Abstract
Bakgrunn
Om lag 60-80% av pasienter med avansert hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) dø innen fem år etter diagnose. Cisplatin-basert kjemoterapi er den mest brukte palliativ behandling for disse pasientene. For å evaluere den prognostiske verdien av X-bundet hemmer av apoptose (XIAP) nivå som en potensiell biomarkør for disse pasientene, undersøkte vi sammenhengen mellom XIAP uttrykk og cisplatin respons av disse pasientene og deres prognose.
Metodikk /Principal funn
Seksti pasienter med avansert HNSCC ble rekruttert i denne studien. Uttrykk for XIAP ble undersøkt både før og etter kjemoterapi og ble korrelert med kjemoterapi respons, clinicopathology parametre og kliniske utfall av pasientene. Vi fant at XIAP ble uttrykt i 17 (20,83%) av de 60 avanserte HNSCC prøver og uttrykk ble signifikant assosiert med cisplatin motstand (P = 0,036) og dårlig klinisk utfall (P = 0,025). Cisplatin-basert kjemoterapi indusert XIAP uttrykk i disse post-kjemoterapi prøver (P = 0,011), ble ytterligere assosiert med dårligere klinisk resultat (P = 0,029). Multivariat analyse viste at bare alkoholforbruk, lymfeknutemetastase og XIAP nivå var uavhengig assosiert med prognosen av avanserte HNSCC pasienter. Hemme XIAP uttrykk med siRNA i XIAP overexpressed HNSCC celler bemerkelsesverdig økt følsomhet for cisplatin behandling til nesten en tre gangers forskjell.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater viser at XIAP overekspresjon spiller en viktig rolle i sykdomsforløpet og cisplatin-motstand av avansert HNSCC. XIAP er en verdifull prediktor for cisplatin-respons og prognose for pasienter med langt fremskreden hode- og halskreft. Nedregulering av XIAP kan være en lovende adjuvant behandling for pasienter med avansert HNSCC
Citation. Yang X-H, Feng Z-E, Yan M, Hanada S, Zuo H, Yang C-Z, et al. (2012) XIAP Er en Predictor av Cisplatin kjemoterapi Response og prognose for pasienter med avansert hode- og halskreft. PLoS ONE 7 (3): e31601. doi: 10,1371 /journal.pone.0031601
Redaktør: Torbjørn Ramqvist, Karolinska Institutet, Sverige
mottatt: 1 september 2011; Godkjent: 10 januar 2012; Publisert: 05.03.2012
Copyright: © 2012 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Project av National Natural Science Foundation of China (Grant nr 30772433), prosjektleder for Science and Technology Commission av Shanghai kommune (Grant No. 07QA14038), og Shanghai Ledende akademisk disiplin Project (prosjekt nr S30206). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er den femte vanligste kreftformen i verden, og er den vanligste svulst i sentral-Asia [1]. Selv tidlig stadium HNSCC har høye kur priser, opptil 50% av pasientene stede med avansert sykdom [2]. Blant disse avanserte stadium HNSCC pasienter, vil 60-80% dør innen 5 år etter diagnose [3]. Foreløpig er cisplatin-basert kjemoterapi den mest brukte palliativ behandling for disse pasientene. Men i klinikken bare et begrenset antall pasienter har nytte av cisplatin-basert kjemoterapi; andre pasienter er motstandsdyktig mot denne behandlingen og noen vil dø på grunn av behandlingsrelatert toksisitet [4]. Derfor er det viktig å se etter prediktorer eller potensielle biomarkører som kan bidra til å identifisere pasienter som kan ha nytte av cisplatin-basert kjemoterapi.
hemmere av apoptose proteiner (IAP) representerer ett sett med potente endogene modulatorer av apoptose i pattedyrceller, som består av åtte medlemmer: XIAP, cIAP1, cIAP2, survivin, NIAP, Bruce, ML-IAP og ILP-2 [5]. Disse proteinene medierer flere biologiske funksjoner som inkluderer binding til og inhibering av kaspaser, som regulerer cellesyklusprogresjon, og modulering av reseptor-mediert signaltransduksjon [6]. Blant dem, X-bundet hemmer av apoptose (XIAP) er en av de mest potente inhibitoren av kaspaser og apoptose. XIAP kan direkte binde seg til og inhibere både initiator og effektor caspaser og hemmer både mitokondrie-avhengige og-Uavhengig apoptotiske reaksjonsveier [7], [8], [9]. Nylige funn har vist
in vitro
, XIAP kan føre til resistens hos tumorceller når de utsettes for en rekke av apoptotiske stimuli, inkludert kjemoterapi [10], [11]. Imidlertid er det ikke kjent om XIAP ekspresjonsnivå kunne bli brukt til å forutsi den cisplatin responsen av avansert HNSCC. Derfor er målet med vår studie var å undersøke uttrykket av XIAP i avansert HNSCC og dens forhold til cisplatin respons og prognose for disse pasientene.
Resultater
XIAP uttrykk nivå er assosiert med en dårlig kliniske resultatet av avanserte HNSCC pasienter
XIAP var hovedsakelig lokalisert i cytoplasma av tumorceller (figur 1), med svært variabel positiv sats fra 1% -85%. Nucleus farging ble tidvis observert hos noen post-kjemoterapi prøver. Pasienter med tumorer uttrykte høye nivåer av XIAP generelt hadde en dårligere prognose enn pasienter med tumorer uttrykte lave nivåer av XIAP i pre-kjemoterapi kreft vev (total overlevelse
P
= 0,025, Log Rank test, figur 2). XIAP uttrykk Renten ble ikke korrelert med TNM stadium, patologisk karakter, røyking og alkohol historien til disse pasientene med avansert HNSCC (tabell 1). I multivariat analyse, lymfeknutemetastase, alkoholforbruk og XIAP uttrykk (pre-kjemoterapi) var uavhengige risikofaktorer for pasientenes prognose (tabell 2)
A.: Negativ kontroll med PBS i stedet for første antistoff; B: Lav ekspresjon av XIAP (prosentandelen av positive hastighet 25%); C:. Høy uttrykk for XIAP (prosentandel av positiv rate 25%)
A: Total overlevelse ved XIAP score. Pasienter med tumorer uttrykte høye nivåer av XIAP generelt hadde en dårligere prognose enn pasienter med tumorer uttrykte lave nivåer av XIAP i pre-kjemoterapi kreft vev; B: Samlet overlevelse av chemoresponse. Pasienter med tumorer var lydhør overfor kjemoterapi generelt hadde en bedre prognose enn de pasientene som svulsten var resistent mot kjemoterapi; C: XIAP score til post-kjemoterapi prøver. XIAP nivåer i post-kjemoterapi prøvene ble også signifikant relatert til pasient generelle overlevelse.
XIAP uttrykk nivå var assosiert med kjemoterapi respons hos pasienter med avansert HNSCC
Alle disse avanserte HNSCC pasientene var ferdig med en syklus av kjemoterapi. Blant dem, 34 tilfeller var komplett respons (CR) og partiell respons (PR) til kjemoterapi og 26 tilfeller var progressiv sykdom (PD) og stabil sykdom (SD). Pasientene med tumorer uttrykte høye nivåer av XIAP var betydelig mer motstandsdyktig mot cisplatin kjemoterapi og generelt hadde dårligere kjemoterapi svar (
P
= 0,005, Tabell 1). XIAP uttrykk nivåene ble betydelig økt i etter kjemoterapi HNSCC vev sammenlignet med pre-kjemoterapi prøver (
P
= 0,011, Tabell 3). XIAP nivåer i post-kjemoterapi prøvene ble også signifikant relatert til den generelle overlevelse for disse pasientene (
P
= 0,029) (figur 2), men i multivariat analyse, det var ikke en faktor knyttet til pasientene «utfall.
hemme XIAP uttrykk sensibilisert HNSCC cellelinjer til cisplatin behandling
for å undersøke tilfeldig forhold til XIAP uttrykk og narkotika respons hos pasienter som brukte vi siRNA å hemme XIAP uttrykk i HNSCC cellelinje CAL27 og WSU-HN13. Tre sirnas ble utformet for å hemme uttrykk for XIAP i CAL27 og WSU-HN13 celler, og blant dem, fikk siRNA1 behandlingsgruppe near70% reduksjon av XIAP mRNA uttrykk i begge celler (figur 3). Sammenlignet med den negative kontrollgruppen, cisplatin IC50-verdien i siRNA1 gruppe ble redusert fra 0,51 ug /ml til 0,20 ug /ml (
P
= 0,05, figur 4) i CAL27 og fra 4,32 til 1,82 ug /ml i WSU -HN13.
Hemming effekten av siRNA-1, siRNA-2 og siRNA-3 på uttrykk for XIAP mRNA ble undersøkt i CAL27 celle (Øvre) og WSU-HN13 celle (Lower) med real-time PCR . XIAP siRNA1 behandlingsgruppen oppnådd nær 70% reduksjon av XIAP mRNA uttrykk i begge celler.
XIAP siRNA-en effektivt hemmet uttrykket av XIAP protein i både CAL27 og WSU-HN13 celler (Øvre) og redusert den cisplatin IC50 verdi fra 0,51 mg /ml til 0,20 ug /ml i CAL27 og fra 4,32 til 1,82 ug /ml i WSU-HN13 (Nedre).
Diskusjoner
Cisplatin- basert neoadjuvant kjemoterapi, kirurgi og strålebehandling brukes til å bli ansett som standard regime for avanserte HNSCC pasientene i høyrisiko; imidlertid, den terapeutiske effekten av neoadjuvant terapi forblir ufullstendig på grunn av mange randomiserte forsøk ikke å vise en overlevelsesfordel med bruk av neoadjuvant kjemoterapi [12], [13]. Selv ukritiske bruk av neoadjuvant kjemoterapi adresser ingen fordel for pasientenes utfall (fem-års overlevelse var 38,33% i vår studie), fant vi de pasientene som oppnådde en klinisk respons hadde en mer gunstig prognose (p = 0,001, log-rank test ), som er forenlig med noen tidligere rapporter [12], [13]. Fra dette synspunkt, vurdere hvordan du selektivt velge pasienter som vil positivt nytte av neoadjuvant kjemoterapi var den avgjørende faktoren for vellykket behandling [4].
I denne studien har vi funnet en sterk sammenheng mellom uttrykk nivå XIAP og klinisk respons og prognosen for pasienter med avansert HNSCC. Lav XIAP uttrykk var nært korrelert med kjemoterapi respons og gunstig prognose, mens høy XIAP uttrykk kan forutsi kjemoterapi svikt og dårlig resultat. Resultatene er i overensstemmelse med tidligere rapporter som viser at nedregulering av XIAP sensitizes kreftceller til terapeutiske legemidler i lunge cancer, prostata cancer, eggstokk-kreft og kreft i bukspyttkjertelen [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19], [20]. Viktigere, har vi funnet at cisplatin-basert kjemoterapi sterkt indusert uttrykk for XIAP i avansert HNSCC. Jo høyere XIAP nivå i post-kjemoterapi prøvene også forbundet med en dårligere prognose av pasientene. Våre resultater viser at XIAP uttrykk er en primær årsak til behandlingssvikt og kjemoterapi-indusert ekspresjon XIAP førte til en dårlig prognose av de legemiddelresistente pasienter. Forhånds valgt XIAP negative pasienter kan ha nytte av cisplatin-basert neoadjuvant behandling. Våre
in vitro
data videre foreslått en potensiell verdi for inhibering av XIAP uttrykk for å forbedre effektiviteten av kjemoterapi.
Det skal bemerkes at i motsetning til de fleste studier, observerte vi en positiv sammenheng mellom alkoholforbruk og total overlevelse av avanserte HNSCC pasientene i denne studien. Interessant, et lignende resultat har blitt publisert nylig, som foreslo forskjellene i våre data og kulturell tradisjon kan være forårsaket av ulike drikkevaner: de avanserte HNSCC pasienter fra Kina ofte drakk brennevin med svært høy konsentrasjon av alkohol (vanligvis 50%) , mens Vesten vanligvis konsumere drinker med mye lavere konsentrasjon av alkohol. Slike høye konsentrasjoner av alkohol kan stimulere munnslimhinnen og ødelegge bakterier balanse, påvirker sykdomsforløpet av avansert HNSCCC [21]. Vi kan ikke utelukke mulighetene for begrenset utvalgsstørrelse og /eller andre faktorer som kan ha bidratt til denne observasjonen.
Denne studien var en retrospektiv case-kontrollstudie og hadde noen begrensninger. I denne studien, valgte vi IHC å evaluere XIAP uttrykk i stedet for noen kvantitative metoder primære grunn av utilgjengelighet av ferske biopsi vev. Selv om IHC er en semi-kvantitativ metode, er det nå den mest brukte, enkleste og mest kostnadseffektive protokoll i klinisk arbeid [22]. Også, frekvensen av høy XIAP uttrykk i pre-kjemoterapi prøvene var bare 20,83%, mens kjemoterapi responsrate (CR + PR) av pasientene var 43,34%. Det er mer enn sannsynlig at mange faktorer kan bidra til den samlede legemiddelrespons i avansert HNSCC; XIAP uttrykk kan bare være en av mange faktorer involvert.
Funn fra studien har potensielt viktige kliniske implikasjoner. Først vår studie viste for første gang at XIAP ekspresjon er assosiert med kjemoterapi respons og kan brukes som en biomarkør for å forutsi klinisk utfall av avanserte HNSCC-pasienter, særlig for dem som har hatt cisplatin baserte kjemoterapeutiske behandling. For det andre kan XIAP uttrykk være en nyttig biomarkør for å velge pasienter som har størst sjanse til å dra nytte av cisplatin-basert neoadjuvant kjemoterapi. Til slutt, årsakssammenheng mellom XIAP uttrykk nivå og kjemoterapi respons tyder på at nedregulering av XIAP kan være en lovende adjuvant behandling for avanserte HNSCC pasienter.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Ninth Folkets sykehus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine og utføres i henhold til anbefalingene fra Helsinkideklarasjonen. Ingen informert samtykke (skriftlig eller muntlig) ble oppnådd for bruk av retrospektive vevsprøver fra pasienter i denne studien, hvorav mange ble avdøde, siden etikkomiteen, som fravikes behovet for samtykke, ikke anser det nødvendig. Alle prøvene var anonym.
Cell Culture
Menneskelig HNSCC cellelinje CAL27, som var resistent mot behandling med cisplatin, ble hentet fra den amerikanske Tissue Cell Collection (Manassas, VA, USA) og kultivert i DMEM (Gibco, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% glutamin og 1% penicillin-streptomycin. WSU-HN13 cellelinje [23] ble begavet fra University of Maryland Dental School (Baltimore, MD, USA) og også dyrket i DMEM (Gibco, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% glutamin og 1 % penicillin-streptomycin
pasienter og vevsprøver
Seksti pasienter med avansert HNSCC. (klinisk stadium III /Iva,.. UICC /AJCC 7 ed, 2010) ble rekruttert i denne studien. Alle pasienter har akseptert cisplatin-basert neoadjuvant kjemoterapi etterfulgt av radikal tumorreseksjon innen to til tre uker etter endt kjemoterapi ved Institutt for oral og maxillofacial kirurgi, niende Folkets sykehus, Shanghai Jiao Tong University fra januar 1999 til desember 2004.
Den kliniske respons på kjemoterapi ble evaluert ikke mindre enn 2 uker etter pasienter full kjemoterapi i henhold til responsevalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) [24]. En CR ble definert som fullstendig forsvinning av alle målbare lesjoner, uten forekomsten av noen nye lesjoner. En PR ble definert som en reduksjon i bi-dimensjonalt målbare lesjoner med minst 50 prosent av summen av produktene av de største perpendikulære diametre og et fravær av progresjon i andre lesjoner, uten forekomsten av noen nye lesjoner. SD [9] ble definert som en reduksjon i tumorvolum på mindre enn 50 prosent eller en økning i volumet av en eller flere målbare lesjoner av mindre enn 25 prosent, uten at fremkomsten av nye lesjoner. PD ble definert som en økning i størrelsen på i det minste en bi-dimensjonalt målbar lesjon med minst 25 prosent, og fremkomsten av nye lesjoner. Pasient clinicopathologic informasjon presenteres i tabell 4. Alle pasientene ble behandlet med standard kurative operasjoner med negativ reseksjon margin. Alle pasientene fikk postoperativ strålebehandling innen to-seks uker å fullføre operasjonen. Total dose for primær tumorområdet og halsen lymfeknuter var 6000cGy og for primærtumor og nakke negative noder var 5000 cGy.
Western Blot analyse
Totalt protein ble lysert i to x lyseringsbuffer inneholdende 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5% vekt /volum SDS, og 24,75% glycerol. 40 ug proteiner ble separert ved anvendelse av 12% SDS-PAGE og deretter overført til PVDF-membraner. Etter inkubering over natten med monoklonalt mus-anti-human XIAP (BD, USA) i en fortynning på 1:4000 og en times inkubasjon med IRDye 800CW geite-anti-muse-sekundært antistoff (LI-COR, USA), ble det signal scannet og analysert bruker Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR biovitenskap, USA). β-aktin (Sigma-Aldrich, USA) ble anvendt som en intern kontroll.
real-time PCR
Det totale RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen, USA). 1 mikrogram total RNA wasreverse transkribert til cDNA ved hjelp av oligo-dT primer og PrimeScript II RTase (Takara, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner. Real-time PCR ble utført med termosykler Dice Real Time System (Takara, Japan). Primere for PCR ble utformet med Primer Express® programvare v3.0 (Applied Biosystems, USA). Primersekvensene i XIAP var: 5′-CCGGCTGTCCTGGCGCGAAA-3 «og 5′-GCTCGTGCCAGTGTTGATGCTGA-3». Primersekvensene i β-actin var: 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3 «og 5′-GGGCCGGACTCGTCATACT-3′, og primersekvensene av GAPDH var: 5»-AATTGAGCCCGCAGCCTCCC 3 «og 5′-ACCAGGCGCCCAATACGACC-3». Alle primere ble separert ved hjelp av minst ett intron på den tilsvarende genomisk DNA. Dissosiasjonskurve analyse ble inkludert i alle reaksjoner for å utelukke ikke-spesifikk amplifikasjon. Den relative mengden av XIAP mRNA nivået ble beregnet basert på standard ΔΔCT metoder [25]. Både β-aktin og GAPDH ble brukt som intern kontroll.
siRNA knockdown
Tre anti-XIAP sirnas hvert rettet mot de to spleise varianter av XIAP og en FAM-merket negativ kontroll siRNA (ikke- målsekvens), ble syntetisert ved GenePharma (Shanghai, Kina). Sekvensene var: siRNA1: GGUCAGUACAAAGUUGAAATT, siRNA2: GCAGGUUGUAGAUAUAUCATT, siRNA3: CCGGAAUCUUAAUAUUCGATT og negativ kontroll: AAUUCUCCGAACGUGUCACGU. Transfeksjon ble utført ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) etter produsentens protokoll.
Immunohistochemistry
før og etter kjemoterapi representant vev parafinblokker ble kuttet i 5 mikrometer seksjoner for standard immunhistokjemisk farging (IHC ). Etter varmeinduserte antigen gjenfinning i sitronsyrebuffer (pH 7,0) i 20 min og blokkering i 5% geiteserum i 30 min, ble objektglass inkubert med monoklonalt mus anti-human XIAP (BD, USA) i en fortynning på 1: 100 ved 4 ° C over natten. Utelatelsen av det primære antistoff tjente som negativ kontroll. Bundet antistoff ble oppdaget av en Super Sensitive IHC Detection System (BioGenex, USA), i henhold til produsentens protokoll. Snittene ble gjort synlige med diaminobenzidin tetrahydroklorid (Sigma, USA) oppløsning og motfarget med Harris hematoksylin. Fargingen Resultatet ble bestemt ved telling 1000 tumorceller i tre 100 x forstørrelse felt ved to uavhengige patologer og videre klassifisert som lav ekspresjon (prosentandelen av positive hastighet 25%) og høy ekspresjon (prosentandelen av positive hastighet ≥25%) .
Drug Sensitivity Assay
celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 4 x 10
3 celler /brønn og inkubert ytterligere i 24 timer. 6 timer etter transfeksjon med negativ kontroll eller siRNA, ble mediet fjernet og erstattet med friskt medium containingone av seriefortynninger av DDP i ytterligere 72 timer, inkludert en negativ kontroll uten DDP. Deretter ble 20 ul sterilt MTT-fargestoff (3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-di-phenyltetrazolium-bromid, 5 mg oppløst i 1 ml fosfat-buffret saltvann, Sigma, USA) ble tilsatt til kulturmedium til en sluttkonsentrasjon på 0,5 mg /ml og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Deretter ble formazankrystaller solubilisert med 150 ul dimetylsulfoksid i 10 min. Spektrofotometrisk absorbans ved 490 nm ble målt med en mikroplateleser. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Statistical Analysis
SPSS 17.0 programvarepakken ble brukt for statistisk analyse. Frekvensene ble sammenlignet med Fishers eksakte test, × 2 beredskaps test eller ikke-parametriske tester som passer. Vi estimert overlevelse og tid-til-progresjon kurver ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet dem med en tosidig log-rank test. Flere logistikk regresjoner som brukte en Cox-modellen ble brukt til å bestemme om de molekylære egenskapene til de svulster uavhengig spådd å overleve i vår kohort av avanserte HNSCC pasienter. P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
.
