Abstract
microRNAs (mirnas) er deregulert i en rekke kreftformer, inkludert tykktarmskreft. MiR-30c tilhører MIR-30-familien, og er involvert i en rekke ondartede sykdommer. I denne studien, vi har oppdaget uttrykket av MIR-30c i tykktarm kreft cellelinjer og kliniske tykktarmskreft prøver. MiR-30c ble vist å være dramatisk nedregulert både i cellelinjer og kreftvev. I tillegg kan MIR-30c hemme kreft cellevekst, migrasjon og invasjon in vitro. Konsekvent, stabil over-uttrykk for MIR-30c hemmet veksten og lungemetastasering av tykktarmskreft celle xenografter in vivo. Videre bioinformatikk algoritme og luciferase reporter analysen indikerte ADAM19 som et direkte mål for MIR-30c. Av interesse, videre eksperimenter vist at hemming av ADAM19 av MIR-30c delvis mediert anti-tumor effekt av MIR-30c. Samlet vår studie gir ny innsikt som MIR-30c hemmet tykktarmskreftceller via målrette ADAM19. Dermed kan MIR-30c tjene som et lovende terapeutisk strategi for tykktarmskreft behandling
Citation. Zhang Q, Yu L, Qin D, Huang R, Jiang X, Zou C, et al. (2015) Rolle av mikroRNA-30c målretting ADAM19 i tykktarmskreft. PLoS ONE 10 (3): e0120698. doi: 10,1371 /journal.pone.0120698
Academic Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, TYSKLAND
mottatt: 11 november 2014; Godkjent: 26 januar 2015; Publisert: 23 mars 2015
Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er svært konservert, 22 nukleotider lange ikke-kodende RNA. MiRNA kan regulere genuttrykket post-transcriptionally ved å samhandle med komplementære sekvenser (vanligvis plassert i 3′-utranslaterte område (3′-UTR) av nukleotid) av messenger RNA (mRNA) mål. Disse interaksjonene kan føre til proteintranslasjon hemming eller mål-mRNA-nedbrytning avhengig av om mirnas og deres mål er perfekt komplementær [1]. Mirnas er dysregulerte i en rekke kreftformer og mirnas spiller en viktig rolle i tumorgenese [2,3,4,5]. Et antall mirnas har blitt funnet å virke som tumor-suppressorer [2,6,7,8]. I de senere årene har mirnas blitt anerkjent som viktige regulatorer i utvikling og progresjon av kreft, inkludert tykktarmskreft (CRC) [9,10,11,12].
CRC er den tredje vanligste kreftformen hos menn og kvinner , med anslagsvis 142820 nye tilfeller og 50830 dødsfall i USA i 2013 [13]. Selv om betydelig fremgang har blitt gjort de siste tiårene, inkludert kirurgisk behandling, strålebehandling og kjemoterapi, har overlevelsen av CRC pasienter endret seg lite. Det er av avgjørende betydning for å søke tidlig oppdagelse metode på grunn av økt metastasering og dødelighet av avansert høyverdig CRC.
MiR-30c er et medlem av MIR-30 familien. Fem forskjellige modne miRNA sekvenser er inkludert i denne familien: MIR-30a /MIR-30c-2, MIR-30D /MIR-30b og MIR-30e /MIR-30c-1 [14]. Akkumulerende bevis tyder på at deregulering av MIR-30c bidrar til forskjellige ondartede tumorer, inkludert brystkreft, livmorkreft, lungekreft, leverkreft [8,15,16,17]. MiR-30 undertrykker tumorous prosessene i disse ovennevnte kreft ved direkte samspill med sine tilsvarende mål. Likevel er det relativt få studier tilgjengelig rapporterer innblanding av MIR-30c i utviklingen av tykktarmskreft.
I vår undersøkelse fant vi ut den potensielle effekten av MIR-30c på tykktarmskreft progresjon. Våre data indikerer at Mir-30c har lavere uttrykk nivå i humane tarmkreft prøver. Hva mer, undersøkte vi mekanismene bak rollen MIR-30c i tykktarm kreft utvikling. Resultatene viste at Mir-30c spiller en avgjørende rolle i en mengde biologiske prosesser via regulering ADAM19 i menneskets tykktarm kreft. Derfor kan re-uttrykke MIR-30c og /eller forstyrrer ADAM19 funksjon være en lovende tykktarmskreft terapeutisk strategi.
Materialer og metoder
Kliniske prøver
Sixty tykktarmskreft prøver og deres tilstøtende normale vev ble oppsamlet fra tykktarmskreftpasienter i den andre Tilknyttet Hospital fra Harbin Medical University (Harbin, Kina) under en operasjon og umiddelbart lagret i flytende nitrogen inntil bruk. Ingen pasienter var blitt behandlet med radioterapi eller kjemoterapi før kirurgi. Studien ble godkjent av etikkomiteen av 2
nd Affiliated Hospital of Ha’erbin Medical University. All klinisk undersøkelse ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Den skriftlige samtykke ble innhentet fra hver pasient og godkjent av den lokale etikkutvalg.
Cell kultur
HCT116 og SW620 human tykktarm kreft cellelinjer var gaver fra Pro. LQ [18] og ble dyrket i RPMI1640 eller L15 medium (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA) og HEK293T celler ble dyrket i DMEM-medium. Alt medium ble supplementert med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin (Gibco Laboratories, Grand Island, NY, USA). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet inkubator som inneholder 5% CO2.
Vektorer konstruksjon, oligonukleotid syntese og transfeksjon
HSA-MIR-30c etterligne, MIR-30c inhibitor, mimikk negativ kontroll (NC etterligner), hemmer negativ kontroll (NC-hemmer) sekvenser og menneskelig ADAM19 siRNA var fra Gene Pharma Company (Shanghai, Kina). Lipofectamine 2000 Transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble anvendt for å transfektere celler. ADAM19 cDNA uten sin 3′-UTR (2757 bp) ble innsatt i pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) for å bygge opp plasmidet pcDNA3.1 (+) – ADAM19. En 513-bp-segmentet inneholdende pre-MIR-30c ble ligert til det pcDNA3.1 (+) vektoren for å konstruere stabile MIR-30c overekspresjon celler. Tabell 1 listet opp alle relaterte DNA-sekvenser.
Stabil transfeksjon av MIR-30c
2 × 10
5 HCT116-celler ble dyrket i en 60-mm plate til samløpet nådd 60-70% i RPMI 1640 media. Den pcDNA3.1 (+) – pre-MIR-30c plasmid ble deretter transfektert inn i celler med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California). Stabile cellelinjer ble screenet med 1 mg /ml G418 (Sigma, Shanghai, Kina), og positive kloner ble identifisert ved hjelp av QRT-PCR.
kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)
kvantitativ sanntids RT-PCR ble utført som beskrevet tidligere [18]. Total RNA ble isolert ved hjelp TRIzol reagenser (Invitrogen, Carlsbad, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Etterpå RNA ble reverstranskribert, deretter ble QRT-PCR ble utført ved anvendelse av en 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Mannheim, Tyskland) som følger: 94 ° C i 3 minutter, og deretter 40 sykluser ved 94 ° C i 30s, 60 ° C i 30 sekunder, 72 ° C i 30 sekunder og ett trinn av 82 ° C i 5 sek. Fluorescens ble påvist ved slutten av hver syklus.
celleproliferasjon og kolonidannelsesbestemmelsen
3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid ( MTT) analysen ble tatt i bruk for å vurdere cellelevedyktighet som tidligere beskrevet [18]. For å evaluere kolonidannelse evne, ble HCT116 eller SW620 celler sådd i 3,5 cm plater (1000 celler /skål). Koloniene ble løst i metanol, farget med 0,1% krystallfiolett (Sigma, St. Louis, MO, USA) og telles etter 2 uker.
Migrasjon og invasjon analysen
For å bestemme migrasjon evne av celler in vitro, ble det Transwell-analysen velges som beskrevet tidligere [18]. For å detektere invasjonen evnen til cellene, ble den membran av Transwell enhet belagt med 40 pl matrigel (BD Biosciences, SanJose, CA, USA) ved 37 ° C i 4 timer for å utvikle en rekonstruert basalmembran. Cellene ble behandlet på samme måte som overføringen analyse. Sårtilheling analysen ble også vedtatt å undersøke celle migrasjon evne. Celler ble sådd ut i 3,5-cm plater til en tetthet på 70-80%. Etterpå ble cellene skrapet av 200 ul pipettes tips for å bygge en kunstig såret. Den migrerende avstanden ble målt etter 24-72h
Western blot analyse
Totalt celle eller vev ekstrakter ble hentet i cellelyse buffer etterfulgt av immunoblotting med anti-ADAM19 (1:. 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), og anti-β-aktin (1: 2000., Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) som beskrevet tidligere [12]
Luciferase reporter analysen
å konstruere pMIR-ADAM19-3’UTR plasmid som inneholdt den potensielle bindingsseter for ADAM19 3′-UTR nedstrøms for ildflue luciferase-genet, ble et 282 bp-sekvens forsterket og ført inn i Spel og Hindlll setene på pMIR-RAPPORT luciferase vektor (Ambion, Austin, TX, USA). Plasmidet med MIR-30c målområde slettet fra ADAM19 3′-UTR ble også bygget. HEK293 og HCT116-celler ble benyttet for å måle luciferase-aktivitet. Når vokste til 60-70% samløpet, celler ble ko-transfektert med 100 ng Luciferase plasmid og 50 ng Renilla plasmid (Ambion, Austin, TX, USA) sammen med 650 ng MIR-30c etterligne eller NC som beskrevet ovenfor. Etter inkubasjon i 48 timer ved 37 ° C, ble luciferase-aktivitet påvist med den doble luciferase reporter 1000 Assay System (Promega, Madison, WI, USA).
In vivo tumorvekstmålinger
Dame atymiske BALB /c nu /nu mus (i alderen 4 uker) ble kjøpt fra Shanghai Laboratory Animal senter (Shanghai, Kina). Alle dyr prosedyrer var i samsvar med Harbin Medical University Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer. Den andre Affiliated Hospital of Harbin Medical University Animal Care og bruk komité godkjente denne forskningen. Dyrene ble huset som tidligere beskrevet [12]. 5 x 10
6 HCT116-celler som var stabilt transfektert med MIR-30c ble injisert subkutant i høyre flanke i nakne mus. Tumorstørrelse ble målt ved hjelp av målepunktet hver 4. dag. Både maksimum (L) og minimum (W) lengde av tumoren ble målt, og tumorstørrelsen ble beregnet som ½LW
2. Etter 30 dager ble musene avlivet og fotografert. Svulster ble høstet og veiet. I tillegg ble 2 x 10
6-celler injisert i halevenen til nakne mus. Etter 18 dager ble lungene fjernet og skylt, og lungemetastatiske kolonier ble tellet ved visuell inspeksjon. Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. Tre dyr ble inkludert i hver gruppe.
Statistisk analyse
Programvaren SPSS V20.0 ble brukt for statistisk analyse. Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM, og alle data har blitt gjentatt minst tre ganger. Students t-tester ble benyttet for å bestemme den statistiske signifikans av forskjeller mellom gruppene. Spearmans korrelasjon ble brukt til å identifisere sammenhengen mellom MIR-30c uttrykk og ADAM19 uttrykk. Forskjeller med
p
. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
MiR-30c ble nedregulert i tykktarm kreft vev
For å bestemme uttrykket av MIR-30c i kliniske vev, samlet vi 60 par av menneskelige tykktarmskreftprøver og deres tilstøtende og ikke-tumor slimhinner vev. Som indikert ved resultatene av QRT-PCR-analyse, MIR-30c ekspresjonsnivået var åpenbart nedregulert i 54 ut av 60 tumorprøver, sammenlignet med de tilstøtende normale slimhinne vev (Fig. 1). Sammenhengen mellom MIR-30c og clinicopathological funksjonen ble analysert (tabell 2). Disse data indikerer at MIR-30c blir redusert i tykktarmskreft, og det kan være forbundet med humane tykktarmskreft progresjon.
MiR-30c-ekspresjon ble undersøkt ved QRT-PCR i 60 par av humane tarmkreft vev. 54 ut av 60 tumorprøver viste redusert ekspresjon av MIR-30c, sammenlignet med de tilstøtende normale vev mucosa. MiR-30c uttrykk ble normalisert til at av U6 i hver prøve.
MiR-30c hemmet celledeling in vitro
QRT-PCR ble brukt for å påvise relative uttrykk nivå av MIR-30c i forskjellige tykktarmskreftcellelinjer og Lovo ble anvendt som kontrollgruppe. Som vist på fig. 2A, HCT116 hadde en relativt lavere MIR-30c uttrykk nivået blant disse fem cellelinjer. Derfor vi forbigående transfektert MIR-30c ligner i HCT116-celler og MIR-30c inhibitor i Løvø celler og MIR-30c uttrykk ble validert ved QRT-PCR (Fig. 2B). Disse cellene ble deretter utsatt for MTT-analyse. Som forventet, MIR-30c hemmer forfremmet mens MIR-30c ligne trykt spredning av celler (Fig. 2C, 2D). Å grundig undersøke fenotype, ble kolonidannelse analysen vedtatt. Konsekvent, MIR-30c overekspresjon trykt kolonien dannelsen av tykktarmskreftceller (Fig. 2E, 2F).
(A) Relative uttrykk nivåer av MIR-30c i fem tykktarmskreft cellelinjer ble oppdaget med kvantitativ real -time PCR (QRT-PCR). Kolonner, gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter; barer, S.E. (B) HCT116 eller Løvø celler ble transient transfektert med MIR-30c etterligne eller NC ligne og hemmer eller NC-hemmer henholdsvis. Uttrykket av MIR-30c ble bestemt ved QRT-PCR etter 24 timer. (C-D) Effekter av MIR-30c på proliferasjon ble undersøkt ved MTT-analyse. Poeng er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter; barer representerer bred singlett .; *
p
0,05; **
p
0,01. (E) Effekter av MIR-30c på proliferasjonen av HCT116-celler ble undersøkt ved kolonidannelsesbestemmelsen. (F) Antall kloner ble analysert kvantitativt. *
p
0,05; **
p
. 0,01
MiR-30c hemmet celle migrasjon og invasjon evne tykktarm kreft celler
For å forstå effekten av MIR-30c på celle migrering og invasjon, migrering og invasjon Transwell og sårheling analyser ble utført. Resultatene indikerte at overekspresjon av MIR-30c åpenbart hemmet mens nedregulering av MIR-30c forfremmet migrasjon og invasjon evnene til tykktarmskreftceller (Fig. 3A-3D). Videre sårheling assay ble brukt for å studere innflytelsen av MIR-30c på migrering av SW620-celler (fig. 3E, 3F). Resultatene viste at Mir-30c kunne hemme migrasjonsrate av tykktarmskreftceller. Til sammen MIR-30c var sannsynlig til å spille en viktig rolle i celle migrasjon og invasjon.
(A-B) Effekter av MIR-30c om migrasjon ble analysert ved Transwell migrasjon analysen. A, representative bilder; B, kvantitativ analyse. (C-D) Effekter av MIR-30c for invasjon ble analysert ved hjelp av Transwell invasjon assay. C, representative bilder; D, kvantitativ analyse. (E-F) F, sårheling analysen ble vedtatt å evaluere effekten av MIR-30c på migrasjon. Den kunstige gapet var gjennom den sentrale akse når cellene nådde en tetthet på 80%. Bilder av celler ble tatt ved 0 og 24 timer. E, representative bilder; F, kvantitativ analyse. *
p
0,05; **
p
. 0,01
ADAM19 var et direkte mål på MIR-30c
Bioinformatikk strategier ble brukt til å søke på potensielle mål fra Mir-30c som formidlet MIR-30c vekst og metastase hemming. Alle de fire bioinformatikk algoritmer, miRBase, TargetScan, PicTar, og Miranda ble brukt og deretter MIR-ontologi Database ble brukt. Til slutt, ADAM19 ble identifisert som et cancer-assosiert genet. ADAM19 3′-UTR besatt en perfekt komplementær region i posisjon 3539-3546nt for MIR-30c. I tillegg TargetScan viste at bindingsstedene for MIR-30c er evolusjonært konservert i forskjellige vertebrale arter (fig. 4A). Videre har både western blot og QRT-PCR foreslått en nedregulering av ADAM19 i HCT116-celler etter transfeksjon med MIR-30c etterligne (fig. 4B, 4C). Videre forsøk viste at uttrykket nivåer av MIR-30c og ADAM19 ble omvendt korrelert i flere tykktarmskreftcellelinjer og kliniske kreftprøver bestemmes av QRT-PCR (fig. 4D, 4E). Consitently, ADAM19 ble oppregulert i tumorvev oppdaget av western blot (Fig. 4G). Disse dataene viste at ADAM19 var sannsynlig å bli målrettet av MIR-30c både transcriptionally og post-transcriptionally. For å forklare den detaljerte mekanisme, ble luciferase reporter-målingen ble utført. Som vist på fig. 4E, forbigående co-transfeksjon av MIR-30c ligne og pmiRGLO-wt 3′-UTR vektor (som inneholdt MIR-30c målområde) inn HEK293T celler med førte til en markert reduksjon i reporter aktivitet. Men reduksjonen ble avskaffet da MIR-30c ligne og en konstruksjon der målet nettstedet ble slettet fra ADAM19 3′-UTR-reporter ble transfektert inn HEK293T celler (Fig. 4F). Samlet utgjør disse funnene viste at Mir-30c hemmet ADAM19 uttrykk ved direkte rettet mot den ADAM19 3′-UTR
(A) Den antatte rettet mot området med MIR-30c av ADAM19 3′-UTR.; MiR-30c targeting sekvenser av ADAM19 3′-UTR er evolusjonært konservert gjennom åtte arter (HSA: menneske; Ptr: sjimpanse, MML: rhesus, Oga: bushbabay; Tbe: trespissmus; MMU: mus, Rno: rotte, og Ocu: kanin .). De rettet mot områdene er markert med rødt. (B-C) QRT-PCR og western blot analyse ble brukt for å detektere mRNA og protein uttrykk for ADAM19 i HCT116 cellene etter transfeksjon av MIR-30c etterligne eller NC ligne. (D) ADAM19 mRNA og MIR-30c uttrykk nivå ble bestemt i fem tykktarmskreft cellelinjer ved QRT-PCR. (E) ADAM19 mRNA og MIR-30c nivåer ble omvendt korrelert i tykktarm kreft vev som bestemmes av QRT-PCR. β-aktin og U6 ble anvendt som endogene kontroller, respektivt. (F) HEK293T celler ble ko-transfektert med villtype eller mutant journalister og MIR-30c etterligne eller negativ kontroll (NC ligne). Etter 48 timer ble Luciferase /Renilla aktivitet målt. (G) ADAM19 ble oppregulert i tykktarm kreft vev sammenlignet med normalt vev, som indikert av Western blotting.
ADAM19 mediert svulst undertrykkende effekt av MIR-30c
Basert på disse ovennevnte bevis gjorde vi hypotesen om at ADAM19 tilskrives den anti tumorous effekten av MIR-30c. For å bevise dette testet hypotesen, konstruerte vi en vektor ved hjelp av en cDNA som ikke inneholdt 3′-UTR av ADAM19, etterpå vektoren og MIR-30c mimic /NC mimic ble ko-transfektert inn i HCT116-celler. MiR-30c og ADAM19 uttrykk ble undersøkt med henholdsvis QRT-PCR og western blot (Fig. 5A, 5B). Transwell migrasjon og invasjon analyser viste at restaurering av ADAM19 var i stand til å avskaffe MIR-30c indusert migrasjon og invasjon hemming (Fig. 5C, 5D). Av interesse, Transwell analyser indikerte at knockdown av ADAM19 av siRNA kunne undertrykke migrasjon og invasjon av celler, som var lik effekten av MIR-30c overekspresjon (Fig. 5E, 5G og 5H). I tillegg fant vi ut effekten av MIR-30c og ADAM19 på EMT prosess. QRT-PCR resultater demonstrateed at E-cadherin ble oppregulert, mens N-cadherin og vimentin ble hemmet av overekspresjon av MIR-30c eller stanse av ADAM19 (fig. 5F), derfor MIR-30c og ADAM19 kan være involvert i regulering av EMT prosess. Samlet sett ADAM19 kan være et funksjonelt mål av MIR-30c.
(AB) Uttrykket av MIR-30c og ADAM19 ble undersøkt ved QRT-PCR (A) og western blot analyse (B), henholdsvis i HCT116 cellene som ble ko-transfektert med MIR-30c etterligne (eller NC etterligne) og ADAM19 (eller pcDNA3.1 (+)). p-aktin ble benyttet som det endogene kontroll. (C-D) Cellene ble underkastet Transwell migrering og invasjon analyser. C, representative Transwell bilder; D, kvantitativ analyse. (E) HCT116-celler ble transfektert med ADAM19 siADAM19 eller siRNA negativ kontroll (sinc). Etter 48 timer ble ADAM19 uttrykk oppdaget med western blot. (F) E-cadherin, N-cadherin og vimentin ble oppdaget av QRT-PCR etter transfektert med siADAM19 /sinc og MIR-30c ligne /NC ligne. Kolonnene representerte den relative uttrykket til sinc og NC ligner grupper hhv. (G-H) Etter transfektert med siRNA eller sinc, HCT116 cellene ble utsatt for Transwell migrasjon og invasjon analyser. G, representative Transwell bilder; H, kvantitativ analyse. *
p
0,05; **
p
. 0,01
MiR-30c hemmet tumorvekst og metastasering in vivo
For å analysere funksjon av MIR-30c in vivo, den nakne mus xenograft-modell ble anvendt. Vi først bygget MIR-30c stabilt overekspresjon celler ved hjelp av HCT116 cellelinje (fig. 6A). Som det hadde høyest MIR-30c uttrykk ble # 4 klone valgt i følgende eksperimenter. Cellene ble injisert subkutant i flanken til nakne mus og tumorstørrelsene ble målt hver fjerde dag. Mus ble avlivet og subkutane tumorer ble veiet etter fire uker. Resultatene viste at Mir-30c førte til en markert nedgang i tumorstørrelse og vekt sammenlignet med modellgruppe (Fig. 6B-6D). Som vist på fig. 6E, redusert MIR-30c veksten av svulster in vivo. I tillegg, ekspresjon av MIR-30c i miRNA behandlede gruppe var høyere enn i mock-gruppen (fig. 6F). Hva mer, in vivo tumormetastaser analysen viste at Mir-30c kunne hemme lungemetastase (Fig. 6G, 6H). Totalt data foreslo anti-tumor effekt av MIR-30c in vivo.
(A) Den stabile overekspresjon av MIR-30c i HCT116 cellekloner ble bestemt med QRT-PCR. (B) 5 x 10
6 HCT116-celler som var stabilt transfektert med MIR-30C eller tom vektor (mock) ble subkutant injisert inn i nakne mus (n = 3). Musene ble avlivet 28 dager etter injeksjon. (C) Svulster ble høstet og representative svulster ble vist. (D) Svulster ble veid og Mir-30C overekspresjon gruppen hadde en lavere vekt sammenlignet med modellgruppe. (E) MiR-30c overekspresjon resulterte i hemming av vekst. (F) Uttrykket av MIR-30c ble påvist med QRT-PCR i tumorer. (G-H) Hematoxylin og eosin farging av deler av lunge og statistiske resultatene av metastasering noder. **
p
. 0,01
Diskusjoner
mirnas er deregulert i ulike typer kreft og dermed funksjon som tumor-undertrykkere eller onkogene ved interaksjon med sine tilsvarende mål. Det er imidlertid forholdsvis begrenset informasjon som ligger til grunn den detaljerte mekanisme av miRNA involvert i kreft kjent. MiR-30c har vært undersøkt i en rekke kreftformer. Den er nedregulert meste av rapportert undersøkelser som i ikke-småcellet lungekreft, prostatakreft, leukemi, livmorkreft, brystkreft og tykktarmskreft [8,19,20,21,22]. Imidlertid har flere studier har rapportert den oppregulering av MIR-30c i brystkreft, nyrecellekreft [23,24]. MiR-30c utøver sin funksjon ved å involvere i tumorprogresjon, forutsi prognose eller kjemoterapi effekt i disse kreftformene. Av interesse, noen kontroversielle bevis eksisterer med hensyn til funksjonen av MIR-30c. Dette belyser den kompliserte rollen MIR-30c i tumorgenesen og progresjon, til tross for sin anti-tumor eller onkogene naturen. I vår studie presenterer vi at Mir-30c kanskje omvendt regulere tykktarmskreft progresjon ved å undertrykke celleproliferasjon, migrasjon og invasjon. Videre er MIR-30c redusert både i kliniske prøver og cellelinjer sammen med up-regulerte nivåer av ADAM19. ADAM19 er en direkte funksjonell mål av MIR-30c identifisert av luciferase analyser og in vitro-eksperimenter. Alle våre data tyder på at Mir-30c spiller en viktig rolle i tykktarmskreft.
For å identifisere potensielle mål av MIR-30c, fire bioinformatikk algoritmer ble brukt. Etter en primærscreening, er ADAM19 identifisert som mål for MIR-30c fordi det er nært forbundet med tumorous prosessen. ADAM er en matriksmetalloproteinase-relaterte proteinfamilie som hører til sink protease superfamilien. ADAM familien kunne binde med inte reseptor og fungere som metalloprotease. De er også presentert med et cytoplasmatisk domene [25]. Adams (disintegrin metallproteasene) familie er involvert i en mengde aktiviteter som membranfusjon, vekstfaktor cytokin og Shedding, cellemigrasjon, sammen med muskelutvikling, gjødsling, og celle skjebne besluttsomhet [26]. Adams kunne nedbrytes ECM-molekyler og markeds kreft metastaser på grunn av deres proteinase aktivitet som er lik MMP’er. Det er mer enn tjue medlemmer av ADAM familien. ADAM19 er et viktig medlem av ADAM familien. Forskjellige studier har vist at ADAM19 er involvert i mange typer av sykdommer. Det er rapportert at muligheten for at mutasjoner i ADAM19 kan bidra til menneskelig medfødt hjerteventil og septumdefekter [27]. Noen forskere fra Kina viste at ADAM19 kan ha effekter på testis utvikling og kronisk obstruktiv lungesykdom. inkludert kreft. Hva mer, noen data tyder på at ADAM19 kan være involvert i de viktigste prosessene i kjertelsekresjon, trophoblast invasjon og nedbrytning av ekstracellulær matrix tidlig i svangerskapet [28]. I tillegg ble ADAM19 funnet å være oppregulert i nyrecellekreft og primære hjernesvulster og fremmet invasivitet av svulstene [29,30]. Det er relativt lite studier på miRNA rettet mot Adams tross at en fersk studie fant transformerende vekstfaktor-β signale regulerer ADAM uttrykk i eksperimentell renal fibrose via MIR-29 [31]. Funksjonen til ADAM19 er fremdeles uklart. I vår studie fant vi at ADAM19 kunne fremme invasivitet av tykktarmskreftceller for første gang
MiR-30c tilhører MIR-30 familien som består av fem medlemmer. MIR-30a, b, c , d, og e. Interessant, disse fem medlemmene har ulike funksjoner. MiR-30c har vist seg å fungere som enten onkogen eller tumor suppressor i ulike typer av kreft. Konsekvent, virker MIR-30a som en tumor suppressor i betydelige typer av maligne tumorer, inkludert lungekreft, brystkreft, magekreft, kreft i skjoldbruskkjertelen, leukemi og [6,32,33,34,35]. MiR-30b kan forby apoptose av glioma celler og lungekreft celler [36]. Mens, er MIR-30b stand til å redusere cellevekst i brystkreft og hindre EMT i leverkreft med interaksjon med cyclin E2 (CCNE2) og Snail1 henholdsvis [32,37]. Men MIR-30d er sannsynlig å fungere som et onkogen i et flertall av forskere [38,39,40,41]. Tilsvar med MIR-30a, kan MIR-30e hemme spredning i kreft [16] og er også anerkjent som en prognose prediktor i nasofaryngeal karsinom [42]. Dette fenomenet er rimelig som miRNA utføre i mål avhengige og vev-spesifikk måte. Den miRNA-30 familien dele den samme frø sekvens ble imidlertid ingen dramatiske ytterligere effekter generert etter tvangs uttrykk for disse fem medlemmer samtidig (data ikke vist) som antyder at det ikke er noen synergistisk effekt av dem. Hemming effekten av MIR-30c på ADAM19 er mest åpenbare blant alle de fem medlemmene av MIR-30 familien angitt med QRT-PCR og luciferase assay. Derfor fokuserer vi på MIR-30c i vår studie.
Det er vel kjent at en enkelt miRNA kan regulere flere mål og hver mRNA kan også styres av flere miRNAs. I vår studie fant vi at MIR-30c induserte en 20% reduksjon av ADAM19 uttrykk imidlertid økt migrasjon og invasjon sats mer enn 20% (Fig. 5B VS 5D). Det indikerte at noen andre genet Målene er involvert i endringer indusert av MIR-30c.
Til sammen viser denne studien for første gang at Mir-30c undertrykker kreft cellevekst, migrasjon og invasjon av direkte rettet mot ADAM19 som kan fremme malignance av tykktarmskreftceller. De nylig identifiserte MIR-30c /ADAM19 akse kaste nytt lys på miRNA-baserte reguleringsmekanisme. Tatt i betraktning den avgjørende rollen MIR-30c i tykktarmskreft, kan manipulering av MIR-30c representerer en potensiell ny terapeutisk mål for behandling av tykktarmskreft.
Takk
Vi takker Mr. Zhao for mus å holde .
