Abstract
Den menneskelige mitokondrie ATP-avhengige Lon protease funksjoner i reguleringen av stoffskiftet og kvalitetskontroll av proteiner og mitokondrie-DNA (mtDNA ). Imidlertid er rollen til Lon i kreft ikke godt forstått. Derfor ble denne studien gjennomført for å undersøke betydningen av Lon i livmorhalskreftceller fra pasienter og i etablerte cellelinjer. Microarray analyse fra 30 kreft og 10 normale cervical vev ble analysert ved immunhistokjemi for Lon protein nivåer. Uttrykket av Lon ble også undersøkt av immunoblotting 16 friske livmorhalskreft vev og deres respektive ikke-tumor i livmorvevet. I alle tilfeller ble Lon ekspresjon signifikant forhøyet i cervikale karsinomer sammenlignet med normale vev. Augmented Lon uttrykk i microarray ikke varierer mellom alder, tumor node-metastase karakterer, eller lymfeknutemetastase. Knocking ned Lon i HeLa livmorhalskreftceller ved lentivrial transduksjon resulterte i en betydelig reduksjon i både mRNA og proteinnivåer. Slik nedregulering av ekspresjon Lon vesentlig blokkert HeLa-celleformering. I tillegg banket ned Lon resultert i reduserte cellulære bioenergi som bestemmes ved å måle aerob respirasjon og glykolyse hjelp av Seahorse XF24 ekstracellulære flux analysator. Sammen utgjør disse data viser at Lon spiller en mulig rolle i onkogenesen av livmorhalskreft, og kan være et nyttig biomarkør og mål i behandlingen av livmorhalskreft. Lon; immunhistokjemi; livmorhalskreft; celleproliferasjon; cellulære bioenergi.
Citation: Nie X, Li M, Lu B, Zhang Y, Lan L, Chen L, et al. (2013) Down Regulerende overexpressed Menneskelig Lon i Livmorhalskreft undertrykker celleproliferasjon og bioenergi. PLoS ONE 8 (11): e81084. doi: 10,1371 /journal.pone.0081084
Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Senter for Bioteknologi, India
mottatt: 15 juli 2013; Godkjent: 08.10.2013; Publisert: 19.11.2013
Copyright: © 2013 Nie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen arbeidet ble støttet av stiftelsen Natural Science of China (tilskudd nummer 31070710), National Basic Research program of China (tilskudd nummer 2013CB531702), Zhejiang provinsen toppen viktig disiplin for laboratoriemedisin, den andre bølgen av Zhejiang provinsen program for dyrking av høy -nivå innovative helse talenter og nøkkelen vitenskapelig og teknologisk innovasjon team av klinisk laboratorium diagnostikk av Zhejiang-provinsen (604091155). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den tredje vanligste kreftformen hos kvinner over hele verden, med mer enn 500.000 nye tilfeller diagnostisert årlig. Humant papilloma virus (HPV) infeksjon er den hyppigste risikofaktoren i utviklingen av nesten alle tilfeller av livmorhalskreft [1,2]. I tidlige stadier, er livmorhalskreft potensielt kureres gjennom en kombinasjon av kirurgi, strålebehandling eller cellegift. Den 5-års overlevelse overstiger 90%. Rutinemessig bruk av celleprøve og HPV-tester har forbedret resultatet av livmorhalskreft i utviklede land [3]. Dessverre er pasienter i lavere inntektsland ofte diagnostisert på et avansert stadium på grunn av mangel på tilstrekkelig screening, tidlig diagnose og kurativ behandling [4]. Til tross for at de fleste molekylære forskningsinnsatsen har vært basert på koblingen mellom høyrisiko HPV-typer og livmorhalskreft, vil identifisering av nye molekylære markører og mekanismer som bidrar til bedre diagnostikk og kjemoterapeutisk behandling av denne sykdommen være meningsfylt.
Lon er en evolusjonært konservert ATP-avhengig protease stede i bakterier og pattedyr mitokondrier og peroxisomes [5-8]. I den mitokondrielle matriks, Lon ikke bare fungerer i protein kvalitetskontroll ved å fjerne unormale proteiner, men også i protein regulering ved selektivt nedbryter sentrale hastighetsbegrensende proteiner [9-13]. Lon er oppregulert under ulike stressbetingelser for eksempel opphopning av utfoldet proteiner i endoplasmatiske retikulum, hypoksi og andre stressforhold [10,14,15]. Eksperimenter i dyrkede celler og dyremodeller viser at økt uttrykk for Lon er utløst av hypoksi eller ER stress, og kan potensielt påvirke den proteolytiske omsetning og /eller montering respiratoriske kjedekomplekser som cytokrom c oksidase [14]. I Friedreichs ataksi, er en sjelden arvelig nevrodegenerativ sykdom, en progressiv nedgang på mitokondrie Fe-S proteiner ledsaget av en tilhørende økning i Lon protein nivåer og Lon-mediert proteolyse [15]. I tillegg er Lon en mtDNA-bindende protein som fortrinnsvis forbinder med kontroll-regionen av genomet hvor replikasjon og transkripsjon initieres [16]. Lon er til stede som en proteinkomponent av mitokondrielle nucleoids, og har vært implisert i opprettholdelse og ekspresjon av mitokondrie DNA (mtDNA) [13,16,17].
Basert på forestillingen om at Lon er oppregulert under stress betingelser for å lindre metabolske og proteotoxic stress i kreftceller, undersøkte vi Lon uttrykk i menneskelig livmorhalskreft vev og normal cervical vev ved hjelp av immunhistokjemi og immunoblotting og funnet en positiv sammenheng mellom Lon overekspresjon og livmorhalskreft. For å møte mekanismen og biologiske funksjoner av Lon i livmorhalskreft tumorigenesis, vi nedregulert Lon protein nivåer ved hjelp av en kort hårnål RNA (shRNA) omformet i HeLa celler, som er en vanlig ansatt livmorhalskreft cellelinje. Vi viste at banket ned Lon i HeLa livmorhalskreftceller redusert celleproliferasjon, mitokondrie respirasjon og aerob glykolyse. Våre funn tyder på at Lon støtter livmorhalskreft tumorigenesis og kan være en roman biomarkør og terapeutisk mål i livmorhalskreft.
Materialer og metoder
2,1 Livmorhalskreft vev microarray analyse for Lon ved immunhistokjemi
livmorhalskreft microarray ble kjøpt fra Biomaks (katalognummer CR602). Dette microarray inneholdt livmorhals normalt vev (n = 10) og kreft vev i ulike stadier (n = 30). Den immunhistokjemi ble utført ved hjelp av følgende protokoll. I korte trekk ble vev mikromatriser inkubert ved 60 ° C i et kammer i 2 timer, deparaffinized med xylen, og rehydrert gjennom en serie av etanol med forskjellige konsentrasjoner. Glassene ble kokt i 10 mM natriumcitrat-buffer-løsning (pH 6,0) i 15 minutter for antigen gjenfinning, og deretter bråkjølt ved neddykking i 3% hydrogenperoksid i destillert vann i 20 minutter. Etter blokkering av ikke-spesifikk binding med 3% saueserum albumin i 20 minutter, ble platene inkubert med kanin anti-Lon antistoff (Beijing Biosyntese Biotechnology, Kina) (1: 100 fortynning i 1% BSA i PBS) over natten ved 4 ° C . Platene ble deretter skylt tre ganger i PBS og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur med biotinylert sau anti-kanin-antistoff i en fortynning på 1: 100 i 1% BSA i PBS. Det sekundære antistoffet ble deretter aspirert og Objektglassene ble vasket tre ganger i PBS, etterfulgt av inkubasjon med pepperrot-peroksidase-konjugert avidin. Glassene ble deretter behandlet med 3’3-diaminobenzidin tetra-hydroklorid (DAB), kontra med haematoxylin, og endelig montert med nøytrale Balata. Negative kontroller uten det primære antistoff inkubasjonen ble også utført.
Deler av vev ble observert under en Olympus mikroskop (Olympus Corporation, Japan) og bildene ble tatt på 200 × forstørrelse med samme lysintensitet og eksponeringstid. Alle bilder ble deretter omdannet til 8-bits grå-skala. Den Lon fargingsintensiteten av vev i livmorhalsen var semi-kvantitativt sammenlignet ved å analysere integrert optisk tetthet (IOD) verdien av hvert bilde, som ble målt ved hjelp av bilde-Pro Plus programvare for bildeanalyse (Media Cybernetics, USA).
2.2 Innsamling av livmorhals vevsprøver
Studiet ble godkjent av etikkomiteen i First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient. Menneskelivmorhalsprøver ble samlet inn i avdelingen for obstetrikk og gynekologi ved kirurgi på pasienter med livmorhalskreft, som gjennomgikk komplett kirurgisk reseksjon for sykdommen på First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University (Wenzhou, Kina) mellom august 2012 og mars 2013. Pasientene ble valgt basert på patologisk diagnose av livmorhalskreft. Det var ingen tegn på noen andre kreftformer og ingen historie med preoperativ kreft behandling. Etter hver kirurgisk fjerning, vevsprøven ble umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil senere analyse.
2.3 Cellekultur
HeLa-cellelinjen ble anskaffet fra Amerika Type Culture Collection (Rockville, MD). Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Sigma) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma) og antibiotika (100 U /ml penicillin og streptomycin) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
2,4 Lon knockdown etter lentiviral shRNA trasduction
HeLa-celler ble sådd ut 16 timer før transfeksjon i en 6-brønns plate ved en densitet på 2 x 10
5-celler /brønn. Celler ble infisert med LONP1-shRNA lentivirale partikler (MOI 5) (Santa Cruz, SC-97290-V) eller kontroll shRNA (Santa Cruz, SC-108 080) i kulturmedium innehold polybren ved en sluttkonsentrasjon på 5 ug /ml. Mediet ble deretter suget av og erstattet med friskt medium etter en inkubasjon over natten. Syttito timer senere ble cellene deretter sådd ut på 60 mm plater med medium som inneholdt puromycin ved den endelige konsentrasjon på 3 ug /ml. Friskt medium med puromycin ble erstattet daglig for seleksjon av transduserte celler. Flere enkelt-cellekloner ble selektivt overført ved hjelp av sterile klonings plater til brønner i en 24-brønners plate og utvidet. De LONP1-shRNA-kloner som viser den mest effektive knockdown sammenlignet med kontroll shRNA kloner ble identifisert ved immunoblotanalyse og anvendt for ytterligere analyse
2,5 Kvantitativ sanntids-PCR (RT-PCR)
Total RNA ble hentet ved hjelp av en RNeasy Mini Kit (Qiagen) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop-leser og to mikrogram av RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp av høykapasitets cDNA revers transkripsjon kit (Applied Biosystems) med tilfeldige primere. CDNA ble fortynnet og 200 ng cDNA ble anvendt som et templat pr reaksjon. The Real Time PCR (RT-PCR) analyser ble utført med TaqMan Gene Expression Analyser (Hs00998404_m1 LONP1, Hs02800695_m1 HPRT1, Applied Biosystems) ved hjelp av følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 40 sykluser av denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og glødning og forlengelse ved 60 ° C i 1 min. Den relative
LONP1
mRNA uttrykk nivåer ble normalisert mot husholdningsgenet hypoxantin phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) ved hjelp av komparative ΔΔCt metoden. ΔΔCT ble beregnet med ligningen [CT1 (LONP1) -Ct1 (HPRT1)] – [CT2 (LONP1) -Ct2 (HPRT1)] henholdsvis CT1 og CT2 er Ct-verdiene i LONP1-shRNA gruppe og kontroll shRNA gruppe, og relativ gangers skifte av genet ble beregnet ved hjelp av ligning 2
-ΔΔCt.
2,6 Immunoblot påvisning av Lon protein
frosne vevsprøver og celler ble lysert i nærvær av en protease-inhibitor cocktail og sentrifugert ved 12.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fraksjon ble samlet og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av bicinchoninic syre (BCA) -metoden. Like mengder av proteinekstrakt (20 pg per brønn) ble separert ved SDS-poly- akrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE). Separerte proteiner ble overført til et 0,2 mikrometer nitrocellulosemembran og blokkert i 3% fettfri melk i PBS. Blottet ble inkubert med kanin-anti-humant Lon (1: 300) ved 4 ° C over natten etterfulgt av pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-kanin sekundært antistoff (1: 5000, Santa Cruz). Antistoff mot β-aktin ble benyttet som lasting kontroll til eksperimentet. Membranen ble deretter inkubert med kjemiluminescerende substrat (Denville) i 5 minutter og utsatt for røntgenfilm og utviklet i et mørkt rom. Signalene ble påvist og kvantifisert ved densitometri ved hjelp av Image-J programvare (National Institutes of Health, USA).
2,7 celleproliferasjonsanalyse
Kontroll-Lon knockdown celler ble sådd inn i en 6-brønns vevskulturplate ved en tetthet på 5 x 10
4 celler per brønn og inkubert over natten. Etter trypsinering ble cellene resuspendert i et likt volum av kulturmedium og trypan blått (0,05% oppløsning). Antallet levende celler i triplikate brønner som utelukket trypanblått ble tellet i 6 dager for å oppnå cellevekstkurve.
2,8 Seahorse XF-24 metabolsk flux analyse
Oksygenforbruk rate (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR) ble målt ved hjelp av en Seahorse XF24 ekstracellulære flux analysator (Seahorse Bioscience). Tjuefire timer før forsøket, stabile LONP1-shRNA HeLa-celler (Lon gruppe) og kontroll-shRNA HeLa celler (CTR gruppe) ble dyrket på Seahorse XF-24 plater med en tetthet på 5 × 10
4 celler per brønn. På dagen for metabolsk fluks analyse, ble kulturmediet erstattet med 675 ul av ubufret DMEM (DMEM supplert med 25 mM glukose, 1 mM natriumpyruvat, 31 mM NaCl, 2 mM Glutamax, fenolrødt, pH 7,4) og inkubert ved 37 ° C i en ikke-CO
2 inkubator i 1 time. Alle injeksjons reagenser ble justert til pH 7,4. Baseline Hastighetene ble målt ved 37 ° C fire ganger før injisering i rekkefølge følgende mitokondrie-inhibitorer oligomycin (10 uM), carbonycyanide p- (trifluormetoksy) phenylhydrazone (FCCP, 1,50 uM), og rotenon (10 uM). Etter tilsetningen av hver inhibitor, ble fire avlesninger også tatt. OCR og ECAR ble automatisk beregnet av Seahorse XF-24-programvaren. Hvert punkt representerer et gjennomsnitt av 7 forskjellige brønner.
2.9 Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS.11 programvare. ble utført enveis ANOVA analyse for immunhistokjemiske resultatene og for sammenligning av Lon og CTR-grupper i
in vitro
eksperimenter. Feilfelt for de forsøkene representerer standardavviket av den midlere verdi (middelverdi ± S.D.) fra tre separate eksperimenter dersom ikke annet er angitt.
P
verdier av ≤ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
3,1 LONP1 er over uttrykt i livmorhalskreft vev
Vi er fast bestemt på Lon protein nivåer i 30 livmorhalskreft og 10 ikke-neoplastiske livmorhalsprøver av high-throughput immunhistokjemiske analyser. Representative deler av Lon ekspresjon i alle vev er vist i figur 1. Imidlertid ble Lon uttrykt ved vesentlig høyere nivåer i kreftprøvene ved kontrast til den svake, men detekterbar ekspresjon i normalt vev med en statistisk signifikans (
P
0,01) (tabell 1). Den utvidet uttrykk for Lon ble observert ved forskjellige grader av livmorhalskreft uten åpenbar forskjell i godt, moderat, og dårlig differensierte vev (figur 1 B-D). Tilsvarende, i friskt vev livmorhalskreft, ble Lon funnet å være mer sterkt uttrykt enn i tilsvarende ikke-tumorvev, som vist ved immunoblotting (Fig 2 A og B). Vi undersøkte også om Lon overekspresjon var assosiert med risikofaktorer som alder og med clinicopathological egenskaper inkludert tumorstørrelse, tumor stadium, lokal invasjon, og lymfeknutemetastase. Lon uttrykk ikke signifikant korrelert med alder, tumor klasse, TNM (tumor-node-metastase) karakterer, eller lymfeknutemetastase som oppsummert i tabell 2. Til sammen er Lon oppregulert i livmorhalskreft.
(A) normal menneskelig cervical vev. (B) Livmorhalskreft klasse 1. (C) Livmorhalskreft klasse 2. (D) Livmorhalskreft klasse 3. Bar skala: 50 pm.
Kategori
Cases
Lon flekker IOD (× 10
4)
en
P
-verdi
*
Normal cervix104.47 ± 2.070.004Cervical cancer307.19 ± 2.52Table 1. Lon uttrykk i normale cervical vev og livmorhalskreft vev.
a Lon flekker integrert optisk tetthet (IOD) ble målt ved Image Pro Plus analyse programvare. Data ble semi-kvantitativt analysert og uttrykt som middelverdi ± S.D. *
P
≤ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. CSV Last ned CSV
(A) Representant immunoblot av Lon protein uttrykk påvist i flere menneskelige livmorhalskreft (partallslinjene) og tilsvarende ikke-tumor (ulike linjer) cervical vev ved western blot analyse. (B) Livmorhalskreft uttrykker betydelig høyere nivå av Lon ved å sammenligne med ikke-tumor i livmorvevet,
P
0,05. Data representerer middelverdi ± S.D. fra 16 grupper av livmorhals vev (Normal Cancer).
Kategori
Under
Cases
Lon flekker IOD (× 104)
en
Total
P-verdi
*
Alder (år) 50196,72 ± 2.47300.186≥50118.00 ± 2.52Tumor GradeGrade 1107,00 ± 3.16300.522Grade 2107,93 ± 2.55Grade 3106,65 ± 1.74Invasion av tumorT1176 0,81 ± 2.82300.347T2137.70 ± 2.06Lymph node metastasisN0287.18 ± 2.59300.900N127.41 ± 1.80Table 2. Forholdet mellom Lon uttrykk og clinicopathological karakteristikker av livmorhalskreft.
a Lon flekker integrert optisk tetthet (IOD) ble målt ved Image Pro Plus-analyse-programvare. Data ble semi-kvantitativt analysert og uttrykt som middelverdi ± S.D. *
P
≤ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. CSV Last ned CSV
3,2 Down regulering av Lon i HeLa livmorhalskreftceller
For å avgjøre betydningen av Lon i overlevelse av livmorhalskreftceller, vi tok fordel av shRNA teknikk. For å evaluere spesifisiteten av shRNA til
LONP1
genet og omfanget av Lon nedregulering anvendt på HeLa-celler, RT-PCR og immunoblot-analyse ble utført. RT-PCR bekreftet at LONP1 shRNA spesielt redusert
LONP1
mRNA nivå med 60% på 10 dager etter transfeksjon (
P
0,001; figur 3 A). Immunoblot-analyse viste en betydelig reduksjon i de ~ 100 kDa Lon proteinnivåer sammenlignet med kontrollgruppen (CTR
, P
0,001; figur 3 B og C). Den mest effektivt downregulated celle klon av LONP1-shRNA ble valgt for videre undersøkelser.
(A) Representant RT-PCR analyse av
LONP1
mRNA nivå i HeLa celler transfektert med kontroll eller LONP1 shRNA. (B) Representant immunoblot viser Lon protein nivåer ekstrakter fra HeLa celler transfektert med kontroll eller LONP1 shRNA. (C) Densitometry ble anvendt for å kvantifisere relative Lon proteinnivåer normalisert til p-aktin vist i (b); ***
P
0,001. (D) Cell vekst av kontroll og LONP1 shRNA transduced HeLa-celler,
P
0,05. Data representerer middelverdi ± S.D. fra tre separate forsøk.
3,3 nedregulering av Lon redusert spredning og kolonidannelse av HeLa livmorhalskreft celler
Forbedret cellevekst er en av de viktigste egenskapene til tumorutvikling. Vi neste undersøkt effekten av å slå ned Lon på HeLa celleproliferasjon
in vitro
. Analysen celleproliferasjon viste at cellevekst i Lon shRNA gruppen var betydelig lavere enn i CTR-gruppen (
P
0,05, figur 3 D). Mikroskopisk analyse viste at ble observert størrelsen av den cellulære kolonien til å være forholdsvis mindre i den Lon gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (data ikke vist).
3,4 nedregulering av ekspresjon Lon minsker energimetabolisme fra HeLa livmorhalskreftceller
Vi fortsatte å bestemme effekten av Lon knockdown på cellulære energetics ved å måle oksygenforbruk (OCR) og ekstracellulære forsuring priser (ECAR), som er indikatorer mitokondriell respirasjon og melkesyre produksjon via aerob glykolyse i cellene hhv. Basal OCR (baseline minus oligomycin), som er et mål for oksidativ fosforylering (OXPHOS), ble funnet å være vesentlig lavere i den Lon gruppen sammenlignet med den til kontrollgruppen (
P
0,001; figur 4 B), noe som reflekterer en lavere avhengighet OXPHOS for energiproduksjon i Lon-shRNA celler. En betydelig blokk i glykolysen ble også observert i Lon gruppen som vist ved en signifikant reduksjon i ECAR i forhold til CTR gruppen (figur 4 D, grunnlinje). Tilsetningen av oligomycin, som hemmer F
0 ATP syntase kompleks og elektronstrøm, dramatisk redusert OCR i begge grupper i en lignende grad (figur 4 A, oligomycin). En økning i ECAR svar på oligomycin ble funnet å korrelere med nedgang i OCR (
P
0,05; Figur 4 D, oligomycin), noe som indikerer økt laktatproduksjon via glykolyse. FCCP injeksjon frakoplet mitokondriell respirasjon fra ATP syntese og dramatisk økt OCR i begge cellelinjer, noe som gir et anslag av reserveluftkapasiteten til mitokondrier (figur 4 A, FCCP). Til slutt tilsetning av den komplekse I-inhibitor rotenon resulterte i en tilsvarende drastisk reduksjon i OCR i begge cellelinjer, og den gjenværende OCR ble ansett som ikke-mitokondrie cellulær oksygenforbruk (figur 4 A, rotenon). Lon shRNA knockdown resulterte i en markert reduksjon av den totale mitokondriell luft kapasitet sammenlignet med kontrollceller (
P
0,001; figur 4 C). Samlet utgjør disse resultatene viser at nedregulering av Lon uttrykk i HeLa-celler hemmer cellulær energi metabolisme.
(A-C) Seahorse Bioscience XF24 ekstracellulære flux analysator ble brukt til å måle OCR (pmol /min), en indikasjon på OXPHOS i HeLa celler transfektert med kontroll eller LONP1 shRNA. (A) Etter å etablere en baseline, oligomycin (10 mm), FCCP (1,50 mm), og rotenon (10 mm) ble sekvensielt tilsatt. (B) Den basale OCR ble beregnet ved hjelp av forskjellen mellom gjennomsnittet av tidspunkter i baseline (tallene 1 til 4) og i oligomycin behandling (tall 5 til 8) (baseline minus oligomycin OCR). (C) Maximal mitokondrielle luftkapasitet arealet under kurven (AUC) for to grupper ble funnet ved hjelp av forskjellen mellom AUC OCR (pmol) summer av tidspunkter i FCCP behandling (tall 9 til 12) og i rotenonbehandling (tall 13 til 16) (FCCP minus rotenon AUC OCR). (D) profilering av ECAR (mph /min) i kontroll- og Lon knockdown-celler ble målt i de samme eksperimentene som beskrevet i (A). ***
P
0,001. Data representerer middelverdi ± S.D. fra tre separate forsøk.
Diskusjoner
HPV-infeksjon er den primære årsaken til livmorhalskreft. Den mest brukte biomarkør ved behandling av livmorhals pre-cancer er den screening for HPV DNA [18]. Høy risiko HPV-typespesifikke teinene E6 og E7 ble antatt å være de viktigste faktorene i celle transformasjon og kreftutvikling [19,20]. Andre funksjonelle biomarkører undersøkt i livmorhalskreft inkluderer markører for plateepitel differensiering cytokeratin (CK), cellesyklus markører som p21, p27, MCM5, cyclin A, cyclin E og cyclin D, og andre molekyler som telomerase, involucrin, og Survivin. Samarzija nylig funnet ut at Hedgehog (Hh) signalveien er aktivert i livmorhalskreft-deriverte celler ved hjelp Shh ligand og Hh pathway hemmere, indikerer hemming av denne veien kan være et terapeutisk alternativ for å bekjempe livmorhalskreft [21].
Tidligere studier har vist at endringer i mitokondrie Lon protein ekspresjon er assosiert med en rekke humane sykdommer, inkludert familiær amytrophic lateral sklerose [22],-kreft [23-25], samt aldring [26], og Friedreichs ataksi [15]. Disse funnene antyder en viktig rolle for den mitokondrielle Lon protease i fysiologiske cellulære funksjoner. Men spørsmål om uttrykket mønster og rolle Lon i kreft celle overlevelse er fortsatt ikke godt forstått. I denne studien belyse vi den betydelige rolle Lon i human cervical cancer. Det er påfallende å finne at Lon protein er oppregulert i alle stadier av livmorhalskreft fra mikromatriser og pasientprøver i forhold til å kontrollere seg.
Lon er en stress protein som ligner på varmesjokk faktorer som er oppregulert under stress forhold [27]. Generelt kreftceller er under metabolske og proteotoxic stress der det er behov for kompenserende mekanisme for å lindre disse spenninger for å beholde den tumorigenisitet og celleviabilitet. Mitokondrier spille en viktig rolle under kreft spredning ved å levere energi, og gå utenom apoptose. Lon er en av de store mitokondrie proteaser som gjenkjenner og degraderer utbrettet, misfolded og unormale proteiner i mitokondriene. Overekspresjon av mitokondrie Lon presenteres her sterkt bekreftet at det er en av de viktigste aktørene i livmorhalskreftutvikling. Som en konsekvens av begrensede tilgjengeligheten av friske livmorhalskreft vev brukt i denne studien, hadde ingen mulighet for å bestemme korrelasjonen av proteinnivåer Lon med oppsetningen av livmorhalskreft. Fremtidig arbeid basert på forstørrede prøvene vil avgjøre om Lon transkripsjonsnivåer samt protein er assosiert med clinicopathological funksjoner i livmorhalskreft.
Mitokondrie Lon protease er preget av sine mange funksjoner som mtDNA bindende protein, en anstand-lignende protein under montering av mitokondrielle indre membrankomplekser og selektiv nedbrytning av unormale proteiner [14,28]. Studier i gjær viste at tappe Lon vise luftmangel på grunn av opphopning av mitokondrie proteiner og er ikke i stand til å vokse på ikke-fermenterbare kilder [6,29]. I begge gjær og pattedyrceller, knockdown av Lon fører til opphopning av elektron-tette inneslutninger som er antatt å være unormale proteiner i mitokondriene [6,25,30]. Knocking ned Lon ved hjelp av små interfererende RNA (siRNAs) forårsaket redusert tumorcellevekst og forbedrer celle følsomhet for cisplatin og ultrafiolett lys i brystkreft avledet cellelinje MCF-7 [31]. Tilsvarende nedregulere Lon protease i WI-38 VA-13 human lunge fibroblaster av antisense morpholinos svekket mitokondrie struktur og funksjon, og resulterte i apoptose [32]. I tillegg har man nylig studie rapporterte at Obtusilactone A og (-) – Sesamin indusert apoptose i humane lungekreftceller ved å aktivere DNA skadekontrollpunkter og inhibering av mitokondrial Lon protease [24]. Nyere arbeid viser at lentiviral mediert banke ned fra Lon fører til B-lymfoid celledød [25]. Disse funnene sammen foreslår involvering av Lon i onkogenese.
Det er velkjent at reaktive oksygenarter (ROS) som genereres hovedsakelig i pattedyr mitokondrielle elektrontransportkjeden under OXPHOS bidra til tumorgenese gjennom å kontrollere cellulær proliferasjon, transformasjon fenotyper, og overlevelse [33]. Interessant, overekspresjon av Lon i flere kreftcellelinjer med unntak av HeLa-celler ble nylig vist seg å indusere produksjonen av ROS og ytterligere aktiverer mitogenaktivert proteinkinase (MAPK) og Ras-ekstracellulære signalregulerte kinase (Ras-ERK) signalering, som er involvert i å gi overlevelses fordeler til kreftcellene, stressrespons, og tilpasning til svulsten mikromiljøet [34]. For å undersøke hvilken rolle Lon i livmorhalskreft, ble HeLa celler transduced med lentivirus bærer en shRNA for den spesifikke knockdown av Lon. Nedregulering av endogen Lon svekket kapasitet spredning av HeLa-celler i kultur, og førte til en nedgang i samlet cellulær energi metabolisme. Vi spekulerer i at dette fenomenet i Lon mangel HeLa celler resultater fra relativ mangel av Lon funksjon. Redusert anstand aktivitet av Lon svekker montering og /eller funksjon av luftveis komplekser og dermed kunne hemme mitokondrielle ROS produksjon, noe som er avgjørende for overlevelse og spredning av kreftceller. Veksthemming i HeLa-celler, og dens nedre nivå av basal OCR og OCRs etter tilsetning av respiratoriske komplekser «hemmere etter Lon stanse er i god overensstemmelse med denne forklaringen [35]. I tillegg kan veksthemming kan delvis tilskrives tapet av proteinkvalitet kontroll, noe som resulterer i skadelig akkumulering av misfolded, usammensatte og /eller oksydativt skadede proteiner [36]. Mekanismen for denne delen bør utredes videre analyse.
Konklusjon
oppregulering av Lon protease i livmorhalskreft er en av de tilpasningsmekanismer for celle levedyktighet. Nedregulere eller inhibere Lon i cervikale kreftceller stanset cancer celleproliferasjon ved å endre bioenergetisk forbrenningen og følgelig rettet mot Lon kan være en av de mulige metoder i kreftbehandling. Videre studier er nødvendig for å belyse de signalveier der Lon fremmer tumorgenisiteten i livmorhalskreft. Til sammen kan Lon være en nyttig biomarkør i livmorhalskreft og et potensielt mål i utvikling av nye legemidler for anti-kreft terapi.
Takk
Vi takker Dr. C.K. Suzuki, Dr. V. Sundararajan og Jae Lee for nyttige diskusjoner og gjennomgang av dette manuskriptet.
