Abstract
microRNAs (mirnas) er små molekyler som regulerer genuttrykk posttranscriptionally. I en tidligere studie identifiserte vi MIR-96 blir oppregulert ved prostatakreft prøver i forhold til normal tilstøtende vev og å være en uavhengig markør for biokjemisk tilbakefall i en multivariat prediksjon modell. Derfor undersøkte vi den funksjonelle rollen MIR-96 i prostata kreftutvikling. LNCaP og DU145 prostata kreft celler ble transient transfektert med MIR-96 forløpere og fenotypiske endringer ble analysert. Mir-96 økt spredning og svekket apoptose indusert av camptothecine i disse cellene. I silico mål prediksjon analyse identifisert FOXO1 som potensielle pro-apoptotiske MIR-96 mål. MIR-96 var i stand til å binde til begge bindinger områder i den FOXO1 3 «UTR i et luciferase reporter-gen assay. Overekspresjon av MIR-96 i LNCaP celler resulterte i en redusert FOXO1 uttrykk. Overekspresjon av FOXO1 induserte en sterk apoptotisk fenotype som delvis ble reddet av koekspresjon av MIR-96. RT-qPCR og immunhistokjemi av 69 prostatakreft prøver avdekket en nedregulering av FOXO1 og en invers korrelasjon mellom MIR-96 og FOXO1 protein uttrykk. I konklusjonen, viser vi at Mir-96 kan regulere apoptose i prostata kreft, ved å hemme FOXO1 transkripsjonsfaktor
Citation. Fendler A, Jung M, Stephan C, Erbersdobler A, Jung K, Yousef GM (2013 ) Den Antiapoptotic Funksjon MIR-96 i Prostate Cancer etter Hemming av FOXO1. PLoS ONE 8 (11): e80807. doi: 10,1371 /journal.pone.0080807
Redaktør: Kin Mang Lau, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 21 januar 2013; Godkjent: 16 oktober 2013; Publisert: 19.11.2013
Copyright: © 2013 Fendler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet AF med KJ ble finansiert av Stiftelsen for urologiske Research, Berlin og Sonnenfeld Stiftung, Berlin. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er en ny klasse av små ikke-kodende RNA og regulere genekspresjon posttranscriptionally gjennom hemming av translasjon, men også gjennom nedbrytning av de tilsvarende mRNA. Omtrent 30% av alle mRNA er spådd til å bli målrettet av mirnas [1]. Avhengig av sine mål, mirnas funksjon som tumorsupressors eller onkogener ved å styre hovedveiene for karsinogenese, inkludert celle proliferasjon, apoptose og celle motilitet [2].
Prostatakreft (PCA) er den vanligste ondartet kreft hos menn og den nest største årsaken til kreft i den vestlige verden [3]. Mekanismer av PCa tumorigenesis er fortsatt ikke fullstendig klarlagt, og det er en mangel på diagnostiske og prognostiske markører.
Dereguleringen av miRNAs i PCA har blitt bevist av en rekke studier [4-9]. Deres uttrykk korrelerer med tumorstadium og aggressivitet [10]. Vi har tidligere identifisert MIR-96 i et sett med deregulerte mirnas ved PCA. Dens uttrykk er korrelert med Gleason score og det er en uavhengig markør for biokjemisk tilbakefall [6].
I silico mål prediksjon ved hjelp miRecords identifisert FOXO1 blant annet som en antatt mål av MIR-96. FOXO1 er medlem av gaffelhode box transkripsjonsfaktorer. Det utøver sin tumorsuppressive funksjon via regulere transkripsjon av viktige regulatorer av cellesyklus og apoptose [11,12]. FOXO1 transkripsjonen aktivitet reguleres via PI3K /AKT vei [13]. I bryst og livmorkreft, samt Hodgkin lymfomer FOXO1 har tidligere vist seg å være regulert av MIR-96 [14-16].
Vi antok at Mir-96 kan også ha en onkogen funksjon ved PCA. For å bevise denne antakelsen, vi (a) har studert innvirkningen av MIR-96 ekspresjon på fundamentale egenskaper som cellulære proliferasjon, apoptose og migrering på PCA-cellelinjer, (b) utføres i silico target forutsigelse, (c) studerte binding av speil 96 til anslåtte bindingssteder i FOXO1 3 «UTR og påfølgende endringer på mRNA og protein nivå, (d) studerte redning av FOXO1-indusert apoptose av MIR-96 og (e) korrelert MIR-96 uttrykk med FOXO1 transkripsjon og protein uttrykk i menneskelig PCa og matchet normal tilstøtende vev. Vi viser at MIR-96 inhiberer camptothecin-indusert apoptose og regulerer FOXO1 ekspresjon ved binding til det 3»-UTR. I PCA prøver, identifiserte vi en negativ korrelasjon på FOXO1 protein nivåer og MIR-96 uttrykk.
Materialer og metoder
Vev og cellelinjer
Koblede normale og maligne vevsprøver av 69 PCA pasienter ble samlet etter radikal prostatektomi mellom 2001 og 2005 ved Charité universitetssykehus. For hver pasient klinisk-patologiske data ble samlet (tabell 1). Studien kalles «microRNAs som diagnostiske og prognostiske signaturer i urologiske tumorer» (EA1 /153/07) ble godkjent av den etiske styret i Charite universitetssykehus og skriftlig informert samtykke er innhentet.
Bilder Pasienter for RT-qPCR (N = 69)
Pasienter for TMA analyse (N = 64)
N (%)
N (%)
alder, år Median6363Range50-7246-74Pre operativ PSA
a, ng /mlMedian7.076.24Range1.71-41.92.00-26.0T scenen
apT2a2 (3) 1 (2) pT2b11 (16) 3 (5) pT2c30 (43) 39 (61) pT3a20 (29) 18 (28) pT3b6 (9) 3 (5) N stadium
apN0 /pNx67 (97) pN12 (3) M trinnet
aM0 /Mx69 (100) M10 (0) Kirurgisk marginsR041 (60) R127 (39) Rx1 (1) Gleason score53 (4) 1 (2) 620 (29) 24 (37) 728 (41 ) 27 (42) 811 (16) 8 (12) 97 (10) 3 (5) 100 (0) 1 (2) Oppfølging, monthMedian50.0035.63Range1-930-86Biochemical tilbakefall
a10 ( 15) 12 (19) Tabell 1. Kreft egenskaper og klinisk-patologiske data fra pasient kohorter.
aBiochemical tilbakefall ble definert som den første postoperative PSA større enn 0,1 ng /ml, noe som bekreftes av minst en påfølgende økt verdi ( vedvarende PSA økning) etter å ha oppnådd målbart PSA postoperativt, definert som en deteksjonsgrense på mindre enn 0,04 ng /ml.RT-qPCR, sanntids kvantitativ PCR, TMA, vev microarray, PSA, prostataspesifikt antigen, T stadium, tumorstadium, N trinn, lymfeknutemetastaser stadium, M stadium, metastaser stadium. CSV Last ned CSV
Vev ble hurtig frosset rett etter operasjonen, og prøvene som tidligere beskrevet [6]. Kort fortalt, ble deler av svulsten og normalt vev identifisert av haematoxilin-eosin farging av en patolog og punch-biopsied med en vev-micro array nål. Bare kjerner med minst 90% tumor innhold ble vurdert for videre analyse.
LNCaP, DU-145, PC3 og 22rv-1 celler ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA,) supplement med 10% føtalt kalveserum og penicillin /streptomycin. Celler ble dyrket i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO2-atmosfære. BPH-1-celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 20% føtalt kalveserum, 20 ng /ml DHT, 5 ug /ml transferrin, 5 ng /mL natriumselenitt og 5 ng /mL insulin. Cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) eller den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ). Cellelinjer jevnlig overvåkes for mycoplasmic forurensning av RT-qPCR ifølge van Kuppeveld et al [17]. I tillegg ble identiteten til prostata kreft celler verifisert av det tyske Prostate Cancer Consortium.
Tissue microarray
Formalin fiksert, parafin-embedded vev av 64 pasienter ble brukt til bygging av en vev microarray som tidligere beskrevet [18]. Haematoxilin-eosin farging ble utført for å identifisere ondartede og godartede områder. Områder av interesse ble punch-biopsied med en 1,5 mm vev microarray nål og overføres til mottakeren blokken. Hver tumor ble representert av en kjerne. Normalt vev fra tykktarm, bukspyttkjertel, nyre og 2 prostata og bindevev ble brukt som kontroll.
RNA isolering
Total RNA fra Dypfryst vev og cellekulturer ble isolert ved hjelp av miRNeasy MINIKIT (Qiagen , Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere i detalj [6].
for ekstraksjon av total RNA fra cellekulturen ble cellene sådd ut i 6-brønns plater i en sluttkonsentrasjon på 3 x 10
5-celler per brønn, og ble transfektert som beskrevet nedenfor. Etter 24 timer, 1 x 10
6 celler ble høstet i Qiazol (Qiagen).
RNA yield og A260 /280-forholdet ble overvåket med en Nano Drop ND-100 spektrometer (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) og RNA Integrity Numbers (RIN) ble vurdert med en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara , CA). Bare RNA prøver med RIN 6 ble inkludert i analysene.
Sanntids kvantitative PCR
mRNA nivåer ble analysert ved RT-qPCR. RNA fra celler som ble revers transkribert ved hjelp av revers transkriptase og Omniscript Oligo-dT primere (Qiagen) ifølge produsentens anbefalinger. Reaksjoner ble utført i et totalt volum på 20 pl ved bruk av 1 ug total RNA. Reaksjoner ble inkubert med en Trinn en termosykler (Applied Biosystems, Foster City, California). Kvantifisering av FOXO1 fra cellelinjer ble utført ved bruk av 2 x Fast SYBRgreen MasterMix (Applied Biosystems) under anvendelse av 1 ul cDNA i 20 pl totalt volum. Primer sekvenser er listet opp i tabell S1. Primere ble utformet for å produsere et fragment som spenner over minst ett intron. Spesifisitet forsterkning ble sikret av primer sprengning og smeltekurve analyser.
mRNA fra vevsprøver var revers transkribert ved hjelp av Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Mannheim, Tyskland) fra en mikrogram RNA i 20 pl totalt volum . Kvantifisering av FOXO1 ble utført ved hjelp UPL probe # 11 (Roche) og Universal sonder Master Mastermix (Roche) i 10 pl totalt volum.
mirnas ble oppdaget av RT-qPCR med TaqMan miRNA analysen som tidligere beskrevet [6 ].
Alle prøver ble kjørt i triplikat og middelverdien og SD ble beregnet. FOXO1 uttrykk ble normalisert til TUBA1B [19], mens MIR-96 ble normalisert til Mir-130b [6]. Standardkurver ble målt for hvert gen for å korrigere for effektivitet (FOXO1: E = 1,95; TUBA1B: E = 1,96; MIR-96: E = 1,83; MIR-130b: E = 1,83). Normalisering ble utført som tidligere beskrevet [6].
Bygging av luciferase vektorer
Target gen 3 «UTR sekvenser ble klonet inn i pMiR rapport vektor (Ambion Austin TX, USA). Målsekvenser av FOXO1 3 «UTR ble amplifisert fra BPH1 cDNA ved anvendelse av AmpliTaq Gold-DNA-polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) og genspesifikke primere (tabell S1), klonet inn i pCR 2.1-TOPO vektor (Invitrogen) og amplifisert i TOP10 kjemisk kompetente celler (Invitrogen). Plasmid DNA fra positive kloner ble ekstrahert med QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) og sendt til sekvensering ved hjelp av M13 uni (-21) og M13 rev (-29) primere (Eurofins MWG GmbH, Ebersberg, Tyskland). Restriksjons digestions positive pCR2.1 vektorer og pMiR rapport vektorer ble utført med SacI og Spel (New England Biolabs, Ipswich, MA). Begrensede innstikk og pMiR rapport vektor ble ligert bruker en U T4 DNA-Ligase (Invitrogen) og forsterkes i kjemisk kompetente DH5a celler (Invitrogen). Positive kloner ble identifisert ved koloni-PCR. Plasmid DNA ble isolert ved hjelp av QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
Transfeksjon av PCA cellelinjer med pre-mirnas, miRNA-hemmere og plasmid DNA
LNCaP og DU145 cellene ble transfektert med pre- miRNA forløpere, anti-miRNA hemmere eller pre-MIR-NC # 1 (Applied Biosystems) i en sluttkonsentrasjon på 10 nM eller 500 ng FOXO1 full lengde klon (Origene, Rockville MD, USA) under anvendelse av SIPORT NeoFX transfeksjon middel (Applied Biosystems) . For hver analyse ble en ikke transfeksjon kontroll som utføres langs. For luciferasereportergenet assays celler ble også transfektert med 500 ng pMiR rapport vektor og β-galaktosidase kontrollvektor.
luciferasereportergenet analysen
LNCaP-celler ble dyrket til 80% konfluens og sådd ut i seks -vel plater ved en endelig tetthet på 2 x 10
5 celler per brønn. Førti-åtte timer etter transfeksjon cellene ble løsnet med en skrape og total protein ble ekstrahert i 80 mL lysis buffer (Applied Biosystems). Luciferase og β-galaktosidase-aktivitet i ekstraktene ble påvist ved anvendelse av dobbel-Lys Kombinert reportergen Assay System (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. Luciferase-ekspresjon ble normalisert til p-galaktosidase-ekspresjon. Hver reaksjon ble utført i duplikat, og resultatene er vist som gjennomsnitt av tre uavhengige analysene.
Western Blot
For ekstraksjon av total protein fra cellekulturen ble cellene sådd ut i 6-brønns plater i en endelig konsentrasjon på 3 x 10
5-celler per brønn, og ble transfektert som beskrevet ovenfor. Protein ble ekstrahert etter 72 timer i 100 ul NENT buffer (20 mM TRIS-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2% NP40, 0,2% SDS, pH 7,5) eller i RIPA-buffer (150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5 % natriumdeoksycholat, 0,1% SDS, 50 mM tris-base, 100 mM PMSF, 1 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml soyabønnetrypsininhibitor, 2 mM EDTA). Totalt protein ble løst i 10% SDS-PAGE-geler og overført til en 0,45 um polyvinyldifluoride membran. Den membran ble blokkert med 2% skummet melk og analysert med følgende antistoffer: kanin anti-FOXO1 pAb, mus anti-ACTB mAb (Sigma Aldrich, München, Tyskland), kanin anti-Akt pAb, kanin anti-Pakt Pab (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA) og geit anti-kanin HRP-konjugert kanin eller anti-mus, HRP-konjugert sekundært Ab (DAKO, Hamburg, Tyskland). Membraner ble farget med ECL (Pierce, Bonn, Tyskland) eller avansert ECL-løsning (GE Healthcare, München, Tyskland) i 5 min og utviklet på Fluor-S multiimager (BioRad, München, Tyskland). For å bestemme relative proteinkonsentrasjonen, ble bandet intensitet beregnet med ImageJ 1.43r (https://rsb.info.nih.gov/ij) og normalisert til p-aktin.
spredningsanalyse og analyse av cellesyklus
spredning av pre-MIR-96 transfekterte LNCaP-celler ble bestemt ved metabolsk omdannelse av 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) (Sigma Aldrich). Celler ble dyrket til 80% konfluens og sådd ut i 96-brønners plater ved en sluttkonsentrasjon på 6 x 10
3-celler per brønn og transfektert som beskrevet ovenfor. Celler ble tillatt å hvile i 24 timer og ble deretter serum-sultet. Kulturer ble inkubert i 5 mg /ml MTT i 4 timer og lysert i 10% SDS i 0,01 M HCl. Lysater ble inkubert ved 37 ° C over natten og absorbans av formazan ble målt ved 550 nm. Hver reaksjon ble utført i tre paralleller og resultatene er vist som gjennomsnitt av tre uavhengige analyser. For cellesyklusanalyse-celler ble dyrket til 80% konfluens og sådd ut i 6-brønns plater ved en sluttkonsentrasjon på 1,5 x 10
5 celler per brønn og transfektert som beskrevet ovenfor. Celler ble tillatt å hvile i 24 timer og ble deretter serum-sultet i 24 timer. Celler ble farget med 20 ug /ml propidiumjodid supplementert med 200 ug /ml RNase i 0,1% Triton X-100 og analysert ved anvendelse av FacsScan strømningscytometer og Cellquest-programvare (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada). Hver prøve ble målt i duplikat, og resultatene er presentert som gjennomsnitt av tre uavhengige analyser.
sårhelende analysen
For å asses migrative phenotyp av DU-145 celler på MIR-96 transfeksjon vi utført en sårhelende analysen. Celler ble dyrket til 80% konfluens, sådd ut i 6-brønns plater og transfektert som beskrevet ovenfor. Celler ble tillatt å vokse til konfluens og monolaget ble oppskrapt med en 100 ul pipettespiss. Remigration av celler til såret ble bedømt ved liv celle bildebehandling i 24 timer under serum sult. Andel åpent område ble målt med programvaren TScratch programvare [20] ved definerte tidspunkter (0,5,10,15,20 h). Alle verdier ble normalisert til prosentandelen av åpent areal ved 0 timer. To tilfeldig utvalgte områder av hver skrape ble analysert. Data er representert som gjennomsnittet av tre uavhengige analysene.
Apoptose assay
LNCaP og DU145-celler ble dyrket til 80% konfluens og sådd ut i 6-brønns plater ved en sluttkonsentrasjon på 2 x 10
5 celler per brønn og transfektert som beskrevet ovenfor. Apoptose ble indusert med 10 uM camptothecin (CPT) (Sigma Aldrich) i serumfritt medium i 24 timer. Cellene ble farget med Annexin V-FITC (Invitrogen) og propidiumjodid (PI) (Invitrogen) Kulturer ble analysert ved hjelp av FacsScan strømningscytometer og Cellquest programvare (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada). Hver prøve ble målt i duplikat, og resultatene er presentert som gjennomsnitt av tre uavhengige analyser.
Immunohistochemistry
Immunohistokjemi ble utført på 2 mikrometer lysbilder av vevet microarray som beskrevet tidligere [21]. I korte trekk, ble vev deparaffinized i xylol og antigener ble demasked i en pressur komfyr. Slides ble analysert med kanin anti-FOXO1 mAb (cellesignalisering Technologies), biotinylert linker-Ab og streptavidin-konjugert sekundært Ab (DAKO) og farget med Fast Red til ønsket intensitet. Kjerner ble kontra med haemalaun. Lysbilder ble dekket ved hjelp Aquatex montering medium (Merck KGH, Darmstadt, Tyskland). Farging av FOXO1 ble analysert i tumor kjertler og normal tilstøtende vev for hver pasient hvis det er aktuelt. Siden generelle farging for FOXO1 var bare svak, det ble scoret som finnes (1) eller fraværende (0) bare.
I silico målet forskning
I silico mål søk etter Mir-96 mål var utføres ved hjelp miRecords (https://mirecords.biolead.org/). Vi brukte kriteriet at en antatt mål måtte bli oppdaget av TargetScan, Miranda, PicTar og to andre prediksjon algoritmer. Plassering av MIR-96 bindingsseter i tre «UTR av FOXO1 ble analysert ved hjelp av TargetScan 5.1.
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism versjon 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA), MedCalc versjon 10.3.2 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgia) eller SPSS 19,0 (IBM, Somers, New York). T-test, enveis eller toveis ANOVA, Kolmogorov-Smirnof normalitet test, signert Wilcoxon rank test, McNemar test, Kaplan-Meier analyse og Cox proporsjonal hazard regresjon ble utført. Alle testene ble utført tosidig og P-verdier. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
Funksjonell karakterisering av MIR-96
Vi har tidligere rapportert at speil 96 er oppregulert og spår biokjemisk tilbakefall i prostatakreft annonse derfor en hypotese om en onkogen funksjon av MIR-96 i prostata. Jo høyere uttrykk for MIR-96 uttrykk i prostatakreftcellelinjer i forhold til benign prostata cellelinje BPH-en (figur S1 A) videre spiss til en onkogen funksjon. Å etablere en funksjonell rolle MIR-96, ble LNCaP og DU145 cellene transfektert med syntetisk Mir-96 forløper molekyler eller antisense-hemmer. Først vurderte vi rollen som MIR-96 på celleproliferasjon. LNCaP og DU145-celler transfektert med MIR-96 viste en høyere formeringshastigheten i forhold til transfeksjon kontrollene (figur 1A + B). Denne pro-proliferativ effekt ble delvis reversert ved kotransfeksjon med sin antisense-hemmer.
LNCaP og DU145 cellene ble transfektert med 10 nM pre-MIR-96, anti-MIR-96, pre-MIR-NC # 1 eller kombinasjonen av pre-MIR-96 og anti-MIR-96. Effekten i (A) LNCaP og (B) DU145 på celleformering i henhold til serum sult ble målt ved MTT-analyse i løpet av tre dager. Alle data ble normalisert på proliferasjon av kontrollkulturene på dag 1, og er vist som gjennomsnitt (± SD) av tre uavhengige analyser. * P 0,05, Toveis ANOVA. Cellecyklus overgang ble målt ved PI farging i transfekterte (C) LNCaP og (D) DU145-celler. Celler ble serumsultede en dag etter transfeksjon i ytterligere 24 timer og deretter fiksert og farget. Svart, G1-fase; lys grå, S-fase; mørk grå, G2 /M-fase. Data er vist som gjennomsnitt av tre uavhengige analyser. Apoptose i CPT-behandlede (E) LNCaP og (F) DU145-celler. 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 10 uM CPT i 24 timer. Cellene ble farget med Annexin V-FITC og PI. Brøkdel av tidlig (svarte striper) og sen (hvite søyler) apoptotiske celler ble målt ved flowcytometri. Data er vist som gjennomsnitt (+ SD) av tre uavhengige analyser. * P 0,05; Bonferroni post-test (P 0,001, Toveis ANOVA).
Neste, vi tok opp spørsmålet om denne forbedrede spredning kan skyldes en frigjøring av cellesykluskontroll eller redusert apoptose. For å bestemme virkningen av MIR-96 på cellesyklusregulering, antall LNCaP og DU145-celler i G1, S og G2 /M fase ble bestemt ved strømningscytometri ved transfeksjon med MIR-96 i serum-sultet celler. Flertallet av LNCaP-celler var i G1 henhold serum sult (71,0 til 76,7%) og mindre fraksjoner var i S-fase (4.8 5,3%) eller i G2 /M (18,6 til 23,7%, figur 1C). Det var ingen signifikante forskjeller (Second-Way ANOVA; P = 0,12) i cellesyklus overgang i celler transfektert med MIR-96 forløpere og hemmere i forhold til kontrollene. DU145 ble overfører raskere gjennom cellesyklus, noe som resulterer i et høyere antall celler i G2 /M (30,1 til 34,4%) og S-fase (19,2 til 22,7%) og mindre celler i G1 (43,9 til 50,7, figur 1D). Ingen signifikante forskjeller i cellesyklus overgang ble observert ved transfeksjon, og derved bekrefter observasjonene i LNCaP-celler (Second-veis ANOVA, p = 0,2).
Som forbedret spredning ikke kunne forklares med økt cellesyklus overgang undersøkte vi effekten av MIR-96 transfeksjon på apoptose. LNCaP og DU145 cellene ble transfektert med pre-MIR-96, MIR-96-hemmere eller egge kontroll og apoptose ble indusert med 10 mm camptothecin (CPT). CPT-indusert apoptose i LNCaP kontrollkulturer med 13,2% tidlig apoptotiske celler og 5,6% sent apoptotiske celler og i DU145-celler (24,2% tidlig og 5,9% sent apoptotiske celler) (figur 1E + F). Transient transfeksjon med MIR-96 forløpere redusert brøkdel av tidlig apoptotisk og sene apoptotiske celler med 28% (LNCaP) og 25% (DU145) (Second-veis ANOVA, P 0,001). Spesifisiteten av den observerte effekt av MIR-96 ble bekreftet ved MIR-21, som tjente som en positiv kontroll [22] og oppviste en lignende hemming av apoptose og MIR-16, som tjente som en negativ kontroll, og påvirket ikke apoptose i prostata kreft celler.
Vi undersøkt videre migrasjon av DU-145 celler ved transfeksjon med MIR-96. DU-145 viste en migrative fenotype og var i stand til å remigrate til 60% av arealet av den opprinnelige sår i løpet av 20 timer (figur S2). Transfeksjon med MIR-96-forløperen eller MIR-96-inhibitor hadde ingen effekt på cellemigrering i forhold til transfeksjon med egge kontroll eller ikke-transfekterte kontroll (Second-Way ANOVA; p = 0,71).
Identifikasjon av speil 96 målgener
for å identifisere regulerte mål, noe som potensielt står for de apoptotiske effekter, vi utførte i silico mål søk i miRecords og regnes prediksjon bare gyldig dersom målet ble identifisert av Miranda, TargetScan og PicTar, og to ekstra prediksjon algoritmer. Dermed har vi identifisert 209 mål for Mir-96 (tabell S2). Settet av spådde målgener ble videre analysert med hensyn til deres genet ontologi (GO) vilkår for å identifisere apoptose relaterte gener. 21 ut av 209 spådd MIR-96 målene hadde en apoptose-relatert GO sikt tildelt (tabell S2). Vi har også undersøkt antall bindingsseter og deres evolusjonære bevaring i TargetScan 5.1. og utførte et litteratursøk for å identifisere mål med en kjent tumorsuppressive funksjon ved PCA. En av de antatte målene, FOXO1 ble valgt for videre validering på grunn av sin kjente tumorsuppressive funksjon i prostata kreft. Korrelasjon mellom MIR-96 og FOXO1 transkripsjon uttrykk i LNCaP og DU145 cellene viser en invers korrelasjon av uttrykk (Figur S1 A + B). Den FOXO1 3 «UTR havner to 8-mer MIR-96 bindingssteder ved posisjon 264-270 og posisjon 2138-2145. Mens den første bindingsstedet er svært konservert, er den andre miRNA bindingssetet ikke. Vi konstruerte luciferase-reportere som inneholder 200-300 bp lange sekvenser omslutter den anslåtte målse. Kotransfeksjon av begge FOXO1 3 «UTR luciferase reportere med pre-MIR-96 i LNCaP-celler viste en 40% reduksjon av luciferase-aktivitet i forhold til transfeksjon kontroll (En-veis ANOVA, P 0,01), mens transfeksjon med speil 96-hemmer eller eggekontrollen ikke vesentlig påvirke luciferase aktivitet (figur 2A). Tilsetting av Mir-96 antisens sekvenser lansert sin hemming bare litt. Selv om andre MIR-96 bindingssete i FOXO 3 «UTR er bare delvis konservert, en lignende bindingsaktivitet med 42% reduksjon av luciferase-aktivitet (ANOVA, P 0,05) ble observert sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2B). Tilsetning av MIR-96 antisense-sekvensen delvis redusert denne effekten, mens den antisense-sekvensen alene ikke påvirket luciferase-aktivitet. Det omkastede miRNA sekvensen resulterte i en liten, men ingen signifikant inhibering av luciferaseaktivitet.
LNCaP-celler ble transfektert med 10 nM pre-MIR-96, anti-MIR-96, pre-MIR-NC # 1 eller kombinasjonen av pre-MIR-96 og anti-MIR-96 samt 500 ng pMiR rapport β-galaktosidase kontroll plasmid og 500 ng pMiR rapport plasmid for FOXO1 3 «UTR A) bindingssetet 1 i posisjon 264-270 og B) binding side 2 i posisjon 2138-2145. * P 0,05, ** P 0,01, Enveis ANOVA og Tukey multippel sammenligning innlegg test
Reduksjon av MIR-96 target genekspresjon in vitro
miRNAs. er foreslått til hovedsakelig å inhibere protein translasjon, men noen mirnas har også vist seg å føre til en i det minste delvis nedbrytning av de tilsvarende mRNA [23]. For å etablere den viktigste mekanismen som MIR-96 hemmer FOXO1 ved PCA og for å bevise at den mekanistiske binding av MIR-96 til 3-UTR kan resultere i en redusert uttrykk for FOXO1, transfektert vi LNCaP og DU145 cellene med MIR-96 forløper og /eller inhibitoren. MIR-96 nivåer i begge cellelinjer som var 400 ganger høyere i MIR-96 transfekterte celler og i de kotransfektert cellene sammenlignet med kontrollkulturer (ANOVA, P 0,001; figur 3A + B). Tilsvarende ble FOXO1 mRNA redusert mer enn to ganger i MIR-96 transfekterte celler (ANOVA, P 0,01, Figur 3C + D), mens transfeksjon med Mir-96 antisens sekvensen og egge miRNA viste ingen effekt på FOXO1 ekspresjonsnivåer (figur 3C + D). I tillegg til reduksjonen av FOXO1 transkriptet, observerte vi en 1,6 ganger og 2,6 ganger reduksjon av FOXO1 protein i LNCaP og DU145-celler ved ektopisk overekspresjon av MIR-96-forløperen, mens proteinnivåer ble ikke signifikant endret i celler transfektert med Mir -96-hemmer eller egge kontroll (Figur 3E + F, figur S3A + B). Til sammen dataene støtter hypotesen om at Mir-96 hemmer FOXO1 uttrykk.
Prostata kreft celler ble transfektert med 10 nM forhånds MIR-96, anti-MIR-96, pre-MIR-NC # 1 eller kombinasjonen av pre-MIR-96 og anti-MIR-96. MIR-96-ekspresjon i (A) LNCaP og (B) DU145-celler og FOXO1 ekspresjon i (C) LNCaP og (D) DU145-celler. Data er vist som gjennomsnitt (+ SD) av tre uavhengige analyser. ** P 0,01, *** P 0,001, Enveis ANOVA. FOXO1, AKT, og pakt protein ekspresjon i (E) LNCaP og (F) DU145-celler ble visualisert ved hjelp av western-blotting. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
FOXO1 aktivitet er direkte regulert av fosforylering av Akt på eksterne vekstsignaler, noe som resulterer i translocalization fra kjernen. For å sjekke om Mir-96 overekspresjon vesentlig endrer oppstrøms Akt signal, vurdert vi Akt og fosforylert Akt uttrykk i MIR-96 overekspresjon celler. Verken Akt heller fosforylerte Akt nivåene ble vesentlig endret ved transfeksjon med MIR-96 forløpere eller hemmere (Figur 3E + F), noe som viser at aktiviteten av FOXO1 ikke ble påvirket av endringer i Akt uttrykk eller aktivitet.
For ytterligere å støtte hypotesen om at Mir-96 kontroller FOXO1 i prostatakreft og dermed beskytter cellene mot apoptose, transfektert vi LNCaP og DU145 cellene med en full lengde FOXO1 cDNA. Ektopisk uttrykk for FOXO1 resulterte i en sterk oppregulering av FOXO1 som validert ved RT-PCR og westernblotting både LNCaP og DU145 celler (figur 4A-D). På grunn av den sterke fargeintensitet av FOXO1 i transfekterte celler, er FOXO1 i kontrollceller ennå ikke synlig på blot og ble synlig etter lengre utredning ganger. Kotransfeksjon med MIR-96 redusert FOXO1 mRNA nivåer med 2,5 og 1,7 ganger i LNCaP og DU145 celler (Enveis ANOVA, p 0,001), mens protein nivåer ble redusert med 2,8 og 2.1- ganger (Figur 4C + D, Figur S3C + D).
LNCaP og DU145 cellene ble transfektert med 500 ng FOXO1 full lengde klone eller tom vektor, 10 nM pre-MIR-96 eller pre-MIR-NC 1 #. FOXO1 uttrykk i (A) LNCaP og (B) DU145 cellene. Data er vist som gjennomsnitt (+ SD) av tre uavhengige analyser. *** P 0,001, Enveis ANOVA. FOXO1 protein ekspresjon i (C) LNCaP og (D) DU145-celler ble visualisert ved hjelp av western-blotting. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Apoptose i CPT-behandlet (E) LNCaP og (H) DU145 cellene. 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 10 uM CPT i 24 timer. Cellene ble farget med Annexin V-FITC og PI. Brøkdel av tidlig (svarte striper) og sen (hvite søyler) apoptotiske celler ble målt ved flowcytometri. Data er vist som gjennomsnitt (+ SD) av tre uavhengige analyser. ns, P 0,05, * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, Toveis ANOVA, Bonferroni innlegg test). Cellecyklus overgang ble målt ved PI farging i transfekterte (F) LNCaP og (I) DU145-celler. Celler ble serumsultede en dag etter transfeksjon i ytterligere 24 timer og deretter fiksert og farget. Svart, G1-fase; lys grå, S-fase; mørk grå, G2 /M-fase. Data er vist som gjennomsnitt av tre uavhengige analyser. *** P 0,001, Enveis ANOVA. Analyse av subG1 topp i (G) LNCaP og (J) DU145-celler. Data er vist som gjennomsnitt av tre uavhengige analyser. *** P 0,001, Enveis ANOVA
I neste trinn, vi vurdert, enten FOXO1 har en motsatt rolle i Mir-96 i prostatakreftceller og om effekten kan bli reddet. ved kotransfeksjon med MIR-96. FOXO1 sterkt indusert apoptose i begge cellelinjene (Toveis ANOVA, p 0,001, figur 4E + H). Behandling med CPT bare hadde en mild ekstra effekt på cellene. Samtidig overekspresjon av MIR-96 delvis reddet FOXO1 indusert apoptose i ubehandlet, så vel som CPT-behandlede celler, selv om effekten var liten og ikke signifikant i alle behandlinger (figur 4E + H).
sprednings ble også sterkt redusert i FOXO1 transfekterte LNCaP og DU145 cellene, men MIR-96 ikke signifikant reversere effekten (Figur S4A + B).
