Abstract
Prostatakreft er den vanligste ikke-dermatologiske kreftformen hos menn i den vestlige verden. Nylig, en hyppig kromosomaberrasjon fusing androgen regulert
TMPRSS2
promotoren og
ERG
genet (
TMPRSS2 /ERG
) ble oppdaget i prostatakreft. Flere studier viste samarbeid mellom
TMPRSS2 /ERG Hotell og andre defekte trasé i kreft progresjon. Men avsløringen av mer spesifikke veier der
TMPRSS2 /ERG
deltar, krever videre undersøkelser. Bruke udødelig prostata epitelceller vi var i stand til å vise at
TMPRSS2 /ERG
over-uttrykke celler gjennomgår en epitelial til Mesenchymale Transition (EMT), manifestert ved oppkjøp av mesenchymale morfologi og markører samt migrasjon og invasjon evner. Disse funnene ble bekreftet
in vivo
, hvor kontrollcellene ga opphav til diskrete knuter mens
TMPRSS2 /ERG
-expressing celler dannet ondartede svulster, som uttrykte EMT markører. For ytterligere å undersøke den generelle transkripsjon ordningen indusert av
TMPRSS2 /ERG
, cellene ble utsatt for en microarray analyse som viste en tydelig EMT uttrykk program, inkludert oppregulering av EMT tilretteleggere,
ZEB1
og
ZEB2, etter og nedregulering av epitel markør
CDH1 product: (E-cadherin). En kromatin immunoprecipitation analysen avslørte direkte binding av
TMPRSS2 /ERG anbefale til arrangøren av
ZEB1
men ikke
ZEB2
. Men
TMPRSS2 /ERG
var i stand til å binde arrangører av
ZEB2
modulatorer,
IL1R2 Hotell og
SPINT1
. Dette settet med eksperimenter lyser den mekanismen som
TMPRSS2 /ERG
fusjon påvirker prostata kreft progresjon og kan bistå i målretting
TMPRSS2 /ERG
og nedstrøms mål i fremtidige narkotika design innsats.
Citation: Leshem O, Madar S, Kogan-Sakin jeg, Kamer jeg, Goldstein jeg, Brosh R, et al. (2011)
TMPRSS2 /ERG
Fremmer Epitelial til Mesenchymale Transition gjennom
ZEB1 Twitter /
ZEB2
Axis i en Prostate Cancer Model. PLoS ONE 6 (7): e21650. doi: 10,1371 /journal.pone.0021650
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 26 januar 2011; Godkjent: 04.06.2011; Publisert: 01.07.2011
Copyright: © 2011 Leshem et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en Center of Excellence stipend fra Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI), EC FP6 Grant LSHC-CT-2004-503576, Yad Abraham Senter for kreftdiagnose og terapi og Ridgefield Foundation, «Talpiot» program for medisinsk ledelse ved Sheba Medical Center, og den israelske Cancer Association. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de hyppigste kreftformer hos menn. I nærheten av 30.000 pasienter forventes å dø av sykdommen i USA hvert år. En store fremskritt innen dette forskningsområde er en ny oppdagelse som ofte over-ekspresjon av E Twenty Six (ETS) -relaterte proto-onkogener kan drives av androgen reseptor som en konsekvens av felles genomiske rearrangementer. Den dominerende form av de nevnte fusjoner med en frekvens på -85% [1], er fusjon mellom exon 1 fra TMPRSS2 og eksoner 4-9 fra
ERG
genet, som oppstår enten ved en sletting av tre megabaser region separering av disse genene [2], eller via en interchromosomal trans [3], [4]. Ettersom dette fusjon er allerede tydelig i prostata intraepitelial neoplasi (PIN) [5], undersøker dette fusjon kan holde nøkkelen til å forstå mekanismene som er involvert i tidlige faser av prostatakreft.
Siden den ble oppdaget [6], den
TMPRSS2 /ERG
fusjon har blitt grundig studert i flere aspekter, herunder tidlig diagnose, prognose, bidrag til kreft progresjon, og selv som et mål for kreftbehandling [7]. Ifølge langsiktige kliniske studier utført på en stor kohort av pasienter, virker det som
TMPRSS2 /ERG
uttrykk er assosiert med en mer aggressiv form for prostatakreft [8], [9]. Videre studier har vist en rolle for
TMPRSS2 /ERG
fusjon i tumorigenesis i form av spredning, invasjon og kreft initiering og progresjon [10], [11], [12], [13]. Generelt ser det ut til at celleproliferasjon ikke nødvendigvis markedsført via
TMPRSS2 /ERG
uttrykk. Som for tumorigenesis, er dataene mangelfulle. Mens banke ned endogen
TMPRSS2 /ERG
i Vcap prostata-avledet kreftceller resulterte i en reduksjon av både tumoropptak og volum [13], [14], transgene mus husing
TMPRSS2 /ERG
i sitt genom enten utviklet PIN [10], [15] eller indikerer ingen histologiske tegn på PIN eller invasiv kreft [11], [16]; avhengig av hvilken modell som brukes i studien og tolkning av data. Til tross for uenighet om hvilken rolle
TMPRSS2 /ERG
i kreft initiering, celle invasjonen ble foreslått til å være en konsekvens av
TMPRSS2 /ERG
fusjon både
in vitro Hotell og
in vivo product: [10], [13], [15]. Interessant, en
i silico
studie viste at
TMPRSS2 /ERG
co-uttrykkes med histondeacetylase 1 (HDAC1) er kombinert med nedregulering av sin kjente mål [17]. Dette funnet innebærer at
TMPRSS2 /ERG
er assosiert med epigenetisk omprogrammering. Følgelig, i en oppfølgingsstudie utført av samme gruppe, HDACi, og HDAC spesifikke hemmere, kompromittert TMPRSS2
/ERG
uttrykk eller aktivitet i ERG positive celler,
in vitro product: [17] , [18]. I tillegg de siste resultatene viste et samarbeid mellom TMPRSS2 /ERG fusjon og deregulert aktivitet av kreftrelaterte veier, for eksempel PTEN [19], PI3-kinase [16], og AKT eller AR [20]. Flere nylig, ble TMPRSS2 /ERG vist seg å megle Epitelial til Mesenchymale Transition (EMT) gjennom induksjon av Wnt signale komponenter [21]. Til sammen kan det bli antatt at andre
TMPRSS2 /ERG
medierte trasé, kan konvergerte på samme endepunkt, nemlig EMT og invasjon; og derfor oppdage nye stier der
TMPRSS2 /ERG
utøve denne effekten er av stor betydning. Hovedmotivasjonen med denne studien er derfor å avdekke slike
TMPRSS2 /ERG
relatert trasé i forbindelse med prostatakreft. I et tidligere arbeid etablerte vi foreviget og tumorigene menneskelige prostata epitelceller (PrECs) linjer definert genetisk konstitusjon [22]. Tilsvarende, i presenterte studien, vi genererte genmodifiserte PrECs å tjene som en bakgrunn på hvilke effekter av
TMPRSS2 /ERG
fusjon kunne være genuint undersøkt. Vi fant ut at TMPRSS2 /ERG utfører en distinkt EMT uttrykk program som hovedsakelig er styrt av en direkte aktivering av
ZEB1 Hotell og indirekte induksjon av
ZEB2
gjennom
SPINT1 Hotell og
IL1R2
modulasjon, som fører til en EMT fenotype
in vitro Hotell og
in vivo
.
Resultater
Etablering av udødelig PrECs kulturer
for å undersøke effekten av
TMPRSS2 /ERG
i en genmodifisert miljøet vi søkt å etablere en udødelig PrECs kultur. Normale prostata epitelceller ble produsert fra et humant prostatektomi prøven og ble deretter dyrket i kultur. Å indusere immortalization ble cellene introdusert med telomerase katalytisk subenhet hTERT, og både p53 og PRB trasé ble opprørt av p53 knockdown og over-uttrykk for cyklinD /CDK4 chimera, henholdsvis, gir opphav til en udødelig cellelinje betegnet som EP (Figur 1A og B). Deretter ble udødeliggjort celler infisert med retrovirus koding enten
TMPRSS2 /ERG
eller tom-vektor kontroll (figur 1C). ERG proteinnivået var sammenlignbart med sin tidligere rapportert ekspresjonsnivå i cellelinjer og kreftprøvene [23], [24]. Spesielt,
TMPRSS2 /ERG
alene eller i kombinasjon med hTERT og /eller p53 knockdown var ikke tilstrekkelig til å indusere immortalisering (data ikke vist). Til slutt, etter en tidligere rapport at kombinasjonen av androgen reseptor (AR) og høye nivåer av ERG fremmer utviklingen av en mer dårlig differensiert, invasiv adenokarsinom enn både genet alene [20]; AR ble innført i
TMPRSS2 /ERG
-expressing celler samt i deres tom-vektor kontroller (figur 1C).
For å indusere immortalization, celler ble introdusert med telomerase katalytiske subenheten hTERT , og både p53 og PRB trasé ble opprørt ved hjelp av p53 knockdown og over-uttrykk for cyklinD /CDK4, henholdsvis. (B) Primær PrECs, samt hTERT /shp53 /cyklinD-CDK4 – overekspresjon celler (EP celler), ble sekvensielt passaged og telles. Populasjonsdoblinger (PDLer) ble beregnet ved hjelp av formelen: PDLer = log (celle utgang /cellinput) /log2. (C) EP-celler ble innført med AR og enten
TMPRSS2 /ERG plakater (EP-AR TMPRSS2 /ERG) eller en tom vektor (EP-AR). AR og ERG proteinnivåene ble målt ved Western blot. Actin ble brukt som en lasting kontroll.
En rolle for
TMPRSS2 /ERG
i epitelial til mesenchymale overgang
in vitro
Sammenligning av morfologi av EP-AR og EP-AR
TMPRSS2 /ERG
celle linjer under et lysmikroskop, observerte vi at EP-AR
TMPRSS2 /ERG
celler kjøpt fibrinoblast-lignende egenskaper, som de demonstrerte en mer langstrakt morfologi og en spredt tetthet i forhold til sine isogene kontroller, noe som viste større grad av vedhengskraften mellom naboceller (figur 2A). De observerte endringer, som er karakteristiske trekk ved EMT [25], [26], kombinert med tidligere rapporter knytte
TMPRSS2 /ERG
med EMT og invasjonen [10], [21], bedt oss om å undersøke om i tillegg til de morfologiske endringer, celler ble også gitt med motilitet og invasjons kapasiteter. For dette formål ble cellene sådd i transwells med serumfritt medium og deres vandring mot serum-supplert medium ble bedømt. Som vist i figur 2B,
TMPRSS2 /ERG
-expressing celler utstilt en forbedret trekkevne. Det samme eksperiment ble gjentatt ved bruk av Matrigel-belagte brønner for å undersøke cellenes evne til å trenge inn i og invadere en tett overflate. Igjen, invasjon evne var betydelig mer merkbar i
TMPRSS2 /ERG
uttrykker celler (Figur 2C). Tapet av
CDH1 plakater (E-cadherin) regnes for å være de mest grunnleggende arrangement i løpet av EMT [27]. Vi målte derfor nivåene av
CDH1
mRNA og protein ved hjelp av henholdsvis QRT-PCR og immunfluorescens farging,. Faktisk, EP-AR
TMPRSS2 /ERG
celler viste en markert reduksjon i nivåene av
CDH1
mRNA (figur 2D) og protein (figur 2E). I tillegg
VIM plakater (vimentin), en kjent mesenchymale markør ble funnet å være forhøyet i
TMPRSS2 /ERG
-expressing celler (figur 2E). I sum, våre data tyder på at
TMPRSS2 /ERG
overekspresjon provoserer en epitelial til mesenchymale overgang
in vitro
.
(A) For morfologisk sammenligning celler ble fotografert ved hjelp av en lysmikroskop. (B) Celler ble sådd i transwells og deres vandrende kapasitet mot FCS ble målt ved å telle de migrerende celler. (C) Det samme oppsett som i (B) ble brukt med Matrigel-belagte transwells for å sammenligne celle invasivitet. (D) Celler ble analysert for CDH1 (E-Cadhein) uttrykk ved hjelp QRT-PCR. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av en tre eksemplarer fra et representativt eksperiment. * Angir en signifikant differensial ekspresjon av genet sammenlignet med kontrollen. (E) Cellene ble sådd ut på lysbilder og farget for CDH1 og vimentin. DAPI ble brukt for å visualisere kjerner. (F) Celler ble implantert i murine prostatakjertler. Kjertlene ble fjernet 68 dager etter implantering, seksjonert og enten farget med hematoksylin og eosin (H E) eller med antistoffer mot humant AR, CDH1 og vimentin. (X400 Forstørrelser). Legg merke til at EP-AR (kontroll) celler som dannes adskilte prostata noduler (blå piler), som er positivt farget med det humane spesifikt anti-AR-antistoff (α-Har). I kontrast, EP-AR TMPRSS2 /ERG-deriverte svulster, som er positivt farget med α-Har antistoff, oppslukt a-har-negative murine knuter (svart pilspisser).
Effekten av
TMPRSS2 /ERG
på tumorigenesis
i et forsøk på å utvide det forrige observasjon til en
in vivo
modell; vi enten injisert de genetisk-modifiserte cellelinjer eller subkutant implantert dem orthotopically inn i prostata av nakne mus. Seksti åtte dager etter implantasjon, ble svulster fjernet, seksjonert og farget for EMT markører. Sammenligning av ortotopiske implantasjoner av distinkte cellelinjer viste at hTERT /shp53 /CDK4-udødelig PrECs (EP-celler) ikke danner tumorer (Data ikke vist), mens EP-AR dannes adskilte knuter og der i murine prostata (figur 2F, indikert med blå piler). Spesielt, EP-AR
TMPRSS2 /ERG
celler dannes store ondartede svulster, som omringet de vanlige muse prostata knuter (figur 2F, svarte pilspisser). Videre EP-AR-avledet knuter demonstrert positiv farging for epitel markør CDH1, og klarte ikke å farge for mesenchymale markør VIM (figur 2F, blå piler). Et speilbilde var tydelig i EP-AR
TMPRSS2 /ERG
avledede svulster, som uttrykte høye nivåer av VIM og var negative for CDH1, ytterligere bekreftende
in vitro
observasjon at
TMPRSS2 /ERG
induserer EMT. Farging for MKI67 (Ki-67), en kjent spredning markør, avslørte et omfattende uttrykk i EP-AR
TMPRSS2 /ERG
tumorer (37% ± 2 positive celler) sammenlignet med EP-AR-avledede knuter (8% ± 2). Dette indikerer at EP-AR-avledet knuter er mindre proliferativ og kan redegjøre for sin latent natur.
Resultatene er beskrevet så langt tyder på at
TMPRSS2 /ERG
forenkler EMT og følgelig dannelsen av mer aggressive og proliferativ svulster. Flere studier har vist at sammenlignet med PIN-lesjoner,
TMPRSS2 /ERG
omorganisering frekvens i lokaliserte invasive prostatakreft, er doblet [5], [28], [29], [30]. Denne observasjonen innebærer at
TMPRSS2 /ERG
krever ytterligere modifikasjoner for å bli positivt valgt som sykdommen utvikler seg. For å teste denne hypotesen, benyttet vi en tidligere generert, Ras-transform PrECs kultur [22]. Disse cellene havn ectopically-uttrykt hTERT, de virale onkogener SV40 små og store T antigener, onkogene H-RasV12 og androgen Receptor. En tom vektor eller et
TMPRSS2 /ERG
kodende vektorer ble introdusert i disse cellene, for å generere to forskjellige cellelinjer, LHSR og LHSR
TMPRSS2 /ERG
henholdsvis (figur 3A). Etter avtale med de resultatene som er oppnådd med EP-AR-celler, CDH1 ble nedregulert i LHSR celler uttrykker
TMPRSS2 /ERG plakater (Figur 3B). Deretter ble cellene orthotopically injisert inn i nakne mus-prostata, samt subkutant. Som forventet, følgende: kun 28 dager, begge cellelinjer ga opphav til svulster med ingen signifikante forskjeller i størrelse (Tumor forekomst er presentert i tabell S1). Følgelig MKI67 farging viste ingen forskjeller mellom de cellelinjer i forhold til formeringshastigheten (Data ikke vist). Interessant,
TMPRSS2 /ERG
-expressing svulster viste en markert oppregulering av VIM og en merkbar nedregulering av CDH1 sammenlignet med kontroll tumorer (figur 3C), ytterligere validering tilrettelegging av EMT av
TMPRSS2 /ERG
i en ekstra, og en mer aggressiv,
in vivo
modell. Siden LHSR cellelinjene er svært aggressive, er de ikke egnet for å studere effekten av
TMPRSS2 /ERG
på metastaser formasjon, som musene måtte ofres i løpet av en kort periode etter injeksjonene. Likevel, i ett tilfelle,
TMPRSS2 /ERG
-expressing tumor spredning inn i murine lunge. Som vist i fig S1, dette metastase stammer fra LHSR
TMPRSS2 /ERG
primær tumor, som det farget positivt med human-spesifikt anti-AR-antistoff. Det er fristende å spekulere i at EMT indusert av
TMPRSS2 /ERG
gitt celler med trekkende og invasive kapasiteter og til slutt gjorde dem i stand til hjem og spre på et fjernt område. Dermed fikk en svært forvandlet genetisk bakgrunn,
TMPRSS2 /ERG
indusert EMT kan legge til rette for invasjon og metastasering.
(A) PrECs ectopically uttrykker hTERT samt SV40 små og store T antigener var introdusert med H-RasV12 og AR. Den resulterende linjen, LHSR (Control), ble introdusert med TMPRSS2 /ERG å danne LHSR TMPRSS2 /ERG linje. Et Western blot viser proteinnivåene til ectopically-uttrykte gener. (B) Celler ble analysert for CDH1 uttrykk ved hjelp QRT-PCR. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av en tre eksemplarer fra et representativt eksperiment. (C) Cellene ble orthotopically implantert i mus prostatakjertler. Kjertlene ble fjernet én måned etter implantasjon, seksjonert og farget med H E eller antistoffer mot AR, CDH1, og vimentin. Svarte pilene betegne muse knuter med en negativ farging for AR. (X400 forstørrelse).
EP-AR og LHSR uttrykke TMPRSS2 /ERG er ikke forurenset med celler av mesenchymale avstamning
For å utelukke at den rapporterte EMT stammer fra en krysskontaminering av mesenchymale cellekulturer utførte vi Short Tandem Repeat (STR) basert fingerprinting. STR loci er gjentatte sekvenselementer, 3 til 7 basepar i lengde, som er rikelig fordelt over hele det humane genom. PCR baserte STR-analyse blir i økende grad brukt som et middel for menneskelig identifikasjon for rettsmedisinske og linkage studier [31], [32], [33], [34]. Vi analyserte både EP og LHSR kulturer basert på allel oppdrag for hver av de STR loci testet. EP-AR og EP-AR TMPRSS2 /ERG ble funnet å være identisk med hensyn til 16 STR loci (tabell 1). LHSR og LHSR TMPRSS2 /ERG ble også funnet å være identiske med hverandre, men ikke til EP-AR eller AR EP-TMPRSS2 /ERG. For å underbygge denne observasjonen vi også utført spektral Karyotying (SKY) analyse, for å oppdage unike vendende kromosom funksjoner, spesielt vises i de to isogene cellekulturer. Som vist i fig S2, EP-AR og EP-AR TMPRSS2 /ERG få ytterligere materiale i kromosom 11, mens den LHSR og LHSR TMPRSS2 /ERG utviser 3 spesifikke translokasjon, igjen noe som indikerer at hver type av kultur, stammer fra den samme opprinnelsen . Disse resultatene tyder på at EMT rapportert her er et genuint indusert av TMPRSS2 /ERG snarere enn av krysskontaminering.
TMPRSS2 /ERG
indusert EMT er mediert av
ZEB1 Twitter /
ZEB2
aksen
Mange veier er kjent for å konvergere i
CDH1
undertrykkelse under epitelial til mesenchymale overgang [27]. Derfor søkte vi å måle uttrykk nivåer av flere transkripsjonsfaktorer som ble rapportert å lette EMT enten direkte eller indirekte undertrykkelse av
CDH1 product: [27]. Uttrykket nivåer av
SNAI1 (Snail), SNAI2 (Slug), FOXC2, GSC (Goosecoid), TWIST1, TCF4 (E2.2), TCF3 (E47) og KLF8
ble målt og funnet å være enten lav eller like uttrykt i både EP-AR og EP-AR
TMPRSS2 /ERG
cellelinjer (figur 4A). Bemerkelsesverdig, uttrykk for
ZEB1 Hotell og
ZEB2
, to kjente direkte repressors av
CDH1 product: [27], var dramatisk oppregulert i
TMPRSS2 /ERG
-expressing celler (figur 4A).
ZEB1
induksjon av
TMPRSS2 /ERG
ble ytterligere validert på proteinnivå ved farging (figur 4B). For å teste om
ZEB1
har en effektiv rolle i å fremme EMT prosessen i vår modell, var dens uttrykk stabilt slått ned ved hjelp av short-hårnål RNA (shRNA) og migrasjon Analysen ble utført. Som vist i figur 4C,
ZEB1
nivåer falt dramatisk etter
ZEB1
knockdown, noe som resulterer i en betydelig svekkelse av den vandrende kapasiteten på
TMPRSS2 /ERG
-expressing celler ( Figur 4C, nedre panel).
(A) EMT-assosiert transkripsjonsfaktorer uttrykk. Celler ble analysert for ekspresjon av de angitte genene ved hjelp QRT-PCR. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av en tre eksemplarer fra et representativt eksperiment. ND = ikke påvist. * Angir en signifikant differensial uttrykk (P-verdi mindre enn 5 × 10
-4). (B) Cellene ble sådd ut på lysbilder og farget med α-
ZEB1
antistoff. Kjerner ble visualisert ved DAPI. (C) Prostata kjertler ble injisert med EP-AR (Control) og EP-AR TMPRSS2 /ERG som beskrevet, fjernet, seksjonert og farget med en α-
ZEB1
antistoff. Den blå pilen betegner en menneskelig knute. Den svarte pilen betegner muse knuter med en negativ farging for AR. (X400 forstørrelse). (D)
ZEB1
ble slått ned og dets mRNA nivåene ble målt (øvre panel). * Angir en signifikant differensial uttrykk (P-verdi = 8 × 10
-4). Celler ble utsatt for migrering analyse som beskrevet (nedre panel). ** Angir en signifikant differensial uttrykk (P-verdi = 4 × 10
-3).
Begge
ZEB1 Hotell og
ZEB2
promoter regioner bestå av antatte
TMPRSS2 /ERG
bindende motiver (Figur S3), noe som tyder på at
TMPRSS2 /ERG
kan direkte binde sine arrangører og øke sine uttrykk. For å teste denne hypotesen, gjennomførte vi en Chromatin Immuno-Nedbør (chip) analyse ved hjelp av en α-ERG antistoff. Interessant, som vist i figur 5A,
TMPRSS2 /ERG
synes å direkte binde
ZEB1
arrangøren, men ikke
ZEB2
. Som en negativ kontroll vi brukte en promoter region fra
CDH1
, som er en del av
ZEB1 Twitter /
ZEB2
akse, men ikke havnen en ERG bindingssete. Dette resultatet betyr at
TMPRSS2 /ERG
kanskje indirekte indusere
ZEB2
via formidling av
ZEB2
up-stream effektorer. For å undersøke dette formodning, og for bedre å forstå mekanismen som
TMPRSS2 /ERG
utfører EMT program for øvrig; Vi foretok et genom-wide tilnærming og gjennomførte et uttrykk microarray-basert sammenligning mellom EP-AR og EP-AR
TMPRSS2 /ERG
celler. Totalt 1215 kommenterte gener ble uttrykt forskjellig mellom de to cellelinjene (813 oppregulert og 402 ned-regulert), som vi hentet de som ble både forbundet med
ZEB1
eller
ZEB2
, og innblandet i EMT i litteraturen (for detaljert filtreringsmetode refererer til legenden om figur 5B). For å verifisere ektheten av dette settet med gener vi også validert sine microarray-avledet differensial uttrykk mønstre ved hjelp QRT-PCR (data ikke vist). Som vist i figur 5B, syv gener matchet filtrering kriterier. To av dem,
IL1R2 Hotell og
SPINT1 plakater (figur 5C, validert av QRT-PCR), ble rapportert å kode oppstrøms effektorer av
ZEB2
uttrykk; det tidligere ble vist å heve
ZEB2
uttrykk nivåer [35], mens sistnevnte demper sitt uttrykk [36], noe som tyder på at de kan være mediatorer av
TMPRSS2 /ERG
avhengig
ZEB2
høyde. Begge
IL1R2 Hotell og
SPINT1
promoter regioner består av antatte
TMPRSS2 /ERG
bindende motiver (Figur S2), og faktisk
TMPRSS2 /ERG
viste en signifikant binding til deres promotere i en chip-analyse (figur 5D). For ytterligere å underbygge SPINT1 og IL1R2 effekt på
ZEB2
uttrykk i systemet vårt, vi banket ned deres uttrykk ved hjelp av små interfererende RNA (siRNA). Som vist på figur 5E,
SPINT1
og
IL1R2
nivåene ble effektivt redusert ved siRNA transfeksjon, noe som resulterer i
ZEB2
høyde og reduksjon, respektivt. I sum,
TMPRSS2 /ERG
synes å direkte binde og trans-aktivere
ZEB1
mens indirekte indusere
ZEB2
via trans-aktivering og trans-undertrykkelse av sine effektorer,
SPINT1 Hotell og
IL1R2
.
(A) Chromatin-IP-analysen ble utført i EP-AR TMPRSS2 /ERG celler ved hjelp av α-ERG antistoff og IgG som en kontroll. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av en tre eksemplarer fra et representativt eksperiment. * Betegner P-verdi 3 × 10
-2. (B) Listen over 1215 differensielt uttrykte gener ble krysses med en liste av gener assosiert med
ZEB1
eller
ZEB2
, som ble hentet fra «Genomatix» programvare [47], noe som resulterer i 37 delte gener. 37-gener listen ble filtrert for gener assosiert med EMT ifølge litteraturen (n = ukjent prøve størrelse), forlater de 7 genene som er oppført i boksen under. (C) Celler ble analysert for
SPINT1 Hotell og
IL1R2
uttrykk ved hjelp QRT-PCR. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD av en tre eksemplarer fra et representativt eksperiment. * Betegner P-verdi mindre enn 5 × 10
-4. (D) Samme oppsett som (A) ble brukt for
IL1R2 Hotell og
SPINT1
arrangører (E) Venstre paneler: EP-AR-celler ble transfektert med siRNA målretting
SPINT1
og mRNA uttrykk av de utpekte gener ble målt ved QRT-PCR. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD fra to eksperimenter som anvender to forskjellige siRNA oligonukleotider. * Betegner P-verdi = 7 × 10
-4, ** betegner P-verdi = 1 × 10
-3. Høyre panel: samme eksperimentelle oppsettet ble brukt med siRNA målretting
IL1R2
i EP-AR TMPRSS2 /ERG. * Betegner P-verdi = 2 × 10
-4, ** betegner P-verdi = 1 × 10
-2.
Diskusjoner
I denne studien vi gi betydelig bevis for å støtte ideen om at
TMPRSS2 /ERG
forutsetter en aktiv rolle i epitelial til mesenchymale overgang via aktivering av ZEB /
CDH1
vei, både
in vitro
og
in vivo
. Disse funnene belyse den mekanismen som
TMPRSS2 /ERG
fusjon utøver sin onkogen effekt.
EMT og invasjons evner ble rapportert å være en konsekvens av
TMPRSS2 /ERG
ekspresjon i flere studier [10], [13], [15], [21]. Derfor ser det ut til at EMT og invasjon er de generelle prosesser som er utført av
TMPRSS2 /ERG
i prostata cancer, og som er oppnådd ved forskjellige mekanismer. Konsekvent, Wnt signalkomponenter som WNT7A, var tydelig i vår modell også. EMT er forårsaket av flere signalveier, alle kanaliseres inn i nedregulering av
CDH1
. Disse banene er styrt av ca 10 store transkripsjonsfaktorer, som undertrykker
CDH1
uttrykk i enten en direkte eller indirekte måte [27]. En slik reaksjonsvei er den SNAI1 /2, som regulerer
ZEB1
/2-ekspresjon og har vært implisert i prostata kreft [37], [38], [39]. Ingen differensial uttrykk for SNAI1 eller SNAI2 var tydelig i vårt system. Men som tidligere rapportert [40],
ZEB
gener kan fremme EMT uavhengig av Snail1 /2 uttrykk, som henspiller til alternative, oppstrøms aktivator av denne veien. I vårt system,
TMPRSS2 /ERG
synes å oppfylle kriteriene som kreves for denne oppstrøms aktivator.
AR spiller en avgjørende rolle i prostata kreft progresjon og er kjent for å regulere
TMPRSS2
arrangøren, som utgjør den regulatoriske delen av
TMPRSS2 /ERG
fusjon. I tillegg ble AR nylig vist å synergize med
TMPRSS2 /ERG
å fremme invasiv adenokarsinom utvikling [20]. Følgelig, et sterkt samarbeid mellom de to var tydelig i vårt system, som hvert gen ikke aktivere og enda litt redusert
ZEB1 /2
uttrykk, mens co-uttrykk ga en markert transcriptional induksjon av disse genene (Data ikke vist). Tilsvarende, mens EP celler klarte ikke å vokse
in vivo
følgende orthotopic implantasjon og EP-AR celler dannet diskrete knuter, EP-AR
TMPRSS2 /ERG
celler ga opphav til store ondartede svulster, understreker synergistiske natur samarbeidet. Nyere studier har knyttet AR til EMT i prostatakreftmodeller gjennom aktivering av Snai aksen [41], [42]. I foreliggende undersøkelse, AR alene var ikke tilstrekkelig til å indusere EMT, kanskje på grunn av sneglen-utarmet bakgrunn. Dermed igjen, kan det bli spekulert i at AR samarbeider med
TMPRSS2 /ERG
å påkalle en alternativ EMT sti i fravær av sneglen. Det faktum at uttrykket av både AR og
TMPRSS2 /ERG
i systemet vårt er styrt av kunstig arrangører, gjøre den uegnet til å studere AR indusert
TMPRSS2 /ERG
uttrykk. Men dette systemet kan representere hormon ildfaste stadium av prostatakreft hvori AR er over-aktivert. Våre data tilsier at samarbeidet mellom AR og
TMPRSS2 /ERG
er ikke utelukkende formidlet gjennom AR-avhengig transkripsjonsregulering av ERG. Alternativt kan andre mekanismer, slik som medierer komponenter eller fysiske interaksjoner, påvirke deres samarbeid i prostata cancer progresjon. Videre studier bør være fokusert på å belyse de eksakte mekanismene som ar kontroller
TMPRSS2 /ERG
uttrykk og funksjon.
Både SPINT1 og Il1R2 var tidligere involvert i kreft. Il1r2 ble rapportert å være signifikant forhøyet i plasma av Hodgkins lymfomer «pasienter sammenlignet med friske kontroller [43]. Videre tvunget uttrykk for
IL1R2
i en uroepithelial cellelinje resulterte i en morfologisk endring, aktin omorganisering og tilegnelsen av en trekkfugl kapasitet og
IL1R2
overekspresjon var assosiert med økt uttrykk av
ZEB2 Hotell og redusert uttrykk for
CDH1 product: [35]. Vårt arbeid ytterligere bekreftet
IL1R2
pro-onkogen aktivitet som er mediert av
TMPRSS2 /ERG
direkte trans-aktivering. Nylig, i en studie som sammenlignet vev og cellelinjer som representerer ulike stadier av prostatakreft, Spint1 ble sterkt uttrykt i normalt vev sammenlignet med benign prostatahyperplasi (BPH) og lav grad av kreft, med en progressiv tap i økende tumor grad prøver [44 ]. Følgelig
SPINT1
demping i prostatakreft cellelinjer, resulterte i en mer aggressiv fenotype som inkluderte økt bevegelighet og invasivitet [45]. Endelig SPINT1 knockdown i bukspyttkjertelkreft cellelinje SUIT-2, indusert EMT og invasjon som ble ledsaget av
ZEB2
høyde og
CDH1
reduksjon [36]. Sammen disse data tyder på at SPINT1 fungerer som en tumor suppressor i prostata kreft. Vi var i stand til å vise at SPINT1 delvis utøver sin effekt ved å redusere nivåene av
ZEB2 Hotell og derfor er det trykt av
TMPRSS2 /ERG
.
Nylig, rapporter som fokuserer på samarbeidet med
TMPRSS2 /ERG
med ulike partnere i kreft prosessen dukker [16], [19], [20]. (https://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/wt_sensetarget_label_manual.pdf).
Mircro-array
