Ets-en er post-translatorisk modifisert av PARP-1-mediert PARylation, gjennomførte vi ut en
in vitro
PARylation analysen. For å katalysere PARylation, PARP-1 krever generelt tilstedeværelse av bretter DNA, slik som vist i kontroller med tillegg av sonikert dobbelttrådet DNA (fig. 2C felt 1 og 2). Når aktivert, PARP-1 katalyserer dets auto-PARylation, som kan visualiseres ved hjelp av et anti-PAR-antistoff (fig. 2C, kolonne 2). I nærvær av Ets-1, auto-PARylation var sterkere og Ets-1 ble PARylated ved en molekylvekt på omtrent 51 kDa tilsvarende mono (ADP-ribosyl) asjon og PARylation med forskjellige polymer størrelser (fig. 2C, spor 4, svart pil). Videre, i fravær av DNA, ikke bare var PARP-1 fremdeles aktivert, men Ets-1 var enda sterkere PARylated (fig. 2C, spor 5, sort pil). Med Ets-en p27 isoform, viste resultatene at i nærvær av bretter DNA, ble Ets-en p27 ikke PARylated (Fig. 2C, lane 7). Ikke desto mindre, uten DNA, Ets-1 p27 aktiverer PARP-1 og er deretter PARylated, sett på som et bånd ved en molekylvekt på omtrent 27 kDa og med forskjellige størrelser polymerer i molekylvekter mellom 40 og 60 kDa (fig. 2C, spor 8). Således kan den C-terminale ende av Ets-1 aktiverer automatisk PARylation av PARP-1 i et DNA-uavhengig måte, ved direkte protein-protein interaksjon og bli PARylated i retur. For å demonstrere PARylation i humane kreftceller, vi generert et HeLa cellelinje, oppnådd ved retroviral infeksjon, som stabilt uttrykker Ets-en merket med en streptavidin bindende peptid (SBP). Etter rensing av Ets-en på streptavidin perler, analyserte vi PARylation av Western blot hjelp av en anti-PAR antistoff. Resultatene viste at en fraksjon av Ets-1-protein ble svakt PARylated i celler (fig. 2D, kolonne 2). PARylation er en meget kortvarig post-translasjonell modifikasjon som er vanskelig å visualisere i celler, spesielt på grunn av virkningen av poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG), som katalyserer nedbrytningen av PAR polymerer [21].
(A) Skjematisk fremstilling av full-lengde Ets-1 protein og sin dominerende negative isoform Ets-en p27. Bokser tilsvarer oversatte regioner og stiplede linjer til uoversatt regioner. Treonin-38 (Thr38), spisse domene (PNT), trans domene (TAD), inhiberende domene (I), oversatt område svarende til ekson VII og DNA-bindende domene (DBD) er angitt. (B) streptavidin pull-down analysen med rekombinante Ets-1 og PARP-1 proteiner. Biotinylert Ets-1 (5 ug) eller Ets-1 p27 (2,5 ug) proteiner ble lastet på streptavidin perler og deretter inkubert med ren rekombinant PARP-1 protein (1 ug) i 1 time (søyle 2 og 3). Streptavidin perler alene inkubert med PARP-1 ble anvendt som kontroll (spor 1). PARP-1 ble analysert ved hjelp av Western blot. (C) PARylation analysen med Ets-en og Ets-en p27. Ets-1 (1 ug) eller ets-1 p27 (500 ng) proteiner ble inkubert med rekombinant PARP-1-protein (500 ng) i PARylation reaksjonsbuffer (se Materialer og Metoder) i nærvær (felt 4 og 7) eller i fravær (banene 5 og 8) med bretter DNA i 20 min. Som en kontroll, ble Ets-1 isoformer inkubert alene i reaksjonsbuffer og nicked DNA (spor 3 og 6) og auto-aktivering av PARP-1 alene ble kontrollert med eller uten DNA (kontroll, felt 1 og 2) (D) PARylation av Ets-1 i stabilt transfekterte HeLa-celler, oppnådd ved retroviral infeksjon. Ets-en tagget med streptavidin bindende peptid (SBP) ble renset på stretavidin perler fra HeLa cellekjerneekstrakter (kolonne 2). HeLa-celler som stabilt uttrykker bare SBP ble anvendt som kontroll (spor 1). I (C) og (D), ble PARylation status bestemt ved anvendelse av et anti-PAR-antistoff.
PARP-1 modulerer Ets-1-mediert transkripsjon av stromelysin-1-promoteren
for å finne ut om interaksjon med PARP-1 modulerer transkripsjonen aktivitet av Ets-en, ble luciferase trans analyser utført. For å gjøre dette, brukte vi arrangøren av matriksmetalloprotease stromelysin-1, som er et godt studert Ets-en target gen som er involvert i kreft celle migrasjon og invasjon [34]. Denne promoter, aktivert ved samarbeidende binding av to Ets-1 molekylene via en palindromisk EBS, ble smeltet sammen med luciferase-genet (Fig. 3A). 3T3-museceller, med enten den PARP-en villtype (WT) eller knock-out (KO), ble brukt for å evaluere Ets-1 transkripsjonen aktivitet i totalt fravær av PARP-1-proteinet. I WT-celler, ble det stromelysin-1-promoteren fullstendig aktivert av Ets-1 transfeksjon (fig. 3B, spor 3). I motsetning til PARP-1 KO redusert evne til Ets-1 til transactivate promotoren (fig. 3B, spor 4). Rednings eksperimenter utført ved anvendelse av et humant PARP-1 ekspresjonsvektoren tillates Ets-1 til delvis gjenvinne sin transkripsjonen aktivitet (fig. 3B, spor 5). Således er nødvendig for fullstendig transaktivering av stromelysin-1 promoter av Ets-en PARP-1. Vi deretter undersøkt konsekvensene av PARP-1-mediert PARylation på Ets-en transkripsjonen aktivitet. For å gjøre dette, utførte vi de samme luciferasepreparater trans analyser med 3T3 celler ved hjelp av PJ-34, en PARP-en katalytisk inhibitor. Overraskende, PARylation hemming, i motsetning til PARP-1 KO, økt Ets-1 transkripsjonen aktivitet på stromelysin-1-promoteren, som vist i transfekterte WT-celler (Fig. 3C, kolonnene 3 og 4). I KO-celler, PJ-34 ikke hadde noen effekt, og mislyktes i å øke transaktivering av promoteren (fig. 3C, kolonnene 7 og 8). Derfor øker i Ets-1 transkripsjonen aktivitet virke gjennom den spesifikke inhibering av PARP-1. Analyse ved hjelp av Western blot viste at inhibering av PARylation ved PJ-34 førte til en økning i Ets-1 proteinnivå i WT-celler (fig. 3C, kolonnene 3 og 4). For å bekrefte at PARylation hemming fører også til en økning i Ets-en transkripsjonen aktivitet i humane kreftceller, gjennomførte vi luciferase trans analyser i HeLa celler med økende doser av PJ-34. Resultatene viste at PJ-34 doseavhengig økning i transaktivering av stromelysin-1 promotoren ble korrelert med en økning i Ets-1 proteinnivåer (Fig. 3D, kolonnene 5-8). Denne økningen i Ets-1 protein nivåer ble observert i HeLa celler ikke bare med PJ-34, men også med to andre godt undersøkt PARP-1-hemmere:. 5-AIQ og ABT-888 (veliparib) (figur 3E, baner 6- 8). Dermed er denne økningen spesielt på grunn av PARP-1-inhibering. Disse resultater antyder at Ets-1 proteinnivåer er negativt regulert av PARP-1-mediert PARylation.
(A) Skjematisk representasjon av luciferase-genet under kontroll av det humane stromelysin-1-promoteren. Palindromic Ets-bindingsseter (EBS) er vist bundet med to Ets-1 molekyler. (B) Effekt av PARP-en knock out (KO) på Ets-1-mediert stromelysin-en promoter aktivitet. pGL3 luciferase reporter-konstruksjoner (100 ng) ble transfektert inn i 3T3-museceller villtype (WT) (felt 1 og 3) eller KO til PARP-1-gen (spor 2, 4 og 5) ved 50-80% konfluens i fravær (kolonnene 1 og 2) eller i nærvær (kolonnene 3, 4 og 5) av Ets-1-ekspresjonsvektoren (25 ng) og i redningsforsøk med PARP-1-ekspresjonsvektoren (100 ng, felt 5). (C) Virkning av PARP-1 katalytisk inhibering av Ets-1-mediert stromelysin-1 promoter-aktivitet i nærvær eller fravær av PARP-1. pGL3 luciferase reporter-konstruksjoner (100 ng) ble transfektert inn i 3T3-museceller WT (sporene 1- 4) eller KO til PARP-1-genet (felt 5-8) på en 50-80% konfluens i fravær (spor 1, 2 , 5 og 6) eller i nærvær (kolonnene 3, 4, 7 og 8) av Ets-1-ekspresjonsvektoren (25 ng) og i fravær (kolonnene 1, 3, 5 og 7) eller i nærvær (spor 2 , 4, 6 og 8) av PJ-34, en katalytisk inhibitor av PARP-1 (10 pM). (D) Virkning av PARP-1 katalytisk inhibering på Ets-1-mediert stromelysin-1 promoter-aktivitet i en kreftcelle modell. pGL3 luciferase reporter-konstruksjoner (100 ng) ble transfektert inn i HeLa-celler ved en 50-80% konfluens i fravær (kolonnene 1-4) eller i nærvær (kolonnene 5-8) av Ets-1-ekspresjonsvektoren (100 ng) og med økende doser av PJ-34 (0-20 mikrometer, baner 1-4 og 5-8). I (B), (C) og (D), luciferase-aktivitet, målt 48 timer etter transfeksjon og 20 timer etter inkubering med PJ-34, er uttrykt som en prosentandel med aktiviteten indusert av Ets-1 i et PARP-1 WT sammenheng angitt som 100%. Resultatene er gjennomsnittet av tre forsøk utført in triplo. (E) Effekt av PARP-1 katalytisk inhibering av graden av Ets-1-proteinet. HeLa-celler ble dyrket i 6-brønns plater inntil 70% konfluens, transfektert med pcDNA3 (1 ug, venstre panel) eller pcDNA3-ETS1 (1 ug, høyre panel) vektorer i 24 timer og behandlet med PJ-34 (1 uM) ( sporene 2 og 6), 5-AIQ (1 uM) (banene 3 og 7) eller ABT-888 (1 uM) (felt 4 og 8) i 20 timer. I alle forsøkene ble cellelysater (30 mikrogram totale proteiner) analysert ved Western blot ved hjelp av ulike antistoffer (se Materialer og metoder).
Hemming av PARylation forårsaker opphopning av Ets-en i kreftceller
for å bestemme kinetikken av Ets-en opphopning, utførte vi time-lapse bildebehandling eksperimenter. HeLa-celler ble transient transfektert med en vektor som uttrykker et fusjonsprotein EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein) -Ets-1. Under kontrollforhold EGFP-Ets-1 proteinnivåer var stabile i løpet av en 12 timers time-lapse (Fig. 4A, rad 1). Ved tilsetning av PJ-34, ble det observert en kraftig økning i EGFP-Ets-1-signal som svarer til kjernen av HeLa-celler (fig. 4A, rad 2). Ikke desto mindre, PJ-34 hadde ingen effekt på EGFP alene (fig. 4A, rad 4) og, mer interessant, ikke hadde noen effekt på EGFP-Ets-1 p27 (fig. 4A, rad 3). Gitt at full-lengde Ets-en er ubiquitinated og deretter brytes ned av proteasome, mens Ets-en p27 ikke har noen ubiquitinering nettsider [19], [33], neste undersøkte vi om kinetikken av Ets-en akkumulering kan sammenlignes til de av proteasomal inhibering. Ved hjelp av MG-132, et velkjent proteasominhibitor, resulterte i den samme kinetikken av Ets-en opphopning som de som er observert under PARylation hemming (fig. 4A, raden 5). I motsetning til dette, MG-132 hadde ingen virkning på Ets-1 p27 protein nivåer, for derved å styrke forbindelsen mellom PARylation og proteasom-nedbrytning av Ets-1 (fig. 4A, p 6). Statistisk analyse av variasjonen i fluorescensintensiteten i disse time-lapse eksperimenter viste at betydelig variasjon i Ets-1-proteinnivåer (ca. 50% økning) ble observert ved tilsetning av PJ-34 eller MG-132 var sammenlignbare (fig. 4A, bunn panel, baner 2 og 5). For å bekrefte at opphopning av Ets-en mediert av PARP-1-hemming kan også observeres i en endogen sammenheng, behandlet vi MDA-MB-231 celler med PJ-34 og analysert Ets-1 proteinnivåer ved immunfluorescens. Ets-1 var i hovedsak lokalisert i kjernen av MDA-MB-231 celler, men dens nærvær ble også observert i det perinukleære cytoplasma (fig. 4B, kolonne 1, hvite piler) [33]. Med en anti-Ets-1 antistoff, la vi merke til en sterk opphopning av endogen Ets-en i cellenes kjerner og cytoplasma (fig. 4B, kolonne 2). Vi undersøkte om denne mekanismen var spesifikke for Ets-en. For å gjøre dette, testet vi flere proteiner kjent for å være PARylated som p53, c-Jun, ERK-2 og PARP-1 [21], [23], [27], [35]. Resultatene viste at, med unntak av Ets-1 ble ingen av disse proteiner akkumulert i cellene under PARylation inhibering av PJ-34 (fig. 4C). Vi observerte også at Ets-en effektivt akkumulert i MDA-MB-231 celler ved behandling med andre PARP-1-hemmere, 5-AIQ og ABT-888, mens p53 protein nivåer forble uendret (fig. S3). Således er PARP-1-mediert PARylation involvert i en spesifikk regulering av Ets-1-proteinnivåer i kreftcellene, og vi antar at denne mekanismen er koblet til sin proteasomal degradering.
(A) Kinetikk av Ets-1 opphopning observert av time-lapse bilder. HeLa-celler ble dyrket i Mattek retter, og ble transfektert med peGFP-C1-Ets-1 (500 ng; radene 1, 2 og 5) eller peGFP-C-1-Ets-1p27 (500 ng; rader 3 og 6) eller tom peGFP-C1 vektorer (500 ng; rad 4). 24 timer etter transfeksjon, ble HeLa-celler behandlet med PJ-34 (10 um; rader 2-4) eller MG-132 (5 pm; rader 5 og 6) og observert i 12 timer under et fluorescens-mikroskop ved 20 x forstørrelse med ett bilde tatt hver time. Nedre panel: Statistisk analyse av variasjonen av fluorescensintensitet. Forhold 1 til 6 er angitt på x-aksen er de samme som de som er beskrevet ovenfor. Bety fluorescensintensiteter fra time-lapse forsøket Bildene ble beregnet ved hjelp av ImageJ programvare, og forholdet mellom variasjonen ble etablert mellom t = 12 timer og t = 0 bilder. Resultatene er gjennomsnittet av tre forsøk. (B) Visualisering av Ets-1 protein nivåer i MDA-MB-231 celler behandlet med PJ-34 ved immunfluorescens. MDA-MB-231-celler ble behandlet med PJ-34 (10 pM) i 20 timer. Ets-en er visualisert i Red (Alexa Fluor® 594). Celler ble undersøkt under et fluorescens-mikroskop ved 40 x forstørrelse. Scale bar = 20 mikrometer. Hvite piler indikerer cytoplasmisk lokalisering av Ets-1 i ubehandlede celler (kolonne 1). Bunnplate: Overflate tomt representasjoner. Overflate tomter ble oppnådd ved å analysere immunofluorescence bilder ved hjelp ImageJ programvare; x- og y-aksen indikerer pikselposisjoner og z-aksen, intensiteten av fluorescens. (C) Virkning av PARP-1 katalytisk inhibering av graden av PARylated proteiner. MDA-MB-231-celler ble behandlet med PJ-34 (10 pM) i 20 timer. Cellelysatene (30 ug totalt protein) ble analysert ved Western blot ved anvendelse av forskjellige antistoffer (se Materialer og Metoder) mot PARP-1, p53, c-Jun og ERK-2 som er kjent for å gjennomgå PARylation.
ETS-1 uttrykk fører til kreft celledød etter PARylation hemming
for å finne ut konsekvensene av Ets-en opphopning i kreftceller, undersøkte vi om eksogent Ets-1 uttrykk påvirker overlevelse av HeLa-celler behandlet med PJ -34. HeLa-celler ble transfektert med en vektor som uttrykker Ets-1 eller en tom vektor, og deretter inkubert i 20 timer med PJ-34. Time-lapse bildebehandling eksperimenter viste at PJ-34 ikke hadde noen drastisk effekt på overlevelse av HeLa-celler transfektert med tom vektor ( «Mock») som demonstrert ved fravær av nekrotisk morfologi og propidiumjodid (PI) inkorporering (fig. 5A, venstre panel og 5B). Likevel, Ets-1 uttrykk sensibilisert kreftceller til PJ-34 giftighet i stor grad (fig. 5A, panel til høyre). Time-lapse bildebehandling eksperimenter og statistisk analyse viste at nesten alle de Ets-en-uttrykker HeLa-celler innlemmet PI og gjennomgikk nekrose (Fig. 5A, panel rett og 5B). Tilsvarende er en fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyse viste at Ets-1-uttrykkende HeLa-celler som var mer utsatt for nekrose etter PJ-34-behandling (fig. 5C, høyre panel). Som PJ-34 er kjent for å forårsake mitotisk stopp i et PARP-1-uavhengig måte, [36], vi også utført disse forsøkene med ABT-888 (fig. S4). De samme resultater ble oppnådd, noe som viser at nekrose av Ets-1-uttrykkende HeLa-celler som opererer gjennom spesifikk inhibering av PARP-1 (fig. S4). Med MDA-MB-231-celler, ble det observert at 44% av cellene gjennomgå for å nekrose etter PJ-34-behandling (fig. 5D og 5E). FACS-analyse bekreftet dette lavere følsomhet for PJ-34 toksisitet (Fig. 5F). Brystkreft celler er mer resistente overfor anti-kreft medikamenter, såsom doksorubicin eller paclitaxel, på grunn av høy ekspresjon av MDR1 og Ets-1 [37]. Derfor ble det undersøkt hvorvidt PJ-34 kan bli brukt i tillegg til et doksorubicin behandling. Disse eksperimentene også tillatt oss å undersøke om [eller ikke] ETS-en opphopning mediert av PARP-1-hemming fører til en større grad av motstand mot doxorubicin i MDA-MB-231 celler. Resultatene viser at Ets-en fortsatt kort henhold PARylation hemning når MDA-MB-231-celler ble behandlet med 500 nM av doksorubicin (fig. S5a). Men vi merke til at MDA-MB-231-celler var mer utsatt for nekrose når PJ-34 og doksorubicin ble slått sammen enn når cellene ble behandlet med bare ett av disse to legemidler (fig. S5b og S5C). Således, selv om PJ-34 effekter er moderat i MDA-MB-231-celler, PARP-1-inhibitorer kan være effektivt i kombinasjon med andre anti-kreft medikamenter for å forbedre effektiviteten av behandlingen.
(A) Time-lapse bildebehandling eksperimenter av HeLa celler behandlet med PJ-34. HeLa-celler ble dyrket i Hi-Q4 retter inntil 70% konfluens og transfektert med tom pcDNA3 (250 ug, venstre panel) eller pcDNA3-ETS1 (250 ug, høyre panel) vektorer 24 timer før den ble behandlet med PJ-34 (5 pM) eller venstre ubehandlet. Cellene ble farget med Hoechst 33242 (blå) og PI (rød) for live-cell imaging og overvåket i 20 timer. Scale bar = 20 mikrometer. (B) Grafisk fremstilling av andelen av nekrotiske HeLa-celler (%) ved tre tidspunkter (se Materialer og Metoder). (C) Strømningscytometri celle-død deteksjon av HeLa-celler behandlet med PJ-34. HeLa-celler ble dyrket i 6-brønns plater inntil 70% konfluens og transfektert med pcDNA3 (1 ug, venstre panel) eller pcDNA3-ETS1 (1 ug, høyre panel) vektorer i 24 timer, og ubehandlet (stiplede linjer) eller behandlet med PJ -34 (heltrukne linjer) til en ytterligere 20 timers inkubering. Nekrotisk celledød ble deretter bestemt ved flow cytometri etter PI farging. Tall under horisontale linjen gi prosenter av spesifikke PJ-34-indusert nekrotisk celledød i hver tilstand. Flowcytometri profiler som vises er representative for tre replikere eksperimenter. (D) Time-lapse bildebehandling eksperimenter av MDA-MB-231 celler behandlet med PJ-34. MDA-MB-231-celler ble dyrket i Hi-Q4 retter inntil 80% konfluens, og ble behandlet med PJ-34 (10 pM) eller ubehandlet. Cellene ble farget med Hoechst 33242 (blå) og PI (rød) for live-cell imaging og overvåket i 20 timer. Scale bar = 20 mikrometer. (E) Grafisk fremstilling av andelen av nekrotiske MDA-MB-231-celler (%) ved tre tidspunkter (se Materialer og Metoder). F) Strømningscytometri celle-død påvisning av MDA-MB-231-celler behandlet med PJ-34. MDA-MB-231-celler ble dyrket i 6-brønns plater inntil 80% konfluens og venstre ubehandlede (stiplede linjer) eller behandlet med PJ-34 (heltrukne linjer) for en 20 timers inkubering. Nekrotisk celledød ble deretter bestemt ved flow cytometri etter PI farging. Tall under horisontale linjen representerer de prosenter av spesifikke PJ-34-indusert nekrotisk celledød i hver tilstand. Flowcytometri profiler som vises er representative for tre replikere eksperimenter.
Opphopning av Ets-en mediert av PARylation hemming øker DNA-skader
Vi undersøkte muligheten for at cellen nekrose mediert av hemming av PARP-1 samtidig med Ets-en opphopning skyldes en økning i DNA-skade som observert med Ets fusjonsproteiner i prostatakreft og Ewings sarkom [26], [30]. For å gjøre dette, vurdert vi nivået av en histone mark av DNA dobbel-strand pauser, fosforylert H2AX (γH2AX) foci.
