Abstract
Behandling av avansert eggstokkreft innebærer platina-basert kjemoterapi. Imidlertid er chemoresistance et stort hinder. Cancer stamceller (cscs) er antatt å være en av årsakene til chemoresistance, men den underliggende mekanismen fortsatt ukjent. Nylig har menneskelig telomerase revers transkriptase (hTERT) er rapportert å fremme CSC-lignende egenskaper. I denne studien fant vi at en mitotisk inhibitor, eribulinmesylat (eribulin), effektivt hemmet veksten av platina-resistent eggstokkreft cellelinjer. Eribulin-sensitive celler viste en høyere effektivitet for sfære formasjon, noe som tyder på at disse cellene har en forbedret CSC-lignende fenotype. Dessuten, disse cellene uttrykte et høyere nivå av hTERT, og undertrykkelse av hTERT ekspresjon ved siRNA resulterte i redusert følsomhet for eribulins, noe som tyder på at hTERT kan være et mål for eribulins. Faktisk fant vi at eribulin direkte hemmet RNA-avhengig RNA polymerase (RdRP) aktivitet, men ikke telomerase aktivitet av hTERT
i
vitro
. Vi foreslår at eribulin rettet mot RdRP aktivitet hTERT og kan være et effektivt behandlingsalternativ for cscs. Videre kan hTERT være en nyttig biomarkør for å forutsi klinisk respons på eribulin
Citation. Yamaguchi S, Maida Y, Yaskawa M, Kato T, Yoshida M, Masutomi K (2014) eribulinmesylat Targets Menneskelig Telomerase revers transkriptase i eggstokkreft celler. PLoS ONE 9 (11): e112438. doi: 10,1371 /journal.pone.0112438
Redaktør: Taro Yamashita, Kanazawa University, Japan
mottatt: 19 august 2014; Godkjent: 06.10.2014; Publisert: 06.11.2014
Copyright: © 2014 Yamaguchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grant i Aid for Scientific Research (26462544) (til SY) fra Japan Society for Promotion of Science (http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/), Virkemidler for neste generasjon av verdens ledende forskere (neste program) (til KM) fra Japan Society for Promotion of Science (http: //www .jsps.go.jp /engelsk /e-jisedai /), Mitsubishi Foundation (KM) (https://www.mitsubishi-zaidan.jp/en/), den Uehara Memorial Foundation (KM) (http: //www.ueharazaidan.or.jp/), og National Cancer Center Research and Development Funds (26-A-5) (KM) (https://www.ncc.go.jp/jp/about/rinri/Kaihatsu /). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige av alle gynekologiske kreftformer, som utgir seg rundt 150 000 liv årlig over hele verden. Flertallet av eggstokkreft er diagnostisert på et avansert stadium, og platina-basert kjemoterapi er standard førstelinjebehandling for pasienter med fremskreden kreft i eggstokkene. Imidlertid er chemoresistance et stort hinder i behandling av eggstokkreft.
Serous adenokarsinom (SAC), den vanligste typen av eggstokkreft, vanligvis svarer godt til første platinabasert kjemoterapi, selv om det vil gjenta seg og til slutt utvikle narkotika motstand. Clear cell carcinoma (CCC), den nest vanligste typen i Japan, er ofte resistent mot første platina-basert kjemoterapi [1]. Uavhengig av hvorvidt motstanden anskaffes eller primære, mer lovende terapeutiske strategier er nødvendig for å overvinne chemoresistance og forbedrer prognosen for ovarian kreftpasienter.
Nylige studier har antydet at kreft stamceller (cscs) er, i det minste delvis ansvarlig for chemoresistance i mange typer av kreft inkludert eggstokkreft [gjennomgått i [2]]. Cscs er en subpopulasjon av tumorceller, som er kjennetegnet ved en selvfornyelse kapasitet og evne til å differensiere til forskjellige celletyper. Fremveksten av cscs forekommer i det minste delvis som et resultat av epitelial-mesenchymale overgang (EMT), en fremgangsmåte vesentlig for embryoutvikling, som induseres i løpet av kreft progresjon og avgjørende for kreft metastasering. Cscs besitter selvfornyelse funksjon i normale stamceller, og tilsvarende signalveier regulere selvfornyelse av cscs og normale stamceller [3]. En slik reaksjonsvei omfatter telomerase revers transkriptase (TERT), det hastighetsbegrensende katalytiske subenhet av telomerase, som er uttrykt i de fleste kreftformer. Nyere bevis tyder på at TERT regulerer stamcelle egenskaper i en telomerlengde uavhengig. For eksempel aktiverer TERT hvilende epidermal stamceller
i
vivo
på en måte uavhengig av den iboende RNA komponent av enzymet telomerase TERC [4]. I tillegg, sammen med bryteren-Sukrose NonFermentable (SWI-SNF) kompleks protein brahma-relatert gen 1 (BRG1), tert fungerer som en transkripsjons modulator av Wnt /β-catenin signalveien, som bidrar til selvfornyelse og spredning under utvikling [5]. Flere nylig, samler bevis indikerer at TERT opererer også i cscs og fremmer EMT og CSC-lignende egenskaper. Nærmere bestemt, overekspresjon av human-tert-(hTERT) resulterer i en forbedret kuledannende evne, øket ekspresjon av EMT /CSC markører, og økt
i
vivo
tumorigenesis forårsaket av hTERT samspill med β- catenin og styrke sin transkripsjonen aktivitet [6]. Omvendt, undertrykkelse av hTERT ekspresjon resulterer i en redusert sfære dannende kapasitet og redusert ekspresjon av CSC markør CD44 [7]. Denne funksjonen av hTERT i markedsføringen av EMT og CSC-lignende egenskaper ser ut til å være uavhengig av sin telomerase aktivitet [6]. Faktisk har vi rapportert at hTERT i et kompleks med BRG1 og nukleolært GTP-bindende protein nucleostemin (NS) (TBN kompleks) deltar i vedlikehold av cscs. Videre fant vi at overekspresjon av TBN komplekse forbedrer tumorigenicity og uttrykk for EMT /CSC markører i en hTERT avhengig måte, men i en telomer-lengden-uavhengig måte [8]. De eksakte telomerase-uavhengige mekanismer som TBN komplekse regulerer cscs forblir unnvikende. En mulig mekanisme er via en RNA-avhengig RNA polymerase (RdRP) aktivitet av hTERT [9]. RdRP induserer RNA interferens gjennom produksjon av dobbel-strandet RNA fra enkelttrådet templat RNA og regulerer montering av heterochromatin og mitotisk progresjon [10]. I likhet med RdRPs i modellorganismer, fant vi at RdRP aktivitetene i TBN komplekset er høy i mitotiske celler, og undertrykkelse av TBN komplekse resultater i mitotisk arrest [11].
For å løse chemoresistance, terapeutiske strategier målretting EMT og cscs blir stadig tiltrekker seg oppmerksomhet. Nylig, fordi eribulinmesylat (eribulin) ble rapportert å hemme metastase ved å reversere EMT [12], spekulerte vi at eribulin kan målrette cscs. Eribulins er en ikke-taxan inhibitor av mikrotubulidynamikk [13], som induserer irreversibel mitotisk blokkering, noe som fører til vedvarende inaktivering av Bcl-2 og etterfølgende apoptose [14]. I USA har eribulin er godkjent for behandling av metastatisk brystkreft etter minst to behandlingsregimer, inkludert et antracyklin og et taxan. Videre er eribulin godkjent for behandling av inoperabel eller tilbakevendende brystkreft i Japan.
I denne studien fant vi at eribulin effektivt hemmet veksten av platina-resistent eggstokkreft celler. Eribulin-sensitive celler viste forbedret CSC-lignende egenskaper og høy hTERT uttrykk. Undertrykkelse av hTERT uttrykk resulterte i redusert følsomhet for eribulin. Videre eribulin hemmet RdRP aktiviteten hTERT
i
vitro
, viser at hTERT er et direkte mål for eribulin.
Resultater
Eribulin hemmer vekst av cisplatin-resistent eggstokkreft adenokarsinom cellelinjer
Fjorten eggstokkene adenokarsinom cellelinjer ble undersøkt for følsomhet for cisplatin [cis-diamminedichloroplatinum (II)], inkludert seks SAC cellelinjer (PEO1, PEO4, PEO14, PEO23, OVKATE, og OVSAHO), seks CCC cellelinjer (RMG-I, ES-2, OVISE, OVMANA, OVTOKO, og TOV21G), og to udifferensierte /uklassifiserte adenocarcinoma cellelinjer (OVCAR-3 og A2780) (tabell S1). Som vist i figur 1A, OVKATE, RMG-I, PEO4, og PEO23 celler var spesielt resistente overfor cisplatin, antagelig via forskjellige mekanismer. OVKATE celler tidligere er blitt rapportert som motstandsdyktig overfor platinaderivater med forhøyet ekspresjon av glutation-S-transferase, et medikament-resistensmarkør [15]. RMG-I-cellene er også resistente overfor cisplatin, som omfatter det ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) pathway [16]. PEO4 og PEO23 celler ble avledet fra de samme pasientene som PEO1 og PEO14 celler, henholdsvis, etter utvikling av kliniske chemoresistance, og er derfor platina resistente [17]. BRCA2 mutasjon er blitt funnet å bidra til platinamotstands i PEO4 celler [18].
Celler ble behandlet med cisplatin eller eribulins i 72 timer, og deretter cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyser. (A) Mean IC
50 verdier for cisplatin (mm). (B) Mean IC
50 verdier for eribulin (nM). Eribulin følsomme (Eribulin S) cellelinjer er vist som åpne barer, og eribulinbehandlede-resistente (Eribulin R) cellelinjer er vist som lukket barer. Feilstolpene representerer SD av minst tre uavhengige eksperimenter.
screenet en serie av kjente anti-cancer forbindelser for veksthemming av platinaresistent kreft ovarie cellelinjer. Vi fant ut at eribulin, en mitotisk inhibitor som undertrykker mikrotubulidynamikk [13], hemmet vekst av RMG-I, PEO23, og PEO4 celler (Figur 1b). Påfallende, eribulin var ikke så effektiv i noen av cisplatin-sensitive cellelinjer som OVTOKO, PEO14, og TOV21G (figur 1A og 1B). For ytterligere karakterisering, vi definert åtte cellelinjer med en IC
50 av 100 nM for eribulin som «eribulin-sensitive» (Eribulin S) og seks cellelinjer med en IC
50 av 100 nM for eribulin som «eribulin fast» (eribulin R).
eribulin-sensitive cellelinjer viser en høyere sfære dannende kapasitet
cscs antas å være ansvarlig for chemoresistance, og cscs er rapportert for å bidra til cisplatin motstand i flere typer kreft [19]. Videre ble det nylig rapportert at eribulin reverserer EMT [12], en fenotype som er sterkt knyttet til cscs. Derfor undersøkte vi om eribulinbehandlede-sensitive celler har en forbedret CSC-lignende fenotype. Fordi en sfære dannende kapasitet er et CSC-lignende karakteristikk, utførte vi kuledannelsesanalyser under serumfrie betingelser, og fant at eribulinbehandlede-sensitive cellelinjer viste høy sfære formasjon effektivitet (figur 2A og 2B). Den sfære dannelsen effektivitet Eribulins S cellelinjer som var betydelig høyere enn for Eribulineksponering R cellelinjer (figur 2C, p = 0,0013), noe som tyder på at eribulinbehandlede-sensitive cellelinjer som har forbedret CSC-lignende egenskaper.
(A ) Sphere formasjon effektivitet (SFE) for hver cellelinje er angitt per 1000 celler. Eribulins S cellelinjer er vist som åpne søyler, og Eribulineksponering R-celler er vist som lukkede barer. Hvert eksperiment ble utført minst tre ganger, og middelverdier ± SD er vist. (B) Morfologi av tumorspheres under serumfrie betingelser. Representative bilder av kuler dannet av A2780, RMG-I, ES-2, OVSAHO, TOV21G, og OVTOKO celler er vist. Scale bar = 50 mikrometer. (C) Den midlere SFE Eribulins S cellelinjer (n = 8) og Eribulineksponering R cellelinjer (n = 6) vist i (A). Feilfelt angir SD. (D) Nivået av BRG1 og NS-protein-ekspresjon ble påvist ved immunblotting. GAPDH uttrykket ble vist som lasting kontroll. (E) Signaler i (D) ble kvantifisert med ImageJ programvare og normalisert til GAPDH signal. De gjennomsnittlige verdier av relativ uttrykk nivå ± SD er angitt.
Siden vi har nylig vist at NS sammen med hTERT og BRG1 opprett cscs [8] og vi og andre har også vist at NS er en nyttig CSC markør [20] – [22], undersøkte vi uttrykket for BRG1 og NS i Eribulineksponering S og Eribulineksponering R-cellelinjer. Protein Ekspresjonsnivået av BRG1 var signifikant høyere i Eribulineksponering S cellelinjer (figur 2D og 2E, p = 0,0189), mens bare en beskjeden tendens til høyere nivå av NS i Eribulineksponering S cellelinjer ble observert (figur 2D og 2E, p = 0,1216). Vi gjorde ikke oppdage en forskjell i uttrykket nivået av CD133 eller CD44 (figur S1), celleoverflatemarkører forstått i noen cscs [23].
eribulin S celler uttrykker høyere nivåer av hTERT protein
Overekspresjon av hTERT resulterer i en forbedret kuledannende evne i magekreftceller [6]. Omvendt, undertrykkelse av hTERT ekspresjon resulterer i en redusert sfære dannende kapasitet i brystkreftceller [7]. Derfor fant vi ut om eggstokkreft celler med en høyere sfære dannende kapasitet uttrykke et høyere nivå av hTERT. Vi har observert en tendens i cellelinjer med høy sfære dannende effektivitet, slik som RMG-I, PEO23, og A2780, for å uttrykke relativt høye nivåer av hTERT-proteinet, mens cellelinjer med lav sfære dannende effektivitet, slik som TOV21G, OVTOKO, og OVMANA, uttrykte lave nivåer av hTERT-proteinet, som demonstrert ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) (Figur 3A). Den høye hTERT uttrykk i RMG-I cellene kan forklares av en gevinst-of-funksjon mutasjon (-124 G A) i hTERT promoter-regionen (tabell S1 og Figur S2). Dette kreft-spesifikke mutasjonen ble nylig rapportert i melanom og flere andre typer kreft [24] – [27], noe som skaper nye bindende motivene for E-tjue seks /trefoldig komplekse faktorer (ETS /TCF) og dermed bidrar til oppregulert hTERT transkripsjon [24], [25].
(A) nivået av hTERT proteinekspresjon ble bestemt ved hjelp av ELISA (angitt som ng /ml). Eribulins S cellelinjer er vist som åpne søyler, og Eribulineksponering R-celler er vist som lukkede barer. Hvert eksperiment ble utført minst tre ganger, og middelverdier ± SD er vist. (B) Den midlere hTERT nivået av Eribulineksponering S cellelinjer (n = 8) og Eribulineksponering R cellelinjer (n = 6) er vist i (A). Feilfelt angir SD.
Vi fant at Eribulin S cellelinjer uttrykte høyere nivåer av hTERT protein enn de i Eribulin R cellelinjer (figur 3B, p = 0,008).
Suppression av hTERT uttrykk resulterer i redusert følsomhet for eribulin
sammenhengen mellom hTERT uttrykk og eribulin følsomhet ledet oss til å postulere at eribulin hemmer veksten av eggstokkreft celler via hemming av hTERT. For å teste denne hypotesen, undersøkte vi om undertrykkelse av hTERT uttrykk i eggstokkreft celler fører til redusert følsomhet for eribulin. To uavhengige hTERT-spesifikk sirnas ble innført i A2780-celler, og følsomhet for eribulins ble sammenlignet med celler som uttrykker kontroll siRNA. Som forventet, celler som uttrykker hTERT sirnas viste redusert følsomhet for eribulins (figur 4A). TERT siRNA1 viste en tendens til sterkere undertrykkelse av hTERT uttrykk enn TERT siRNA2 som demonstrert av ELISA (figur 4B). Dette funnet kan forklare hvorfor celler som uttrykker TERT siRNA1 tendens til å være mindre følsomme for eribulin enn de uttrykker TERT siRNA2 (Figur 4A). Lignende resultater ble oppnådd i ES-2-celler (figur 4C og 4D). Disse resultatene tyder på at hTERT kan være et direkte mål for eribulins.
(A) A2780 celler som uttrykker kontroll siRNA (åpne søyler), TERT siRNA1 (lukkede søyler), eller TERT siRNA2 (skraverte søyler) ble behandlet med eribulin i 72 timer, og deretter cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT-analyser. * P 0,05 vs. celler som uttrykker kontroll siRNA. (B) Nivået av hTERT protein ekspresjon i celler som uttrykker A2780 kontroll siRNA (åpne søyler), TERT siRNA1 (lukkede søyler), eller TERT siRNA2 (skraverte søyler) ble bestemt ved hjelp av ELISA (angitt som ng /ml). (C og D) De forsøk som er beskrevet i (A og B) ble utført på samme måte under anvendelse av ES-2-celler som uttrykker kontroll siRNA (åpne søyler), TERT siRNA1 (lukkede søyler), eller TERT siRNA2 (skraverte søyler). * P. 0,05 vs. celler som uttrykker kontroll siRNA
Eribulin hemmer RdRP aktivitet hTERT
i
vitro
Det er allment antatt at enhver effekt av hTERT undertrykkelse er mediert av telomerer forkortes. Imidlertid, fordi vi observert nedsatt følsomhet for eribulin i en forholdsvis kort periode (figur 4, 96 timer etter transfeksjon av siRNA mot hTERT), spekulert vi at denne effekten er uavhengig av den telomere vedlikehold funksjon av hTERT. Videre er funksjonen til hTERT i markedsføringen av EMT og CSC-lignende egenskaper uavhengig av dens telomeraseaktivitet [6]. Sammen med vår siste rapport som viser at hTERT har en RdRP aktivitet uavhengig av telomerer vedlikehold [9], undersøkte vi om eribulin rettet hTERT-RdRP aktivitet direkte. Vi overvåkes hemmende effekt av eribulin på hTERT-RdRP aktivitet ved hjelp av
i
vitro
RdRP analyse [11], og funnet ut at eribulin hemmet hTERT-RdRP aktivitet
i
vitro
ved en konsentrasjon på 50 uM (figur 5A). Den samme konsentrasjon av eribulins hemmet ikke telomeraseaktivitet av hTERT som vist ved telomeric gjenta amplifikasjonsprotokoll (TRAP) analyse (figur 5B). Disse resultater antyder at effekten av Eribulins for hTERT ikke formidles via telomeraseaktivitet, men via RdRP aktivitet. Interessant, gjorde en annen mitotisk inhibitor, paclitaxel, en representant taxan, ikke hemme RdRP aktivitet (figur 5C), noe som tyder på at eribulin har en spesifikk hemmende effekt på hTERT-RdRP aktivitet.
(A) RdRP aktivitet hTERT immun komplekser fremstilt fra HeLa-celler som ble arrestert i den mitotiske fasen ble analysert uten eller med 10 og 50 mikrometer eribulin. (B) Telomerase aktivitet i HeLa celleekstrakter ble analysert uten eller med 10 og 50 uM eribulins. (C) RdRP aktivitet hTERT immunkomplekser ble analysert uten eller med 10 og 100 mikrometer paclitaxel (PTX).
Diskusjoner
Blant gynekologisk kreft, er den ledende årsak til kreft i eggstokkene død. Spesielt har motstand mot konvensjonell platina-basert kjemoterapi har vært en barriere i forbedring av prognosene for eggstokkreft kreftpasienter, og nye terapeutiske strategier er presserende behov. Her fant vi at eribulin var effektive til å hemme veksten av platina-resistent eggstokkreft celler. Effekter av Eribulins var korrelert med hTERT ekspresjonsnivåer (figur 3), og undertrykkelse av hTERT ekspresjon resulterte i redusert følsomhet overfor eribulins (figur 4), noe som tyder på at hTERT kan være et mål eribulins i disse cellene. Faktisk eribulin hemmet RdRP aktivitet, men ikke omvendt transkriptase aktivitet hTERT
i
vitro
(figur 5).
cscs og hTERT
cscs antas å være involvert i chemoresistance, og flere veier har blitt funnet å bidra til å fremme eller vedlikehold av cscs. Vi og andre har vist at hTERT spiller en viktig rolle i å fremme og vedlikehold av cscs i telomere vedlikehold uavhengig oppførsel [6] – [8]. Eribulins effektivt hemmet veksten av platina-resistente celler (figur 1). Eribulin-sensitive celler viste høyere hTERT uttrykk (figur 3) og en høyere sfære dannende kapasitet (figur 2), noe som tyder på at disse cellene har forbedret CSC-lignende egenskaper, muligens på grunn av den høye nivåer av hTERT protein. Konsekvent, eribulinbehandlede-sensitive celler viste høyere BRG1 uttrykk (figur 2), en annen del av TBN kompleks som opprettholder cscs. Vi gjorde ikke oppdage en betydelig forskjell i uttrykket av CD133 eller CD44 (figur S1). Selv CD133 og CD44 er tenkt å være en indikasjon på cscs i enkelte typer kreft, er det fortsatt ikke klarlagt hva som markører som er aktuelle for cscs i eggstokkreft [23].
Fordi telomere vedlikehold av telomerase er uunnværlig for uendelig spredning av ondartede celler, har man forsøkt å utvikle kreftbehandling rettet mot telomerase. Nyere studier indikerer at TERT spiller funksjonelle roller utover telomere vedlikehold. Faktisk, til funksjonen av TERT aktivere normale hvilende stamceller eller CSC-lignende egenskaper har vist seg å være uavhengig av dens telomeraseaktivitet [4], [6], [28]. Vi har også funnet at den TBN-komplekset opprettholder cscs i et telomerlengde-uavhengig måte [8]. Det er mulig at dette telomerase-uavhengig mekanisme er formidlet ved RdRP aktivitet av TERT, fordi TBN komplekset selv er ansvarlig for RdRP aktivitet og er involvert i heterochromatin regulering og mitotisk progresjon [11]. Vi spekulerer i at RdRP aktivitet hTERT er involvert i genuttrykk gjennom heterochromatin regulering i kreftceller, og det kan være en roman kreft terapeutisk mål. Enten RdRP aktivitet er en forutsetning for hTERT funksjon i markedsføringen av cscs gjenstår å fastslå.
Eribulin og hTERT
Eribulin binder seg til microtubule pluss ender og hemmer vekstfasen av mikrotubulidynamikk [29] . Nylig, eribulingruppen ble vist å reversere EMT ved downregulating transformerende vekstfaktor-β (TGF-β) -indusert Smad fosforylering [12]. Smad proteiner som binder seg til mikrotubuli i fravær av TGF-β og TGF-β utløser dissosiasjon fra mikrotubuli og fosforylering av proteiner Smad [30]. Yoshida
et al.
Spekulert i at eribulin hemmer Smad fosforylering muligens ved å undertrykke Smad dissosiasjon fra mikrotubuli [12]. Fordi vi har nylig vist at hTERT lokaliserer til mitosetråder og sentromerer under mitose [11], er det også mulig at eribulin hemmer hTERT funksjoner ved å forstyrre samspillet mellom hTERT og mikrotubuli. Eribulin bedrer total overlevelse av pasienter med metastatisk brystkreft, som hadde tidligere anthracycline- og taxan-basert kjemoterapi [31]. En taxan narkotika, paclitaxel, ikke hemme RdRP aktiviteten hTERT (figur 5C), gir en av de potensielle molekylære grunnlaget for de ulike kliniske utfall av taxaner og eribulin. Den eksakte mekanismen som eribulin hemmer hTERT funksjonen er ennå ikke forstått.
hTERT som en biomarkør
Det er viktig å identifisere biomarkører for å forutsi respons på anticancer behandling. Ved fastsettelse av hTERT nivåer i kliniske prøver, kan pasienter som er sannsynlig å svare godt på eribulin bli identifisert før de mottar kjemoterapi. Spesielt ville en ELISA kunne måle hTERT nivåer i klinisk praksis.
I sammendraget, fant vi at eribulin hemmer RdRP aktivitet hTERT, noe som kan bidra til å chemoresistance i eggstokkreft ved å opprettholde cscs. Eribulins hemmet veksten av eggstokkreft celler med høy hTERT ekspresjon og sterk platina motstand, noe som tyder det kan være et lovende terapeutisk middel for kjemoresistent eggstokkreft. Videre kan hTERT være en nyttig biomarkør for å forutsi klinisk respons på eribulin.
Materialer og metoder
Cellelinjer
RMG-I [32], OVMANA [33], OVTOKO [34], OVISE [34], OVSAHO [33], og OVKATE [33] celler ble hentet fra den japanske Innsamling av forsknings Bioressurser Cell Bank. OVCAR-3 celler [35] ble oppnådd fra Riken Bioresource Center. PEO1, PEO4, PEO14, PEO23 [17], og A2780 [36] celler ble kjøpt fra den europeiske Innsamling av cellekulturer, og TOV21G [37] og ES-2 [38] celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection. RMG-I-celler ble dyrket i Hams F12-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, ES-2-celler i McCoys 5a-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, TOV21G celler i MCDB105 /Medium 199 (01:01) supplert med 10% føtalt bovint serum, og HeLa-cellene i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum. Alle andre cellelinjer (A2780, OVCAR-3, OVMANA, OVTOKO, OVISE, OVSAHO, OVKATE, PEO1, PEO4, PEO14, og PEO23) ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1 mM natriumpyruvat ( Gibco, Grand Island, NY, USA).
Forbindelser
Cisplatin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA), paclitaxel ble kjøpt fra Wako (Osaka, Japan), og eribulin (HALAVEN) ble kjøpt fra Eisai Co., Ltd (Tsukuba, Japan).
MTT analyse
Cells (5000-10000 per brønn) ble sådd i 96-brønners plater og deretter behandlet med cisplatin eller eribulin etter 24 timer. På 72 timer med behandling, ble en MTT spredning analysen (Cell Proliferation Kit jeg MTT, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) utført i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble 10 pl MTT merking reagens tilsatt til hver brønn, etterfulgt av 4 timers inkubering. Deretter ble 100 ul solubilisering løsning tilsatt til hver brønn, fulgt av inkubering over natten. Reaksjonsproduktet ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 570 og 690 nm ved anvendelse av en mikroplateleser (Viento 808, BioTek, Winooski, VT, USA). Celleviabilitet ble bestemt av sammenligninger med ubehandlede celler.
Sphere-analysen
Enkeltceller ble sådd i 96-brønners ultra lave festeplater (Corning Inc, Corning, NY, USA) på 100- 1000 celler /100 ul medium i hver brønn. Celler ble dyrket i serumfritt DMEM /F12-medium (Gibco) supplementert med 20 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (Wako), 20 ng /ml epidermal vekstfaktor (Wako), og B27 supplement (Gibco). Kulturer ble supplert med 25 mL friskt medium hver 3-4 dager, og antallet sfærer ble tellet på dag 7 og 14. mikroskopiske bilder ble oppnådd med en CKX41 invertert mikroskop og DP21 digitalt kamera (Olympus, Tokyo, Japan).
Immunoblotting
Cellene ble lysert i radioimmunopresipitasjonsanalyse assay (RIPA) buffer inneholdende 1% NP-40, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) og 150 mM NaCl. Etter ultralydbehandling og sentrifugering av lysatene, ble proteiner (20 ug) underkastet SDS-PAGE i 7,5% poly-akrylamid-geler, etterfulgt av immunblotanalyse. Følgende antistoffer ble brukt: anti-BRG1 (en gave fra Dr. Tsutomu Ohta, National Cancer Center, Japan), anti-NS (A300-600A; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA), anti-GAPDH (3H12 medisin Biological Laboratories (MBL), Nagoya, Japan), anti-CD133 (W6B3C1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) og anti-CD44 (2C5, R D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA). Signaler ble oppdaget av LAS-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan), kvantifisert med ImageJ programvare (National Institutes of Health, USA) og normalisert ved hjelp GAPDH lasting kontroll.
hTERT ELISA
hTERT ELISA anvendt et kanin-anti-hTERT polyklonalt antistoff som fangst-antistoff (MBL), og et muse anti-hTERT monoklonalt antistoff (mAb) (klon 2E4-5) som påvisningsantistoff (MBL kode nr. 5340, Ab-Match Assembly Humant TERT Kit). Den 2E4-5 antistoff ble generert mot rekombinant hTERT som et immunogen som tidligere beskrevet [11]. Celler ble lysert i RIPA buffer. Etter ultralydbehandling og sentrifugering av lysatene, ble 100 ug totalt protein (100 ul i volum) tilsatt til hver brønn av en 96-brønns plate (MBL kode nr. 5310, Ab-match Universal Kit). ELISA ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Absorbansen ved 450 og 630 nm ble målt med en mikroplateleser. Hvert eksperiment ble utført minst tre ganger, og gjennomsnittsverdier ble beregnet.
TERT arrangøren mutasjonsanalyse
Genomisk DNA ble ekstrahert fra eggstokkreft cellelinjer ved hjelp av en blod og cellekultur DNA Kit (Qiagen , Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll.
TERT
promoter region (-146 til -124 bp oppstrøms fra startkodonet) ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av KOD FX (Toyobo, Osaka, Japan) og de følgende primere: 5′-GTCCTGCCCCTTCACCTT-3 « og 5»-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3 «[25]. PCR ble utført under følgende betingelser: 40 sykluser med 98 ° C i 10 s, 55 ° C i 30 s, og 68 ° C i 60 sek. Rensede PCR produktene ble sekvensert ved hjelp av Sanger-sekvensering.
Transfeksjon av siRNA
Celler ble transfektert med siRNA av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) og deretter sådd ut ved 5000-10000 celler per brønn i 96-brønners plater . Ved 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med eribulins, og en MTT-analysen ble utført etter 72 timers behandling. For ELISA, 2 til 5,0 x 10
6-celler transfektert med siRNA ble sådd ut i en 10 cm petriskål, og deretter samlet opp etter 48 timers inkubering. hTERT siRNA1 og hTERT siRNA2 har blitt beskrevet tidligere [8]. Den negative kontroll siRNA (MISSION siRNA Universal negativ kontroll, Sigma-Aldrich) ble også brukt
IP-RdRP analysen
For å oppdage RdRP aktivitet
i
vitro
ble hTERT immunkompleks isolert av mAb mot hTERT. En IP-RdRP analysen har vært etablert i mitotisk arrestert HeLa-celler [11]. Derfor ble HeLa-celler anvendt for denne analysen. Å synkronisere HeLa-celler som gjennomgår mitose, ble cellene dyrket i medium inneholdende 2,5 mM tymidin (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) i 24 timer. Etter 6 timer etter frigivelse, ble cellene inkubert i medium inneholdende 0,1 ug /ml nocodazol (Sigma-Aldrich) i 14 timer. Etter forsiktig risting ble mitotiske celler hentet. IP-RdRP assay ble utført som beskrevet tidligere [11].
TRAP assay
A TRAP-analyse ble benyttet for å detektere telomere spesifikk revers transkriptase aktivitet som tidligere beskrevet [39].
Statistisk analyse
Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Den t-test eller Mann Whitney test ble brukt. Tosidige p-verdier på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1..
CD133 og CD44 uttrykk i Eribulin S og Eribulin R eggstokkreft kreftceller. (A) Nivået av CD133 og CD44-protein-ekspresjon ble påvist ved immunblotting. Da dataene ble oppnådd på samme eksperiment som figur 2 panel D, GAPDH-gel var identisk med figur 2 panel Signaler D. (B) i (A) ble kvantifisert med ImageJ programvare og normalisert til GAPDH signal. De gjennomsnittlige verdier av relativ uttrykk nivå ± SD er angitt
doi:. 10,1371 /journal.pone.0112438.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
ES-2 og RMG-I celler besitter hTERT promoter mutasjoner. Den hTERT promoter ble sekvensert i hver cellelinje. ES-2 celler havn en -138 /-139 GG AA-mutasjonen som beskrevet tidligere [27], og RMG-I celler havn en -124 G En mutasjon. De villtype sekvenser av de tilsvarende områder fra OVKATE og OVSAHO celler er vist som kontroller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0112438.s002 plakater (TIF)
Tabell S1.
eggstokkreft cellelinjer brukt i denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0112438.s003 plakater (docx)
Takk
Vi takker Dr. Tsutomu Ohta for gaven av anti-BRG1 antistoff, Dr. Koichi Ichimura for teknisk assistanse med arrangøren mutasjon analyse, og MBL for deres hjelp i å etablere ELISA kit for hTERT deteksjon.