Abstract
Wnt7a er kjent for å være en svulst suppressor som er tapt i NSCLC, men ingen mekanisme for tap er etablert. Metylering av promoter regioner er etablert som en felles mekanisme for tap av tumor suppressor uttrykk i NSCLC. Vi har tidligere vist at tap av Wnt7a i ikke-transformerte lunge epiteliale cellelinjer førte til økt cellevekst, endret 3-D kulturen vekst, og økning migrasjon.
Wnt7a
arrangøren har en høyere prosentandel av metylering i NSCLC svulstvev enn matchet normalt lungevev og metylering av arrangøren regionen fører til redusert aktivitet. Vi behandlet H157 og H1299 NSCLC cellelinjer med 5-Aza-2′-deoxycytidine og oppdaget tap av
Wnt7a
promoter metylering, økt Wnt7a uttrykk, og økt aktivitet av signalveien Wnt7a lunge. Når DNMT1 uttrykk ble slått ned av shRNA, uttrykk for Wnt7a økt og metylering redusert. Sammen tyder disse data på at det i NSCLC, er Wnt7a tapt ved metylering i en undergruppe av tumorer og at denne vedlikeholdes metylering av DNMT1. Restaurering av Wnt7a uttrykk gjennom demetylering kan være en viktig terapeutisk tilnærming i behandling av NSCLC
Citation. Tennis MA, VanScoyk MM, Wilson LA, Kelley N, Winn RA (2012) metylering av
Wnt7a
moduleres av DNMT1 og sigarettrøyk Kondensat i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 7 (3): e32921. doi: 10,1371 /journal.pone.0032921
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 12 august 2011; Godkjent: 06.02.2012; Publisert: 05.03.2012
Copyright: © 2012 Tennis et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av en NIH R21 award (CA153268-01). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft fortsetter å være den ledende årsak til kreft død, med minimale tilgjengelige alternativer for behandling av svulster vanligvis diagnostisert på sene stadier. Vi er interessert i rollen som ikke-kanoniske Wnt signal i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), spesielt de svulst undertrykkende aktiviteter Wnt7a og dens reseptor frizzled 9 (Fzd9). Wnt7a er sterkt uttrykt i embryoniske lunge og tjener til å opprettholde en normal epitel fenotype i voksen lunge [1], [2]. Tidligere studier har vist at Wnt7a ofte tapt i NSCLC og at restaurering av Wnt7a uttrykk fører til redusert forvandlet vekst i NSCLC cellelinjer [2]. NSCLC celler med reexpression av Wnt7a har redusert spredning, redusert forankringsuavhengig vekst, og restaurering av en epitelial fenotype [2]. Wnt7a ligger på kromosom 3p25, som er en «hotspot» for sletting, men mistenkte vi at Wnt7a uttrykk i NSCLC kan reguleres ved en epigenetisk mekanisme [3].
metylering av tumor suppressor genet arrangører i NSCLC har blitt rapportert i over 40 gener, noen med frekvenser så høye som 100% [4]. Tap av ekspresjon av gener som for eksempel p16 /INK4a ved metylering tidlig i utviklingen av NSCLC er blitt foreslått som en biomarkør for tidlig detektering [5]. Metylering av gener som FHIT har vært korrelert med tumor iscenesettelse og prognose i NSCLC [6]. Forskjeller i metylering forbundet med tumorhistologi er identifisert for gener som RASSF1A og p16 /INK4a [7], [8]. Sammenhenger mellom eksponering for sigarettrøyk og avvikende metylering er observert for p16, RASSF1A, og RARβ2 blant annet [9], [10], [11]. En sammenheng mellom eksponering for tobakkskreftfremkallende og metylering kan eksistere gjennom DNA metyltransferaser (DNMT) som aktiveres av disse kreftfremkallende. Dersom målene for DNMTs som er ansvarlige for DNA-reparasjon blir feilaktig inaktivert ved metylering, kan lesjoner som følge av kreftfremkallende vedvarer, som fører til tumorgenese [12].
Som de fleste Wnt og Wnt-relaterte protein studier i kreft er relatert til kanonisk signale , er identifisering av Wnt-spesifikke metylering ikke vanlig. Metylering er kjent for å være en mekanisme for tap for andre svulstdempere i NSCLC, men de fleste studier av Wnt metylering i lungen målet Wnt antagonister i den kanoniske Wnt signalveien. Noen få studier har identifisert hypermethylation av Wnt5a og Wnt9a i epiteliale kreftformer og hypermethylation av Wnt7a er blitt observert i et delsett av ductal kreft i bukspyttkjertelen [13], [14], [15], [16]. I denne studien har vi vist at tap av Wnt7a er en viktig begivenhet for lunge epitelceller og at dette tapet skyldes metylering gjennom DNMT1 aktivitet i en undergruppe av NSCLC.
Resultater
tap av Wnt7a uttrykk i lungeceller fører til en transformert fenotype
Vi har tidligere vist at Wnt7a uttrykk endrer de transformerte karakteristikker av NSCLC celler. NSCLC celler med gjeninnføres Wnt7a har redusert spredning, redusert forankringsuavhengig vekst, og restaurering av en epitelial fenotype. Det motsatte, tap av Wnt7a fra en ikke-transformert epitelcelle, ville være forventet å resultere i en økning i karakteristikkene av transformerte celler. I denne studien brukte vi en shRNA tilnærming til å slå ned mRNA uttrykk for Wnt7a i to ikke-transform lunge epiteliale cellelinjer, HBEC og Beas2B (B2B), og bekreftet slå ned ved QPCR og western blot (Fig. 1a). Redusert Wnt7a uttrykk ført til økt celleformering i celler, B2B demonstrert av en 6-dagers cellevekstanalyse (fig. 1B). HBEC celleproliferasjon ble også øket med tap av Wnt7a som målt ved MTS-analyse (data ikke vist). I B2B-celler, ble endret vekst i Matrigel 3D kulturen observert på 5 dager med tap av Wnt7a ekspresjon (Fig. 1C). Økt cellemigrering i et ripe-analyse etter 24 timer ble det observert med tap av Wnt7a uttrykk, hvor pilene angitte kantene av den innførte grunnen (Fig. 1C).
A) Ekspresjon av Wnt7a ble målt ved QPCR i HBEC og B2B celler etter stabil transfeksjon med Wnt7a shRNA eller en negativ shRNA. Data presentert som fold-endring i Wnt7a uttrykk normalisert til GAPDH. Feilfelt er SE av tredoble eksperimenter. Wnt7a slå ned ble også bekreftet av western blot med en β-aktin lasting kontroll. B) Celleproliferering ble målt i B2B celler som uttrykker Wnt7a shRNA eller en negativ shRNA. Celler ble analysert i en 6-dagers vekstanalyse. C) B2B-celler med Wnt7a shRNA ble analysert i et 3D-kultur analyse ved bruk av Matrigel og observert etter 5 dagers vekst for forandringer i morfologi sammenlignet med en negativ kontroll shRNA. B2B-celler med Wnt7a shRNA ble også analysert i en ripe migrasjonsanalyse og observert ved 24 timer for bevegelse inn i det innførte scratch sammenlignet med en negativ kontroll shRNA. Pilene viser kantene på scratch. Bilder representerer tredoble eksperimenter.
Wnt7a er metylert i humane NSCLC-cellelinjer og vev
Spørsmålet om hvordan Wnt7a uttrykk er tapt kan løses på flere måter.
Wnt7a
kunne bli slettet, mutert, eller denaturert, blant andre mekanismer. Mens kromosomet inneholder
er Wnt7a plakater (3p25) ofte slettet ved NSCLC denne mekanismen for tap, sammen med genmutasjon, i dag tilbyr lite i veien for terapeutisk intervensjon [17]. Tilstedeværelsen av epigenetisk mekanisme metylering ville tilby muligheten for å bruke gjeldende kliniske intervensjoner for å behandle NSCLC. Vi behandlet HBEC og B2B celler med tobakk carcinogen NNK, som er kjent for å føre til akkumulering av DNMT1 og økt tumor suppressor hypermethylation i NSCLC [18]. I de behandlede celler ble det observert en reduksjon i Wnt7a mRNA ekspresjon ved QPCR sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 2A). Metylering analyse viste at Wnt7a promoter i B2B og HBEC cellene har økt metylering etter eksponering for 10 um NNK (figur 2A). Dette antydet at
Wnt7a
er denaturert med eksponering for tobakk og kan være en mekanisme for tap i tobakk-assosiert NSCLC. For å bestemme hvorvidt metylering av
Wnt7a
var til stede i human lungetumorvevet, målte vi metylering av et CpG øy i promotoren i 82 par av humane lungetumorvevet og sammenliknes normalt lungevev. Gjennomsnittlig prosentvis metylering av de 13 CpG steder som ble målt var signifikant høyere i tumorvev sammenlignet med normalt vev analysert ved en paret t-test (fig. 2B). Tabell S1 viser prosent metylering ved hvert CpG stedet analysert og sammenlignet mellom tumor og normalt vev. Ingen enkelt CpG nettstedet analysert kan bli identifisert som kritiske for inaktivering av
Wnt7a
arrangøren, men det synes å være en trend mot økt metylering i tumorer ved CpG områder nærmere transkripsjon start stedet. To celle NSCLC cellelinjer, H157 og H1299, ble identifisert som skjuler
Wnt7a
promoter metylering av pyrosekvensering og ble brukt for senere in vitro eksperimenter (Fig. 2B). Disse data tyder på at tapet av Wnt7a ekspresjon ved metylering forekommer i en undergruppe av NSCLC.
A) B2B og HBEC-celler ble behandlet med 10 uM NNK i 2 timer og Wnt7a ekspresjon ble målt ved QPCR sammenlignet med en ubehandlet kontrollgruppe . Feilfelt er SEM av tredoble eksperimenter. Prosent metylering i B2B og HBEC celler ble analysert ved bruk av methyl Profiler systemet etter 2 timer 10 um NNK behandling sammenlignet med ubehandlede celler. B) Gjennomsnittlig prosentvis metylering av Wnt7a promoteren ble målt ved pyrosekvensering i NSCLC vev og sammenlignet med matchet normalt tilstøtende lungevev av paret t-test. Gjennomsnittlig prosentvis metylering av B2B, ble H157, og H1299 cellelinjer målt ved pyrosekvensering. C) En Wnt7a promoter luciferase ble endret av SSSI, HpaII, og HhaI metylering enzymer og transient transfektert inn i B2B og HBEC cellelinjer. Fold-endring i luciferaseaktivitet ble målt i forhold til umodifisert Wnt7a promoter luciferase-aktivitet. Feilfelt er SE av tredoble eksperimenter.
Den Wnt7a promoter deaktiveres ved metylering er restaurert med 5-aza-2 «deoxycytidine behandling
Som metylering av
Wnt7a
hadde ikke blitt studert tidligere, ønsket vi å verifisere at metylering av arrangøren regionen ville føre til inaktivering av arrangøren. En
Wnt7a
promoter luciferase ble behandlet med SSSI, HpaII, og HhaI methylases å bestemme effekten av metylering på
Wnt7a
promoter-regionen. SSSI påvirker alle CpG områder, HpaII bare CpG innen 5 «CCGG, og HhaI bare CpG innen 5’GCGC. Transfeksjon av
Wnt7a
promoter luciferase i B2B og HBEC cellelinjer viste redusert luciferase aktivitet etter behandling med alle tre methylases sammenlignet med en ubehandlet
Wnt7a
promoter luciferase, noe som indikerer at selv begrenset metylering inaktiverer
Wnt7a
promoter (fig. 2C). Vi hadde identifisert to NSCLC cellelinjer med metylering av
Wnt7a
promoter-regionen, H157 og H1299, og ønsket å bestemme effekten av behandling med en demethylating agent, 5-aza-2 «deoxycytidine (5 Aza). Cellene ble behandlet med 6 uM 5 Aza i 1-4 timer og uttrykk for Wnt7a ble målt ved QPCR og western blot. Eksponering til 5 Aza førte til øket ekspresjon av Wnt7a mRNA og protein (Fig. 3A og B). Som forventet, 5 Aza førte også til redusert metylering av
Wnt7a
promoter-regionen (Fig. 3D). Wnt7a er kjent for å signalisere gjennom sin reseptor Fzd9 til nedstrøms mål PPARy, så vi behandlet H157 og H1299-celler med 5 Aza, sammen med forbigående transfeksjon av Fzd9, og analysert aktiviteten av Wnt7a signalveien [19]. PPAR-responselement luciferase (PPRE), som aktiveres ved PAPRγ, viste øket aktivitet når cellene med metanoldenaturert
Wnt7a
ble eksponert 5 Aza og ekspresjon av Fzd9 (Fig. 3C). Disse dataene indikerer at medikamentell behandling av NSCLC celler kan reversere metylert tilstanden til
Wnt7a
promoter.
A) 157 og 1299 celler ble behandlet med 5 Aza i 2 timer og Wnt7a ble målt ved QPCR sammenlignet med ubehandlede kontroller. Feilfelt er SEM av tredoble eksperimenter. B) 157 og 1299-celler ble behandlet med 5 Aza for 1, 2 og 4 timer og sammenlignet med ubehandlede celler. Wnt7a protein-ekspresjon ble målt ved hjelp av immunblot med β-actin som en lasting kontroll. C) 157 og 1299 celler ble transient transfektert med Fzd9 og PPRE luciferase og 48 timer etter ble behandlet med 5 Aza i 2 timer. Luciferase-aktivitet ble målt og behandlede celler ble sammenlignet med en tom kontroll. Feilfelt er SE av tredoble eksperimenter. D) 1299-celler ble behandlet med 5 Aza i 2 timer og prosent metylering av Wnt7a promoteren ble målt ved hjelp av metyl-Profiler system. Behandlede celler ble sammenlignet med en ubehandlet kontroll. Feil bar er SE av tredoble eksperimenter.
Wnt7a promoter metylering moduleres av DNMT1
DNA metyltransferaser (DNMT) modulerer DNA metylering og deres overekspresjon har vært assosiert med lungekreft [4 ]. DNMT1 er kjent for å akkumulere i kjernen av NSCLC-celler i respons til eksponering for tobakk karsinogen NNK; har vi funnet at eksponering for NNK redusert ekspresjon av Wnt7a mRNA målt ved QPCR (fig. 2A) [18]. Når vi slått ned uttrykk for DNMT1 i Wnt7A metylert cellelinjer H157 og H1299 hjelp shRNA, uttrykk for DNMT1 redusert og uttrykk for Wnt7a tilsvarende økt med QPCR (fig. 4A). Redusert DNMT1 proteinekspresjon og øket Wnt7a ekspresjon ble også observert i H1299-celler (Fig. 4A). Som forventet, metylering av Wnt7a i DNMT1 slå ned H1299 cellene reduseres når målt ved pyrosekvensering (Fig. 4B). Ligner på en studie av Kassis et al. det funnet redusert spredning med RNAi uttømming av DNMT1, observerte vi en nedgang i clonogenicity i H1299 celler med slå ned på DNMT1 forhold til tomme og negative shRNA transfections (fig. 4C). Vi har også observert en retur til clonogenicity av den tomme transfeksjon med tillegg av Wnt7a shRNA til DNMT1 shRNA behandlede celler. Dette reduserte clonogenicity observert med DNMT1 shRNA behandlingsetterligner avtar i proliferasjon observert med restaurering av Wnt7a ekspresjon i tidligere studier [2]. Dette, kombinert med den økte clonogenicity observert med tillegg av Wnt7a shRNA, tyder på at tapet av Wnt7a ekspresjon kan være delvis ansvarlig for de negative effekter forbundet med DNMT1 overekspresjon i NSCLC [20]. Slå ned på DNMT3a eller 3b i H1299 cellene ikke føre til økt Wnt7a uttrykk, noe som tyder på at DNMT1 er ansvarlig for
de novo Hotell og vedlikehold metylering av
Wnt7a
promoter (Figur S1).
A) 1299 celler ble transient transfektert med DNMT1 shRNA og sammenlignet med tomme og shRNA negative kontroll-transfekterte celler. DNMT1 og Wnt7a mRNA uttrykk ble målt ved QPCR og presentert som fold-endring i forhold til den tomme kontroll. Feilfelt er SE av tredoble eksperimenter. DNMT1 shRNA og en shRNA negativ kontroll ble stabilt transfektert inn i 1299 celler og DNMT1 og Wnt7a protein ble målt ved immnoblot med en β-aktin lasting kontroll. B) transient transfektert 1299-celler ble analysert for Wnt7a promoter metylering ved hjelp av pyrosekvensering. DNMT1 shRNA og en negativ shRNA kontroll transfektert celler ble sammenlignet med tomme celler. Feilfelt er SE av tredoble eksperimenter. C) 1299 cellene med transient DNMT1 shRNA og /eller Wnt7a shRNA ekspresjon ble sammenlignet med en tom kontroll og den negative kontroll shRNA i en clonogenicity assay. Celler ble farget etter 4 dagers vekst, fotografert, og telles for kloningseffektivitet. Feilfelt er SE av dupliserte eksperimenter.
Sigarettrøyk kondensat eksponering fører til Wnt7a arrangøren metylering
Metylering har vist seg å være økt med eksponering for tobakkskreftfremkallende, så vi var interessert i effekten av sigarettrøyk kondensat (CSC) på metylering av
Wnt7a
promoter [20]. Vi vokste de ikke-transformerte cellelinjer HBEC og B2B i 1% CSC media i 12 uker og deretter ekstrahert RNA, DNA og proteiner. QPCR analyse fant redusert ekspresjon av Wnt7a i begge cellelinjer etter 12 uker med eksponering for CSC (Fig. 5A). Økt DNMT1 protein uttrykk ble bekreftet i B2B celler med CSC eksponering (Fig. 5B). Som forventet, økte metylering av
Wnt7a
promoter-regionen ble også identifisert i begge cellelinjene (Fig. 5C). Eksponeringen av lungeepitelet til de kreftfremkallende i sigarettrøyk er assosiert med økt metylering og påfølgende redusert uttrykk for Wnt7a.
A) HBEC og B2B celler ble behandlet med 1% CSC i cellevekstmedier i 12 uker og Wnt7a -ekspresjon ble målt ved QPCR. Feilfelt er SE av tredoble eksperimenter. B) Ekspresjon av DNMT1 ble målt ved western blot i B2B-celler behandlet med 1% CSC i 12 uker. Laster kontroll er β-aktin. C) HBEC og B2B-celler behandlet med 1% CSC i 12 uker, ble analysert for Wnt7a promoter metylering sammenlignet med ubehandlede kontroller ved bruk av metyl-Profiler system. Feilfelt er SE av tredoble eksperimenter.
Diskusjoner
Data fra denne studien støtter rollen Wnt7a som en tumor suppressor i lunge epitelceller og legger vekt på Wnt7a i opprettholde en epitelial fenotype hos voksne lungevev. Wnt7a ser ut til å være unik i litteraturen til nå, som ingen andre Wnt har blitt identifisert i NSCLC som en tumor suppressor eller som er relevante for opprettholdelse av en lunge epitelial fenotype. Wnt5a er kjent for å antagonisere β-catenin signalisering i spiserørskreft, men i NSCLC ekspresjon av Wnt5a synes å øke proliferasjonen [13], [21], [22]. Den betydelig ugunstig virkning av tapet av Wnt7a på lunge epitelceller motivert vår bestemmelse av en mekanisme for tap. viktig er også potensial for å løse terapeutiske strategier ansette reexpression av Wnt7a.
Hyppig tap av Wnt7a i NSCLC har tidligere blitt beskrevet og i den aktuelle studien, vi presenterte data som støtter betydningen av uttrykket av Wnt7a til lungene epitel [2]. Når Wnt7a ekspresjonen tapes fra ikke-transformerte lunge epiteliale cellelinjer, cellene erverve egenskapene av transformerte celler og begynner å ligne mer NSCLC-cellelinjer i formeringshastigheten, 3D kulturen vekst, og migrasjon. Hvis dette tapet av Wnt7a skulle inntreffe i en human pasient i kombinasjon med økt aktivitet av onkogener, kan effekten føre til utvikling av en lungetumor som har gjennomgått EMT, som er forbundet med dårligere prognose [23].
DNMT1 er antatt å være ansvarlig for å opprettholde metylering mønstre og sin opphøyde uttrykk har blitt identifisert som en prognostisk faktor i NSCLC progresjon [24]. Vi har funnet at når DNMT1 uttrykk er redusert, blir Wnt7a metylering redusert og ekspresjon øker. Vi har også vist at Wnt7a er ansvarlig for en del av redusert cellevekst observert med DNMT1 tap. Vanligvis er en ekstra DNMT involvert i bestemte de novo genet promoter metylering, mens DNMT1 opprettholder denne metylering. Imidlertid har nyere studier har rapportert at DNMT1 har også
de novo
metyltransferase aktivitet i CpG regioner [12]. Vår finne at tap av DNMT3a eller 3b ekspresjon resulterer ikke i økt ekspresjon i Wnt7a H1299 celler antyder at DNMT1 kan være den eneste DNMT ansvarlig for promoter metylering av Wnt7a. I så fall kan dette gjøre terapeutisk demetylering av
Wnt7a
gjennom reduksjon av DNMT aktivitet mindre komplisert som bare en DNMT måtte være målrettet og overvåkes.
Eksponering for tobakk karsinogener in vitro og in vivo har vært forbundet med endringer i DNMT aktivitet og epigenetiske endringer [11], [18], [25], [26]. I vår studie, behandling av ikke-transformerte lunge epitelceller med CSC ført til økt metylering av Wnt7a og en tilsvarende nedgang i uttrykk. En tidligere studie av Liu et al. funnet redusert Wnt7a uttrykk ved matrise etter CSC eksponering [11]. Flere studier har vist økte DNMT1 proteinekspresjon eller akkumulering og øket metylering av spesifikke gener etter eksponering for tobakks karsinogener [18], [25], [26]. Tap av Wnt7a uttrykk har blitt identifisert som en hyppig hendelse i NSCLC, men denne studien er den første til å foreslå en mekanisme for tap og for å vise at tobakks karsinogener kan påvirke dette tapet [2].
Wnt7a spiller en betydelig rolle i opprettholdelsen av en normal epitelial fenotype i lungevevet. Som sådan, kan tapet av Wnt7a ha en stor innvirkning på utviklingen av lungekreft, spesielt når kombinert med oppregulering av en innflytelsesrik onkogen. Denne studien undersøker viktige spørsmålet om hvordan Wnt7a uttrykk er tapt, og hvordan dens uttrykk kan gjenopprettes i et forsøk på å behandle lungekreft. Restaurering av Wnt7a uttrykk kan også ha potensiell anvendelse i andre epiteliale kreftformer eller lungesykdommer. Terapeutisk restaurering av Wnt7a signalering i NSCLC kan oppnås med midler som allerede er i klinisk bruk, inkludert demethylating agenter og prostasyklin analog Iloprost, som vi nylig identifisert som en aktivator av Wnt7a signalveien [27]. Videre arbeid vil bli gjort for å etablere tidspunktet for Wnt7a tap og potensial in vivo effekter av behandling for
Wnt7a
metylering. Dataene fra denne studien presenterer en betydelig og tidligere ubeskrevet skritt mot utviklingen av terapeutiske Wnt7a strategier for NSCLC.
Metoder
Cell Culture, menneskelig vev, og reagenser
NSCLC og Beas2B cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator. Den HBEC (humane bronkiale epitelceller) cellelinje ble dyrket i Bronchial Epithelial Basal Media ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator. Cellelinjer ble erholdt fra ATCC (www.atcc.org), med unntak av HBEC cellelinje som ble oppnådd i 2009 fra Dr. Robert Doebele ved University of Colorado Denver [28]. Morfologi av alle cellelinjer ble målt to ganger ukentlig, og lagrene av cellelinjer ble passaged ikke mer enn ti ganger for bruk i eksperimenter. RNA og DNA fra 82 par av menneskelig lungevev og tilstøtende normalt lungevev ble hentet fra University of Colorado Cancer Center SPORE i Lung Cancer patologi Core. NNK (Sigma) ble påført på 10 uM i 2 timer i celledyrkningsmedia. Celler ble behandlet med 5-aza-2′-deoksycytidin (5 Aza) (Sigma) ved 6 uM i cellevekstmedium i 1-4 timer, avhengig av analysen. Sigarettrøyk kondensat (CSC) (Murty Pharmaceuticals) ble påført ved en konstant 1% konsentrasjon i cellevekstmedier for de 12 ukene.
Knockdown studier, spredning, 3D kultur, og grunnen analysen
Wnt7a uttrykk ble slått ned stabilt i HBEC og B2B cellelinjer ved hjelp av en lentiviral shRNA system fra Åpne Biosystems med puromycin utvalg. Dnmt uttrykk ble slått ned med Sure-lyddemping shRNA fra SABiosciences med hygromycin utvalg for stabil uttrykk. Forbigående knock down av Wnt7a ble oppnådd med en retroviral shRNA system fra Åpne Biosystems. Proliferasjon analyse ble utført i B2B-celler ved anvendelse av en 6-dagers celletall, hvor et likt antall celler blir sådd ut i seks brønner og man også telles hver dag. I HBEC celler ble Cell Titer Aqueous assay (Promega) som anvendes, og cellene ble analysert hver 24. time i 72 timer. I 1299-celler, ble en clonogenicity test som benyttes, hvor 1000-celler ble sådd ut i normale vekstmedier og farget med krystallfiolett for klon vekst på dag 4. Kolonier ble fotografert og telles for kloningseffektivitet. Kloning effektivitet er antall kolonier delt på antall celler belagt. Tredimensjonale basalmembran-kulturer ble etablert som tidligere beskrevet [29]. I korthet, 5000 celler /brønn ble dyrket i 2% matrigel (BD Bioscience) med EGF på en 50% matrigel basislaget. For scratch-analyse ble celler dyrket i fullstendig vekstmedium inntil 90-100% sammenflytende. En 3 mm klaring ble innført på tvers av diameteren av hver plate. Ved tid null ble cellene behandlet med 1 pg /ml mitomycin for å inhibere celleproliferasjon. Cellemigrasjon ble spilt inn på 24 timer. Bilder ble tatt med en 40 × objektiv på et lysmikroskop og et digitalt kamera.
Transfeksjon
Reporteren plasmid PPAR Response Element luciferase (PPRE) (3 mikrogram), Fzd9 plasmid, og Wnt7a -luciferase ble transfektert inn i cellene ved hjelp Lipofectamine Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler ble samlet opp, vasket med PBS og resuspendert i luciferase reporter Lysis Buffer (Promega). Dataene er presentert som fold-endring i relative lysenheter /millienheter β-galaktosidase og representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. Endring av Wnt7a luciferase ble gjennomført med SSSI, HpaII, og HhaI henhold til produksjon protokoll (New England Biolabs). Forbigående eller stabil transfeksjon av DNMT og Wnt7a shRNA ble utført med Sure-lyddemping shRNA fra SABiosciences eller retrovirale shRNA fra Åpne Biosystems og Attractene Transfeksjon Reagens (Qiagen).
Kvantitativ PCR
RNA ble ekstrahert fra celler med den AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen) og 5 ug RNA ble omdannet til cDNA. PCR ble utført med SABioscience RT
2 primere og mester mix. GAPDH ble anvendt for å normalisere alle prøver. QPCR data presenteres som fold-endring i norm mRNA nivåer i kontroll vs eksperimentelle prøver og er gjennomsnittet av minst tredoble eksperimenter med standard feil presentert som feilfelt.
immunoblotanalyse
Celler ble høstet og proteinekstrakter ble fremstilt ved bruk av et kart kinasebuffer. Proteiner ble påvist ved kjemiluminescens og ChemiDoc systemet (BioRad). De følgende antistoffer ble anvendt for immunblotting: Wnt7A (R & D Systsems), DNMT1 (Abcam) og β-aktin (Abcam). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
DNA metylering analyse
DNA ble isolert fra cellelinjer og tumorprøver ved bruk av AllPrep DNA /RNA Mini Kit (Qiagen) og modifisert ved bruk av EZ DNA Metylering-gull kit (Zymo Research). 1 ug av DNA ble benyttet for pyrosekvensering for
Wnt7a
i en analyse designet og utført av Epigendx. Data fra pyrosekvensering er presentert som gjennomsnittlig prosent metylering, som er gjennomsnittet av den prosentvise metylering ved 13 CpG områder innenfor den CpG øya i Wnt7a promoteren. Den Methyl-Profiler systemet fra SABiosciences ble anvendt for å måle Wnt7a metylering i 5-aza og CSC behandlede celler. Data presentert som prosent metylert DNA i Wnt7a promoter.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Expression of Wnt7a ikke økes med DNMT3A eller 3B knockdown. QPCR ble anvendt for å måle mRNA-nivåer av DNMT3A eller 3B og Wnt7a i H1299 celler med knockdown av DNMT3A eller 3B. shRNA data er sammenlignet med en negativ kontroll og presentert som fold-endring normalisert til GAPDH
doi:. 10,1371 /journal.pone.0032921.s001 plakater (TIF)
Tabell S1.
metylering av human lunge svulstvev ble analysert ved hjelp av pyrosekvensering. Hver svulst ble analysert ved 13 CpG steder i
Wnt7a
promoter. Den prosent av tumorer metylert i mer enn 0% av DNA er vist nederst i tabellen for hvert område. Metylering av normalt lungevev avstemt til tumorvev i tabell S1 ble analysert ved pyrosekvensering. Hver prøve ble analysert ved 13 CpG steder i Wnt7a promoter. Prosentandelen av prøver med metylering større enn 0% er indikert på bunnen av tabellen for hvert nettsted
doi:. 10,1371 /journal.pone.0032921.s002 product: (PDF)
