Abstract
Mens Mesd ble oppdaget som en spesialisert molekylær endoplasmatiske retikulum anstand for Wnt co-reseptorer LRP5 og LRP6, er rekombinant Mesd protein i stand til å binde seg til modne LRP5 og LRP6 på celleoverflaten, og fungerer som en universell antagonist av LRP5 /6 modulatorer. I vår tidligere studie har vi funnet at den C-terminale region av Mesd, som er fraværende i sekvenser fra virvelløse dyr, er nødvendig og tilstrekkelig for binding til modne LRP6 på celleoverflaten. I de foreliggende undersøkelser, karakterisert vi videre samspillet mellom den C-terminale region Mesd peptid og LRP5 /6. Vi fant at Mesd C-terminale region-avledede peptider som blokkerer Mesd binding til LRP5 på celleoverflaten også. Vi viste også at det er to LRP5 /6 bindingsseter innenfor Mesd C-terminale område som inneholder flere positivt ladede rester. Videre har vi vist at Mesd C-terminale region peptid, som full-lengde Mesd protein, blokkert Wnt 3a- og Rspodin1-indusert Wnt /β-catenin signalisering i LRP5- og LRP6- uttrykkende celler, undertrykkes Wnt /β-catenin signalering i humane bryst HS578T celler og prostata cancer PC-3-celler og inhiberte cancer celleproliferasjon, selv om full-lengde Mesd protein er mer potent enn dens peptid. Til slutt fant vi at behandling av full-lengde Mesd protein og dens C-terminale region peptid betydelig økt kjemoterapimiddel Adriamycin-indusert cytotoksisitet i HS578T og PC-3 celler. Til sammen tyder våre resultater at Mesd C-terminale region utgjør største LRP5 /6-bindende domene, og at Mesd protein og dets C-terminale område peptidet har en potensiell terapeutisk verdi i kreft
relasjon:. C Lin Lu W, Zhang W, Londono-Joshi AI, Buchsbaum DJ, Bu G, et al. (2013) Den C-Terminal Region Mesd Peptide Ligner Full-Length Mesd og virker som en inhibitor av Wnt /β-catenin signale i kreftceller. PLoS ONE 8 (2): e58102. doi: 10,1371 /journal.pone.0058102
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 8. mai 2012; Godkjent: 03.02.2013; Publisert: 28 februar 2013
Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra National Institutes of Health RO1CA124531 (til YL) og National Cancer Institute gi CA 13148 (til UAB Comprehensive Cancer Center). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Yonghe Li og Guojun Bu er oppført som oppfinnere på et patent for bruk av Mesd i skjelettsykdommer og kreft, og Guojun Bu fungerer som en konsulent for Raptor Pharmaceutical, som har lisensiert dette patentet fra Washington University i St. Louis. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Den lave density lipoprotein reseptor-relatert protein-5 (LRP5) og LRP6 er to medlemmer av den ekspanderende low density lipoprotein receptor (LDLR) familien. De frizzled (Fzd) reseptorer kan svare på wnt proteiner bare i nærvær av det Wnt ko-reseptor LRP5 eller LRP6 å aktivere den kanoniske β-catenin pathway. I fravær av Wnts, er β-catenin sekvestrert i et kompleks som består av adenomatøs polypose coli (APC) tumor suppressor, Axin, glykogensyntasekinase-3β (GSK3P), og kasein kinase 1 (CK1). Denne kompleksdannelse induserer fosforylering av β-catenin ved CK1 og GSK3P, noe som resulterer i ubiquitinering og etterfølgende nedbrytning av β-catenin av 26S proteasomet. Handlingen i dette komplekset hemmes ved binding av Wnt til sine celleoverflatereseptorer Fzd og LRP. LRP-Wnt-Fzd binding resulterer i stabilisering av cytosoliske β-catenin, noe som deretter går inn i kjernen for å danne et kompleks med transkripsjonsfaktorene av T-celle-faktor /lymfoid fremmende faktor (TCF /LEF) familie for å aktivere transkripsjon av Wnt target gener som regulerer cellesyklusen, vekst og progresjon [1] – [3].
LRP5 og LRP6 underkastes modulering av flere utskilte proteiner som binder til ekstracellulære β-propell /EGF gjenta moduler av LRP5 /6 [3]. Wnt og Rspondin (RSPO) proteiner er to grupper av Wnt /β-catenin signale agonister. I likhet med wnt ligander, evnen til å RSPO proteiner på Wnt /β-catenin signalering krever Wnt reseptorer Fzd og LRP5 /6, selv om den direkte binding mellom RSPO og LRP5 /6 er kontroversiell [4] – [8]. Videre RSPO proteiner er i stand til å synergize med Wnt ligander for å aktivere Wnt /β-catenin signale [5], [8], [9].
Mens Mesd ble oppdaget som en spesialisert molekylær endoplasmatiske retikulum (ER) anstand for wnt co-reseptorer LRP5 og LRP6 [10], [11], er rekombinant Mesd protein i stand til å binde seg til å modne LRP5 og LRP6 på celleoverflaten, virker som en universell inhibitor av forskjellige LRP5 /6-modulatorer, og undertrykker wnt /β-catenin signalisering i Wnt-avhengige kreftceller [8], [12] – [14]. I vår tidligere studie har vi funnet at den C-terminale region av Mesd, som er fraværende i sekvenser fra virvelløse dyr, er nødvendig og tilstrekkelig for binding til modne LRP6 på celleoverflaten [12]. I de foreliggende undersøkelser, karakterisert vi interaksjonen mellom den C-terminale region Mesd peptid og LRP5 /6. Vi studerte også rollen som den C-terminale regionen Mesd peptid i Wnt /β-catenin signalisering i kreftceller.
Materialer og metoder
Material
Plasmid pcDNA3.1C -Myc-hLRP5 inneholder full-lengde human LRP5 cDNA og plasmid PCS-Myc-hLRP6 inneholder full-lengde human LRP6 cDNA var fra Dr. Cindy Bartels (case Western Reserve University, Cleveland) og Dr. Christof Niehrs (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Tyskland), henholdsvis. Plasmid pGST-E-cadherin ble gitt av Dr. Gail Johnson (University of Rochester, New York). Plasmid pUSEamp-Wnt1-HA inneholder full-lengde mus Wnt1 cDNA ble kjøpt fra Upstate. Plasmid BA-Wnt10b inneholder full-lengde mus Wnt10b var fra Addgene. Den TOPFlash luciferase konstruksjonen var fra Upstate bioteknologi, og Super8XTOPFlash luciferase konstruksjonen ble gitt av Dr. Randall T. Moon (University of Washington, Seattle). En β-galaktosidase-uttrykkende vektor var fra Promega. Fremstilling av rekombinant mus Mesd protein og mus Mesd C-terminale region peptid, mMesd (50-195), har blitt beskrevet tidligere [12]. Alle andre muse Mesd peptider, human Mesd C-terminale område peptid hMesd (160-197) (KGGGSKEKNKTKQDKGKKKKEGDLKSRSSKEENRAGNK) og sin kontroll peptid (KEGDRKPRASKEGDRKPRASKEGDRKPRASKEGDRKPR) ble produsert av EZBiolab. Rekombinant human Rspo1 protein ble gitt av Dr. Kyung-Ah Kim (Nuvelo Inc., California). Adriamycin ble kjøpt fra Sigma. Anti-osteoprotegerin (OPG) antistoff ble hentet fra R 0,01 i forhold til de LRP6 eller LRP5 celler i fravær av Mesd og dets peptider
Det er to LRP5 /6 bindingssteder innenfor Mesd C-terminal omegn
for ytterligere å karakterisere Mesd binding til LRP5 /6, vi forberedt 6 Mesd peptider basert på musen Mesd C-terminale region sekvens (figur 1A), og utførte
125I-Mesd bindingsanalysen med LRP6- og LRP5-uttrykkende celler i nærvær eller fravær av disse peptidene. Mens mMesd (155-164) og mMesd (165-182) var ikke i stand til å blokkere Mesd proteinbinding til LRP5 eller LRP6 på celleoverflaten, mMesd (160-169) viste en lignende grad av inhibering som mMesd (155-173) ( figur 1C). I tillegg mMesd (183-191) viste også en lignende grad av inhibering som mMesd (174-191) og mMesd (160-169) (figur 1C). Til sammen indikerer disse resultatene at det er to LRP5 /6 bindingsseter innenfor Mesd C-terminale region. Dessuten er det interessant å merke seg at mMesd (160-169) og mMesd (183-191) viste deres inhiberende evne ved en konsentrasjon på 50 uM, noe som er 100 ganger av det som kreves for mMesd (155-191), noe som tyder på at den to LRP5 /6 bindingssteder innenfor Mesd C-terminal region samarbeide med hverandre for å skape en høy affinitet bindende domene til LRP5 /6.
Isolerte C-terminal peptider opprettholde strukturelle kjennetegn ved full lengde Mesd
resultatene av bindingsanalysene er i samsvar med fersk NMR-undersøkelse på en full-lengde Mesd [24], som viser at den C-terminale fleksibel skrueformet domene (156-195) er strukturelt forskjellig fra kjernedomenet (1- 155), og er ansvarlig for eskorte funksjon Mesd ved binding til LRP5 /6. Likevel kan peptidene ha betydelige strukturelle endringer når isolert fra proteiner. For ytterligere å utforske de strukturelle innsikt, utførte vi molekylære dynamikk simuleringer på alle tre peptider [mMesd (155-191), mMesd (160-169) og mMesd (183-191)] og sammenlignet dem med NMR strukturen i full lengde Mesd protein. Clustering analyse av simuleringsresultatene viste at alle tre peptidene vedtatt relativ stabil konformasjon. Den mest befolkede konformasjoner av de tre peptider ble vist i figur 2C-2E. I stedet for den utvidede sløyfe-lignende form av C-terminale domene i full lengde Mesd (figur 2A), mMesd (155-191) foldes inn i en mer kompakt struktur med både C- og N-termini bøyer seg mot midten ( figur 2B). Til tross for de åpenbare strukturelle forskjeller, begge strukturene opprettholdes en positiv overflate besto av positivt ladede rester med sine sidekjedene finner på samme side og sterkt utsatt for oppløsningsmiddel (figur 2A og 2B). Slike positive overflaten er avgjørende for Mesd s bind kapasitet til å modne LRP5 /6. Interessant, kan denne positive overflaten romlig deles inn i to områder som i hovedsak består av de positivt ladede rester fra mMesd (160-169) og mMesd (183-190), henholdsvis (figur 2A og 2B). Simulering Resultatene viser at ~45% og ~58% av alle simulerings snapshots av mMesd (160-169) og Mesd (182-190), henholdsvis vedtatt lignende conformations som de tilsvarende de i full lengde Mesd struktur (figur 2D og 2E). De tilsvarende strukturelle egenskaper og positiv overflate forklare at de to korte peptider viser en lignende funksjon på binding til LRP5 /6.
(A) NMR-strukturen i mus Mesd C-terminalt domene (155-191) på grunnlag av studiet av Chen et al. (24). (B) Den mest representative øyeblikksbilde av peptid mMesd (155-191). Segmentene av 160-169 og 183-191 ble markert i oransje og grønne farger. Rester som danner positive overflaten ble vist i solide kjepper. De to overflateområder som består av rester 160-169 segment eller fra 183-191segment ble markert med blå og røde stiplede sirkler. Rester som er unike i den positive overflaten av A) eller B) ble merket med rød farge. (C-E) De mest befolkede conformations basert på clustering analyse av simuleringsøyeblikksbilder av tre C-terminale peptider mMesd (155-191) (C), mMesd (160-169) (D) og mMesd (183-191) ( E).
Den Mesd C-terminal region peptid blokker Wnt /β-catenin signal indusert av Wnt3A og Rspo1 i LRP5- eller LRP6-uttrykke HEK293 celler
Wnt3A er en av de 19 virveldyr medlemmer av familien Wnt. Det er fire medlemmer i RSPO familien. Både Wnt3A og Rspo1 er i stand til å aktivere Wnt /β-catenin signalisering gjennom LRP5 eller LRP6 [5], [8], [9]. Derfor, utførte vi Wnt /β-catenin signale reporter-analyse for å teste hvorvidt den Mesd C-terminale region peptid-etterligner Mesd protein for å virke som en inhibitor av Wnt /β-catenin signalering indusert ved Wnt3A og Rspo1 i LRP5- eller LRP6-uttrykkende celler . HEK293-celler ble transient transfektert med LRP5 eller LRP6 sammen med Wnt /β-catenin signale reporter TOPFLash, og behandlet med Wnt3A CM eller Rspo1 protein i nærvær eller fravær av mus Mesd protein eller dets C-terminale område peptid mMesd (155-191) . Som forventet, ble TOPFlash aktivitet sterkt øket etter HEK293-celler ble transient transfektert med LRP5 eller LRP6 og behandlet med Wnt3A eller Rspo1 (figur 3). Viktigere var den økte TOPFlash aktivitet indusert ved LRP5, LRP6, LRP5 pluss Wnt3A, LRP6 pluss Wnt3A, LRP5 pluss Rspo1, eller LRP6 pluss Rspo1 blokkeres ikke bare ved Mesd protein, men også ved sin peptid mMesd (155-191) på en doseavhengig måte (figur 3).
HEK293-celler i 24-brønners plater ble transient transfektert med plasmid LRP5 (A), den LRP6 plasmid (B) eller det tilsvarende kontrollvektor, sammen med TOPFlash luciferase konstruksjonen og den β-galaktosidase-uttrykkende vektor i hver brønn. Etter 24 timers inkubering ble cellene behandlet med Wnt3A CM (5%), Rspo1 (40 ng /ml), mus Mesd (mMesd) (2 uM), eller mus Mesd C-terminale område peptid mMesd (155-191) ved indikerte konsentrasjoner. Luciferaseaktiviteten ble deretter målt 24 timer senere med normalisering av aktiviteten av β-galaktosidase. Verdiene er gjennomsnittet av trippel bestemmelser med S.D. angitt med feilfelt. * P 0,05, ** P 0,01 sammenlignet med kontroll celler uten Mesd og dens peptid behandling
Den Mesd C-terminal region peptid blokker LRP6 fosforylering og OPG expressioninduced av Wnt3A og Rspo1 i C2C12. celler
C2C12 cellene er iverk mus mesenchymale stamceller som kan differensieres til osteoblaster ved aktivering av Wnt /β-catenin signal [9], [25], [26]. Vi ansatt C2C12 celler for å ytterligere undersøke effekten av Mesd peptid på Wnt3A-indusert Wnt /β-catenin signalering. LRP6 fosforylering er kritisk for Wnt /β-catenin signalering indusert ved wnt proteiner [3], og OPG er et direkte mål gen av Wnt /β-catenin signalisering i osteoblaster [27], [28]. Vi fant ut at mus Mesd C-terminale område peptid mMesd (155-191), som Mesd protein, var i stand til å undertrykke Wnt3A-indusert endogen LRP6 fosforylering og OPG uttrykk i C2C12 celler (figur 4A og 4B).
(A) C2C12-celler i 6-brønners plater ble behandlet med Wnt3A CM (5%) i fravær eller nærvær av mus Mesd (mMesd) (0,5 pM) eller mus Mesd C-terminale område peptid mMesd (155-191) ved indikerte konsentrasjoner i 6 timer. Nivået av fosforylert LRP6 ble analysert. (B) C2C12-celler i 6-brønners plater ble inkubert med Wnt3A CM (5%) i nærvær eller fravær av mMesd (0,5 pM) eller mMesd (155-191) ved de angitte konsentrasjoner i 48 timer. Nivåene av totalt cellulært OPG ble analysert ved Western blotting. (C) C2C12-celler i 6-brønners plater ble inkubert med Rspo1 (20 ng /ml) og /eller Wnt3A CM (2%) i fravær eller nærvær av mMesd (0,5 pM) eller mMesd (155-191) (2 um ) i 48 timer. Nivåene av totalt cellulært OPG ble analysert ved Western blotting. Alle prøvene ble også probet med anti-actin-antistoff for å bekrefte lik belastning.
Rspo1 er i stand til å synergizes med Wnt3A i indusering av OPG-ekspresjon i C2C12-celler, selv om Rspo1 seg selv har liten effekt [9] . Vi fant ut at mus Mesd C-terminale område peptid mMesd (155-191), som ligner på Mesd protein, trykt OPG uttrykk indusert av Rspo1 pluss Wnt3A i C2C12 celler (Figur 4C).
Den Mesd C-terminal region peptid demper Wnt /β-catenin signalisering i prostatakreft PC-3 celler og brystkreft HS578T celler
Samler bevis indikerer at Wnt co-reseptor LRP6 spille en avgjørende rolle i Wnt /β-catenin signaleaktivering i menneske prostata og brystcancerceller og er viktig ved utvikling og progresjon av disse to typer av kreft [8], [13], [14], [29] – [33]. For å teste om Mesd C-terminale område peptid er i stand til å undertrykke Wnt /β-catenin signal i menneskelig prostata og bryst kreft celler, har vi utarbeidet en human Mesd C-terminale område peptid hMesd (160-197) som er tilsvarende mus Mesd C-terminale område peptid mMesd (155-191). Vi har også fremstilt en negativ kontroll peptid basert på sekvensen av mMesd (155-164). I likhet med mMesd (155-191), hMesd (160-197) vises hemmende effekt på Wnt /β-catenin signal indusert av LRP6, Wnt3A, Rspo1, Wnt1 og Wnt10b (figur S1 og S2). Vi fant at hMesd (160-197), men ikke kontroll peptidet, etterligne Mesd protein og betydelig undertrykt Wnt reporter luciferaseaktiviteten i prostata cancer PC3-celler og brystkreft HS578T celler (Figur 5A). Følgelig hMesd (160-197) sterkt redusert nivåene av cytosoliske gratis β-catenin, LRP6 fosforylering og Wnt /β-catenin signal mål Axin2 og cyclin D1 uttrykk i PC-3 og HS578T celler (figur 5B).
(A) PC-3 og HT578T celler i 24-brønners plater ble transient transfektert med luciferase Super8XTOPFlash konstruksjonen og β-galaktosidase-uttrykkende vektor i hver brønn. Etter 24 timers inkubering ble cellene behandlet med mus Mesd (mMesd), humant Mesd peptid hMesd (160-197) eller kontroll peptid ved de angitte konsentrasjoner. Luciferaseaktiviteten ble deretter målt 24 timer senere med normalisering av aktiviteten av β-galaktosidase. Verdiene er gjennomsnittet av trippel bestemmelser med S.D. angitt med feilfelt.
** P
0,01 sammenlignet med kontrollceller uten Mesd eller Mesd peptid behandling. (B) PC-3 og HS578T cellene i 6-brønns plater ble behandlet med mMesd, hMesd (160-197) eller kontroll peptid ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. Nivåene av cytosoliske gratis β-catenin, og total cellular β-catenin, LRP6, Axin2, cyclin D1 og fosforylert LRP6 ble deretter analysert ved Western blotting. Prøvene ble også probet med anti-actin-antistoff for å bekrefte lik belastning.
Wnt1 regulerer cellulær differensiering og proliferasjon av brystepitel, og Wnt1 opp-regulering i melkekjertelen har blitt vist å indusere mammary hyperplasi og adenokarsinom [34], [35]. Overekspresjon av Wnt1 ble funnet i de fleste av prostata karsinom prøvene [36]. For ytterligere å karakterisere den hemmende effekten av den Mesd C-terminale region peptid i prostata og bryst kreft celler, vi transient transfektert PC-3 og HS578T celler med Wnt1 og wnt reporter plasmider og behandlet med Mesd protein eller human Mesd peptid hMesd (160-197 ). Vi fant igjen at hMesd (160-197), men ikke kontroll peptidet, etterlignet Mesd protein for å undertrykke Wnt reporter luciferase-aktivitet indusert ved Wnt1 i PC3 og HS578T-celler (figur 6A) betydelig. Videre hMesd (160-197) sterkt redusert nivåene av cytosoliske gratis β-catenin, LRP6 fosforylering og Wnt /β-catenin signal mål Axin2 og cyclin D1 i Wnt1-uttrykke PC-3 og HS578T celler (figur 6B).
(A) PC-3 og HT578T celler i 24-brønners plater ble transient transfektert med plasmidet Wnt1 sammen med Super8XTOPFlash luciferase konstruksjonen og β-galaktosidase-uttrykkende vektor i hver brønn. Etter 24 timers inkubering ble cellene behandlet med mus Mesd (mMesd), humant Mesd peptid hMesd (160-197) eller kontroll peptid ved de angitte konsentrasjoner. Luciferaseaktiviteten ble deretter målt 24 timer senere med normalisering av aktiviteten av β-galaktosidase. Verdiene er gjennomsnittet av trippel bestemmelser med S.D. angitt med feilfelt.
** P
0,01 sammenlignet med kontrollceller uten Mesd eller Mesd peptid behandling. (B) PC-3 og HS578T celler i 6-brønners plater ble transient transfektert med plasmid Wnt1 eller den tilsvarende kontrollvektor. Etter å ha blitt inkubert i 24 timer, ble cellene behandlet med mMesd, hMesd (160-197) eller kontroll peptid ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. Nivåene av cytosoliske gratis β-catenin, og total cellular Wnt1, β-catenin, LRP6, Axin2, cyclin D1 og fosforylert LRP6 ble deretter analysert ved Western blotting. Prøvene ble også probet med anti-actin-antistoff for å bekrefte lik belastning.
Den Mesd C-terminale region peptid inhiberer prostatacancer PC-3 og brystkreft HS578T celleproliferasjon
Å fastslått at Mesd C-terminale region peptid undertrykker Wnt /β-catenin signalisering i PC-3 og HS578T celler, vi deretter undersøkt effekten av den Mesd C-terminale region peptidet på kreftcelleformering. Som vist i figur 7, hMesd (160-197), men ikke kontroll peptidet, etterligne Mesd protein og vist hemmende virkning på PC-3 og HS578T celleproliferasjon på en tidsavhengig måte (figur 7A). For å bekrefte den hemmende effekten av Mesd peptidet på kreftcelleformering, utførte vi BrdU-inkorporering assay etter at cellene ble behandlet med peptider. Det ble funnet at den Mesd C-terminale region peptid ble redusert BrdU-inkorporering inn i PC-3 og HS578T celler (figur 7B).
(A) Kreftceller i 6-brønners plater ble behandlet med mus Mesd (mMesd, 2 uM), human Mesd peptid hMesd (160-197) (4 uM) eller kontroll peptid (4 uM) i RPMI-1640 medium inneholdende 2% FBS for PC-3-celler eller DMEM-medium inneholdende 2% FBS for HS578T i 10 dager . Mediene ble endret annenhver dag, og cellene ble høstet og telles ved hjelp av trypanblått eksklusjon analysen. Verdier er gjennomsnitt av tre bestemmelser med standardavvik angitt med feilfelt. **
P
0,01 sammenlignet med celler behandlet med PBS eller kontroll peptid. (B) Kreftceller i T-25 kolber ble behandlet med humant Mesd peptid hMesd (160-197) (2 uM) eller kontroll peptid (2 mM) i dyrkningsmedium inneholdende 2% FBS i 7 dager. Mediene ble endret annenhver dag. Cellene ble deretter høstet og sådd ut i 96-brønners vevkulturplater ved en densitet på 5000 celler /brønn med hMesd (160-197) (2 uM) eller kontroll peptid (2 mM) i dyrkningsmedium inneholdende 10% FBS for 2 dager. Celleproliferasjon ble målt ved BrdU spredning ELISA. Alle verdier er gjennomsnittet av seks bestemmelser med S.D. angitt med feilfelt.
** P 0,01
sammenlignet med celler behandlet med kontroll peptid
Mesd protein og dens C-terminale region peptid potensere kjemoterapi middel Adriamycin-indusert cytotoksisitet i PC-3 og HS578T. Chen et al.
