Abstract
Selv om inaktivere rammeskifte mutasjoner i
Transforming growth factor beta-reseptor type 2 plakater (
TGFBR2
) genet anses som førere av mikro ustabil (MSI) colorectal tumorigenesis, er følge endringer av nedstrøms målet proteomet ikke løst helt. Bruk av en klikk-it kjemi protein merking tilnærming kombinert med massespektrometri i et MSI kolorektalkreft modell cellelinje, identifiserte vi 21
de novo
syntetiserte proteiner forskjellig uttrykt ved rekonstituert TGFBR2 uttrykk. En kandidat genet, TGF-ß familiemedlem Vekst differensiering faktor-15 (GDF-15), viste TGFBR2 avhengig transkripsjonen oppregulering forårsaker økt intracellulært og ekstracellulært protein nivåer. Som ny TGFBR2 målet genet kan det gi en kobling mellom TGF-ß gren og BMP /GDF gren av SMAD-mediert signale
Citation. Lee J, Fricke F, Warnken U, Schnölzer M, Kopitz J, Gebert J (2015) Tilberedning av TGFBR2-mediert signale Årsaker oppregulering av GDF-15 i HCT116 tykktarmskreftceller. PLoS ONE 10 (6): e0131506. doi: 10,1371 /journal.pone.0131506
Redaktør: Lu-Zhe Sun, University of Texas Health Science Center, UNITED STATES
mottatt: 25 februar 2015; Godkjent: 03.06.2015; Publisert: 26 juni 2015
Copyright: © 2015 Lee et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Økonomisk støtte ble gitt av Deutsche Forschungsgemeinschaft (GE592 /6-2) i JK og JG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) kan oppstå gjennom tre store veier, preget av kromosom ustabilitet [1], CpG island hyper-metylering fenotype [2] og mismatch reparasjon (MMR) -deficiency [3, 4]. Svulster som har mistet normal MMR-funksjonen viser et høyt nivå av mikro ustabilitet (MSI) vanligvis anerkjent som innsetting /delesjonsmutasjoner med korte mononukleotid repetisjoner (mikrosatellitter) ligger i koding og ikke-kodende genområder. Mer enn 90% av MSI kolorektal kreft har kjøpt somatiske innsetting /sletting mutasjoner i kodingen mononukleotid gjenta (A10) i ekson 3 av
Transforming growth factor beta-reseptor type 2 plakater (
TGFBR2
) genet som fører til translasjonsforskning frameshifts og nedsatt reseptor signalisering [5, 6]. Den TGFBR2 protein er en serin-treoninkinase som ved binding av dens ligand TGF-SS1, overfører kanonisk SMAD-mediert signalisering [7]. TGF-ß signalering spiller en nøkkelrolle i normal funksjon av tykktarms epitelceller men dens rolle i tumordannelse synes å være kontroversiell [8, 9]: i de tidlige stadier av svulst utvikling, TGF-ß fungerer som en klassisk tumor suppressor [10] , mens det fremmer EMT, migrasjon og metastase ved senere stadier av tumorprogresjon [11]. Disse tilsynelatende paradoksale biologiske egenskaper bestemmes av et stort antall target proteiner som uttrykk er regulert i en TGF-ß-avhengig måte [12].
De fleste av disse
bona fide
nedstrøms mål for TGF-ß signalering har blitt identifisert av screenings på transkripsjonsnivået, mens studier som fokuserer på TGF-ß-avhengige proteomikk endringer i kolorektal kreftceller er ganske begrenset og proteomikk uttrykk profiler kan ikke alltid være avledet fra transkriptom mønstre. Selv om TGF-ß signalveien har allerede blitt grundig preget, dens innvirkning på protein expression dynamikk som bidrar til biokjemisk /proteomikk fenotype av tykktarm kreft celler er ennå ikke fullt utforsket.
Siden kreftceller generelt og MSI tumorceller i særdeleshet har fått et begrenset antall driver mutasjoner som bidrar til kreftutvikling blant et stort antall irrelevante passasjer mutasjoner, er avgrensning av komplekse proteomikk endringer med spesifikke driver mutasjoner en stor utfordring. For å forstå hvordan feil på et enkelt medlem av TGF-ß signalveien, den TGFBR2, endrer cellulære proteomikk og glycomic landskapet i MSI kolorektal kreft celler, vi tidligere etablert et MSI cellelinje modellsystem som gjør det mulig doksycyklin (Dox) – regulert tilberedning av TGFBR2 uttrykk og signaloverføring i en isogen bakgrunn [13].
Ved hjelp av denne HCT116-TGFBR2 modell cellelinje i kombinasjon med et klikk kjemi tilnærming for spesifikke isolering av
de novo
proteom [14] og påfølgende massespektrometri (MS) analyse, identifiserte vi et begrenset antall proteiner som viste seg å være nylig uttrykt eller hvis syntese ble avskaffet ved TGFBR2 uttrykk. En av disse kandidat målene, er vekst- og differensieringsfaktor-15 (GDF-15) viste en TGFBR2 avhengig transkripsjonen oppregulering som korrelert med økte nivåer av intracellulær og utskilt protein. Disse data tyder på at GDF-15 er en TGF-ß-responsive genet.
Materialer og metoder
Cell kultur
Cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium (Life Technologies , Karlsruhe, Tyskland) supplert med 10% FBS (Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland) ved anvendelse av standard betingelser. Genereringen av doxycycline-induserbar HCT116-TGFBR2 cellekloner ble rapportert tidligere [13]. Kort fortalt, den villtype
TGFBR2
genet ble integrert i tykktarmskreft cellelinje HCT116, som havner biallelic inaktive
TGFBR2
rammeskifte mutasjoner, ved hjelp recombinase-mediert kassettbytte (RMCE) som resulterer i to uavhengige celle kloner, # 5 og # 22, med forskjellig løssalgs integrering stedet.
Metabolsk merking
For metabolske merking eksperimenter, 4×10
6 celler ble sådd i tre eksemplarer på 10 cm plater. Neste dag ble mediet erstattet og cellene ble enten dyrket i fravær eller nærvær av 0,5 ug /ml doksycyklin (Sigma, Taufkirchen Tyskland). Etter 11 timer ble cellene vasket med PBS (Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland), dyrket i 30 minutter i metionin-fritt RPMI 1640-medium (Sigma, Taufkirchen Tyskland) og deretter inkubert med 10 ng /ml TGF-SS1 (Cell Signaling, Danvers, USA) og den merkingsreagens (40 uM L-Azidohomoalanine (AHA) eller 4.625 MBq [
35S] -L-metionin) i nærvær eller fravær av Dox for 4 h (protein lysat) eller 24 timer (utskilte proteiner ). Som en kontroll for å identifisere bare AHA-merkede nylig syntetiserte proteiner, ble celler dyrket i triplikat i fravær av AHA og i nærvær av 200 pg /ml cykloheksimid (CHX), en inhibitor for proteinsyntese. For å analysere effekten av GDF-15 på pSmad2 signale, 100 ng /ml human rekombinant GDF-15 (G3046; Sigma, Taufkirchen, Tyskland) ble tilsatt til cellene i 1 time. Cellene ble vasket 3 ganger med PBS, høstet og sentrifugert i minst 10 minutter ved 1000 g ved 4 ° C i PBS inneholdende 1 x protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Tyskland). Cellepelletene ble direkte resuspendert i lyseringsbuffer. Medium av de radioaktive-merkede cellene ble samlet etter 24 timer, sentrifugert ved 1000 g ved 4 ° C i minst 10 minutter, og supernatanten ble underkastet GDF-15 immunutfelling.
klikk iT reaksjon
etter metabolsk AHA merking (C10102, Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland), ble cellepelletene lysert med 100 ul 1% SDS i 50 mM Tris-HCl, pH 8 supplert med protease inhibitor cocktail, ultralydbehandlet i 30 sekunder og inkubert minst 30 min ved 4 ° C under roterende som tidligere beskrevet [14]. Etter sentrifugering ved 4 ° C i 30 minutter ved 12000 g, ble proteinkonsentrasjonen bestemt ved Bradford-analyse (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munchen, Tyskland). 200 ug protein ble anvendt for å reagere med 40 uM Biotin alkyn i DMSO (B10185, Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter metanol /kloroform (4: 1) utfelling, ble utfellingene gjenoppløst i 200 ul RIPA-buffer, ultralydbehandlet i 30 sekunder og rotert over natten ved 4 ° C. For å fjerne unsolubilized materiale, ble proteinprøven sentrifugert ved 4 ° C i 20 min ved 12 000 g. Supernatanten ble deretter inkubert på en rotator med 80 ul suspensjon av streptavidin-belagte magnetiske kuler (Dynabeads MyOne Streptavidin T1, Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland), som var blitt vasket 3 ganger med PBST (PBS /0,01% Tween 20). Etter 2 timer ved 4 ° C, ble kulene vasket 3 ganger med 1 ml PBST inneholdende 2% SDS, etterfulgt av avsluttende vaskinger med PBS og 40 mM ammoniumbikarbonat.
Massespektrometrisk analyse
For massespektrometri , prøver ble fremstilt og analysert som tidligere beskrevet [14]. Kort sagt ble proteinbelastede kuler redusert, alkylert og trypsinysed ved 37 ° C over natten. Etter tilsetning av TFA prøven ble analysert ved nanoLC ESI-MS /MS på LTQ Orbitrap XL-massespektrometer (Thermo Scientific, Karlsruhe, Tyskland). De MGF-filer generert av Xcalibur programvare (Thermo Scientific, Karlsruhe, Tyskland) ble brukt til søk i databaser med maskoten søkemotor (Matrix Science, versjon 2.4) mot SwissProt database (SwissProt versjon 2013_02 (539165 sekvenser; 191456931 rester)) med taksonomi satt til menneske. Kandidat proteiner ble klassifisert som uttrykkes differensielt (TGFBR2-manglende eller-dyktig) hvis oppdaget i minst ett av tre biologiske replikater på hver av begge cellekloner (# 5 og # 22), men ikke i foreldre HCT116-Tet-On-celler.
Kvantitativ real Time (QRT) -PCR
1 mikrogram total RNA ble isolert ved hjelp av RNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og revers transkribert med Oligo-dT primere og Super II revers transkriptase henhold til produsentens protokoll (Life Technologies, Karlsruhe, Tyskland). Real-time PCR-analyse ble utført ved hjelp PowerSYBR Grønn Master Mix (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) og spesifikke primere for TGFBR2 (for: 5′-CGGCTCCCTAAACACTACCAA-3′, rev: 5′-AACAAATTGGACTAATCCGGA-3′) og GDF-15 (for: 5′-AAGATTCGAACACCGACCTC-3 «, 5′-AGAGATACGCAGGTGCAGGT-3»). Triplikater med forskjellige cDNA-prøver (- /+ Dox) ble analysert i den StepOnePlus termo cycler (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland) ved bruk av følgende program: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Data ble analysert ved StepOne programvare v2.1 (Applied Biosystems, Darmstadt, Tyskland). Genekspresjon ble normalisert til uttrykket av referansen genet
Hydroxymethylbilane syntase product: (
HMBS
) (for: 5′-CACCACAGGGGACAAGATTC-3′, rev: 5`-GTGAACAACCAGGTCCACTTC-3′).
Western blot analyse
RIPA protein lysatene og Western blot-analyse ble utført som tidligere beskrevet [13]. For immunoblotting ble 30-60 mikrogram av protein brukes. Primære antistoffer ble anvendt som følger: mus-anti-TGFBR2 (SC-17799, Santa Cruz, Dallas, USA; 1: 500, 4 ° C, over natten); mus anti-ß-Actin (klon 4; MP Biomedicals, Solon, USA; 1: 20000, RT, 30 min); kanin anti-GDF-15 (HPA011191; Sigma, Taufkirchen Tyskland, 1: 500, 4 ° C, over natten); kanin anti-fosfo-Smad2 og kanin-anti-Smad2 (Ser465 /467) og (86F7); Cell Signaling, Danvers, USA; 1: 1 000, 4 ° C, over natten). Blottene ble inkubert i 1 time ved RT med sekundære antistoffer: sau anti-mus-IgG-HRP (1: 5000; GE-Healthcare, Munchen, Tyskland) eller geite-anti-kanin-IgG-HRP (1: 2500, Promega, Madison, USA ). Deteksjon ble enten utført av standard prosedyre ved hjelp av Amersham Hyperfilm ECL eller ChemiDoc MP System (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Tyskland).
GDF-15 Immunpresipitasjon (IP)
Etter [
35S] -L-metionin merking (American Radiomerket Chemicals, Inc., St. Louis, USA), cellepelleten ble resuspendert i 200 ul RIPA-buffer inneholdende 2 x protease inhibitor cocktail. Protein lysater ble oppnådd som beskrevet ovenfor. For GDF-15 immunoutfelling, 0,3 ml lysat som inneholdt 1,8 mg protein og 5 ml av kultursupernatanten ble rotert med 1,5 ug GDF-15-antistoff (HPA011191; Sigma, Taufkirchen, Tyskland) og 2x protease inhibitor cocktail over natten ved 4 ° C. 25 ul av protein A /G-agarose slurry (Oncogene Science, Uniondale, USA) ble vasket 3 ganger med RIPA-buffer og deretter inkubert med lysatet eller kultursupernatanten og antistoffet i 2 timer ved å rotere ved 4 ° C. Kulene ble vasket 5 ganger med 500 ul RIPA-buffer og eluert med 2 x 200 pl 1 x SDS-prøvebuffer (106 mM Tris-HCl, 141 mM Tris Base, 2% SDS, 10% glyserol, 0,51 mM EDTA) ved 99 ° C i fem minutter ved 800 rpm. Prøvene ble deretter blandet med 10 ml scintillasjonsvæske og telt ved bruk av en væske-scintillasjons-analysator (TRI-CARB 2900TR, Packard, PerkinElmer, Waltham, USA).
Proliferation Assay
10
3-celler ble sådd ut i sextuplicate i en 96-brønners en dag før tilsetning av følgende reagenser: 0,5 ug /ml Dox, 10 ng /ml human rekombinant TGF-SS1 og 100 ng /ml human rekombinant GDF-15. Etter 6 dager ble MTS spredning analyser utført med CellTiter 96 Vandig kit (Promega, Madison, USA) i henhold til produsentens anvisninger. Spektrofotometriske målinger ble utført ved hjelp av GENIOS mikroplateleser (Tecan Group Ltd, Männedorf, Sveits) og absorbansen verdien av det cellefrie medium ble subtrahert fra absorbansverdiene for prøvene.
Diskusjon
Resultater og br >
3,1. Identifisering av
de novo
syntetiserte TGFBR2-avhengige target proteiner
For å sikre TGFBR2 avhengig regulering, vi tidligere genererte en modell cellelinje, heretter kalt HCT116-TGFBR2 [13]. Kort sagt blir HCT116-cellelinjen mutert for begge alleler for
TGFBR2
som fører til fravær av full-lengde proteinet. De to etablerte HCT116-TGFBR2 cellelinjer (klon # 5 og # 22), men inneholder en enkelt kopi integrert villtype
TGFBR2
-genet, som uttrykkes bare i nærvær av doksycyklin (Dox). Tidsforløpet analyse viste at 11-12h Dox behandling av disse cellene var tilstrekkelig til å nå toppnivåer av TGFBR2 protein (S1 figur).
For å bestemme den TGFBR2 avhengige
de novo
proteom, både HCT116-TGFBR2 kloner (# 5 og # 22) ble utsatt for den ligand TGF-SS1, i nærvær (TGFBR2-dyktig) eller fravær (TGFBR2-manglende) av doxycyclin og begynnende proteiner metabolsk merket med metionin L- surrogat Azidohomoalanine (AHA). Etter klikk-det-mediert biotinylering ble det merkede proteiner fanget opp av streptavidin-belagte magnetiske kuler og analysert ved massespektrometri. For å ta hensyn til proteiner som viser uspesifikk binding til kulene eller proteiner som befinner seg
a priori
på de kommersielt tilgjengelige streptavidin-belagte kuler, det samme eksperiment ble utført i fravær av merking reagens (-AHA) [14]. Minst 480
de novo
syntetiserte proteiner ble oppdaget på gjennomsnittet i begge cellekloner (S1 Table) og under begge forhold (-Dox: TGFBR2 fattig; + Dox: TGFBR2-dyktigere) ved stimulering med TGF-SS1 und derfor vært upåvirket av den TGFBR2 ekspresjonsstatus (tabell 1). Videre celler ble dyrket i nærvær av oversettelsen inhibitor cykloheksimid (CHX) for å identifisere bona fide
de novo
syntetiserte proteiner (merket med stjerne i tabell S1). Opptil 56 proteiner ble også påvist i kontroll-celler dyrket i fravær av AHA, ca. 10 ganger mindre enn det antall proteiner identifisert i nærvær av AHA etiketten, for derved bekrefter spesifisiteten av denne bioorthogonal merking tilnærmingen. Komparativ analyse av de TGFBR2 avhengige
de novo
proteom- avslørte 21 kandidater som ble funnet å være forskjellig uttrykt enten i TGFBR2-manglende eller TGFBR2-dyktige celler, men i det minste i en av tre replikate prøver og i hver av begge cellekloner. Protein forekomst i begge cellekloner ble anvendt som den sterkeste utvalgskriterium på grunn av visse variasjoner i protein forekomst blant triplikate prøver. Spesielt 12/21 proteiner utelukkende funnet sted i TGFBR2-deficent celler, mens de resterende proteinene (9/21) ble detektert kun i TGFBR2-dyktig celler som utviser rekonstituerte TGF-ß-signalering (tabell 2). Ifølge GO sikt klassifisering, er differensielt uttrykte proteiner assosiert med viktige cellulære prosesser som immunitet (1B59), signaltransduksjon (ASM, CSN3, DOCK8, GDF-15, TGFBR2), protein modifikasjon (CHIP, PP2AA), transkripsjon (DTD2, RBM42, T2FA, TE2IP, TFAM, UBF1) og protein transport (ERP29, RB6I2, HGS, TMEM9). Bare et fåtall av disse proteinene har angivelig vært knyttet til TGF-ß /SMAD signalveien (ASM, CHIP, HGS, PP2AA, SYNE2, GDF-15), men direkte regulering av deres uttrykk ved TGFBR2 reseptor i tykktarm kreft celler har ikke blitt vist. Siden den eksperimentelle strategi fulgt i denne studien fokusert på identifisering av nye syntetiserte proteiner, vår kandidatlisten av ulikt uttrykte proteiner mest sannsynlig representere potensiell ny
bona fide
målene for TGFBR2-mediert signalering i MSI HCT116 kolorektal kreftceller .
Selvfølgelig, noen kjente nedstrøms mål for kanonisk TGF-ß /SMAD signalanlegg som SMAD7 [15], SERPINE [16] eller JUNB [17] mangler fra vår liste over forskjellig uttrykt kandidat proteiner. Flere grunner kan forklare denne begrensning: For det første, ble våre utvalgskriterier for kandidat proteiner basert på differensial ekspresjon i minst en prøve i hver av begge cellekloner som kanskje ikke står for variasjoner i proteinekspresjon mellom disse to cellelinje kloner. For eksempel, JUNB og CSK1 [18], en annen vekst suppressor og TGF-ß target genet i epitelceller, ble ikke rekruttert til vår liste over forskjellig uttrykt kandidat proteiner fordi de ble oppdaget bare i en klone av TGFBR2-dyktig og TGFBR2-mangel -celler, respektivt. For det andre, vår eksperimentelle strategi er designet for å avdekke bare
de novo
syntetiserte proteiner med klar begrensning til uttrykket status for TGFBR2 signal svinger og kvantitative endringer i proteinnivåer ved TGFBR2 tilberedning og dermed kan forklare hvorfor noen kandidater kan ha rømt deteksjon. Alternativt kan manglende påvisning være på grunn av forskjeller i inkorporering effektivitet av metionin og dets analoge AHA og /eller også kan være avhengig av antallet av metioninrestene som faktisk finnes i hvert protein. For det tredje, TGF-SS1 ligand eksponering var begrenset til en kort tidsperiode på 4 timer som kanskje ikke være tilstrekkelig til å fremkalle påvisbare nivåer av noen nylig syntetiserte TGF-SS1 målproteiner [19]. Til slutt, som en påminnelse, vi kan ikke utelukke at noen av kandidatene identifisert i denne studien faktisk ikke representerer
de novo
syntetiserte proteiner bare på grunn av deres tilknytning til
bona fide
TGFBR2 target-proteiner via protein-protein interaksjoner. Viktigst vi imidlertid entydig identifisert TGFBR2 proteinet i seg selv i begge kloner av vår TGFBR2-rekonstituerte modell cellelinjen som sterkt støtter gyldigheten av våre eksperimentelle metode.
3,2. TGFBR2 avhengig uttrykk for GDF-15
Blant de
de novo
syntetiserte proteiner spesifikt indusert i TGFBR2-rekonstituert celler, vi identifisert vekst og differensiering faktor 15 (GDF-15). I likhet med TGF-ß selv, kan GDF-15 utviser avvikende funksjoner i kreftceller [20]. For eksempel, kan den fungere som en tumor suppressor og utløse apoptose når den overuttrykkes i HCT116-celler [21], men det er også funnet at økte nivåer i sent stadium kreftformer som indikerer dens nytte som en markør for tumorprogresjon [22]. For å analysere TGFBR2-responsive gener i mer detalj, vi fokusert på GDF-15 som en potensiell kandidat gen fordi det er fortsatt ukjent om medlemmer av TGF-ß familie av cytokiner kan reguleres i en TGFBR2 avhengig måte ved kolorektalkreft celler.
Som et første skritt, undersøkte vi reguleringen av GDF-15 uttrykk på karakterutskriften nivå. TGFBR2-dyktige og TGFBR2-manglende HCT116-celler ble utsatt for TGF-SS1 i to forskjellige tidsperioder (2 h og 4 h) og GDF-15-mRNA-ekspresjon ble bestemt ved sanntids-PCR-analyse (figur 1A). Stimulering med TGF-SS1 for 2 h forårsaket en tilnærmet dobling av GDF-15 transkripsjonsnivåer i både HCT116-TGFBR2 kloner ved sammenligning TGFBR2-dyktig versus TGFBR2-manglende celler. Denne induksjonsfaktoren ble redusert til ca. 1,5 ganger når ligand eksponeringstiden ble utvidet (4 timer). Foreldre HCT116-Tet-On kontrollceller viste ikke Dox-avhengige endringer av GDF-15 uttrykk som utelukker eventuelle uspesifikke effekter tillagt av doksycyklin. Bortsett fra TGF-SS1 avhengige uttrykk endringer, vi også observert en forskjell på GDF-15 uttrykk blant både HCT116-TGFBR2 kloner. Spesielt dobling av GDF-15 transkripsjonsnivåer var alltid mindre i klone 22 sammenlignet med klone 5. Mest sannsynlig, dette kan være på grunn av ulike integrasjons områder av
TGBFR2
transgenet i disse kloner [13 ].
(A) oppregulert transkripsjonsnivåer av GDF-15 i nærvær av Dox ved hjelp av sanntids QRT-PCR-analyse. (B) Western blot-analyse av GDF-15 proteinet uttrykket i totalt proteinlysatene (30 ug) av TGF-SS1 stimulerte celler (4 timer). Ekspresjon av GDF-15 blir øket når TGFBR2 uttrykkes (+ Dox) i begge cellekloner, men ikke i den paren Tet-On cellelinje. TGF-SS1 signalering er indikert ved økt pSmad2 nivåer i TGFBR2-uttrykkende kloner. Tilsetning av cykloheksimid (CHX) reduserer ekspresjonsnivået av GDF-15. ß-Actin og Smad2 fungerte som en lasting kontroll.
I tillegg til disse transkripsjons endringer, vi undersøkt om GDF-15 protein nivåer er også modulert av TGFBR2 uttrykk status i vårt modellsystem. Totale cellelysater ble fremstilt fra Dox-behandlede og ubehandlede HCT116-TGFBR2 kloner og HCT116-Tet-On kontrollceller etter TGF-SS1 eksponering (4 timer) og undersøkt ved Western blot-analyse (figur 1B). Etter avtale med transkripsjons data, tilberedning av ligand-utløst TGFBR2 signale medført en økning av GDF-15 proteinnivået i begge cellekloner mens SS-aktin nivåer forble upåvirket. HCT116-Tet-On kontrollceller viste ikke Dox avhengige endringer i GDF-15 uttrykk. Videre tilsetning av cykloheksimid (+ CHX) reduserte ekspresjonen av GDF-15 betydelig i TGFBR2-uttrykkende celle klon # 5 i motsetning til ß-aktin eller Smad2 proteiner som forble CHX resistente. Disse funnene underbygge den
de novo
syntese av GDF-15 og sterkt støtte våre resultater proteomikk (tabell 2). Økte pSmad2 nivåer ved tilberedning av TGFBR2 (+ Dox) bekrefter at denne modellen systemet er i stand til å lokke fram riktig Smad signalering.
For å validere de observerte endringene i GDF-15 protein uttrykk i en mer nøyaktig og kvantitativ måte utførte vi en metabolsk merking eksperiment med [
35S] -L-metionin. Proteiner ble radioaktivt merket under de samme betingelser som i AHA merkingen eksperimentet, men merket GDF-15 protein ble deretter immunopresipitert og telt ved bruk av en væske-scintillasjons-analysator (figur 2). Det ble observert en tilnærmet 2,5-3 gangers økning av intracellulær GDF-15 proteinnivå i begge kloner av Dox-behandlede HCT116-celler TGFBR2 ved TGF-ß stimulering sammenlignet med basal ekspresjonsnivået av de samme celler dyrket i fravær av Dox ( figur 2A). Siden GDF-15 kan opptre på en parakrin eller autokrin måte, vi også analysert mengden av [
35S] -L-metionin-merket utskilt GDF-15-proteinet ved GDF-15 immunutfelling fra kulturmediet (figur 2B). Rekonstituert TGFBR2-mediert signalisering i begge cellekloner førte til en betydelig økning av utskilt GDF-15 protein lik økningen av intracellulære nivåer. Foreldre Tet-On cellelinje viste ingen endring i nylig syntetisert GDF-15 ekspresjon i verken protein-lysatene eller i cellekulturmediet (data ikke vist). Som konklusjon, tyder disse data på at TGFBR2-avhengig økt ekspresjon av GDF-15 ser ut til å bli ført til dets virkningssete i det ekstracellulære miljø.
[
35S] -L-metionin ble anvendt for metabolske merking og påfølgende immunopresipitering av intracellulær GDF-15 fra samlede lysater (A) eller utskilt GDF-15 fra cellekulturmedium (B). Celler ble stimulert med TGF-SS1 i 4 timer i (A) og 24 timer i (B)
GDF-15 er kjent for å eksistere i forskjellige former [23]:. Pro-peptidet er spaltes av en protease for å generere modne bioaktive protein. Den modne GDF-15-protein er kjent for å bli utskilt, men dette har også blitt rapportert for den pro-peptidet [24]. Antistoffet anvendt i våre forsøk immunoutfellingsstudier er i stand til å gjenkjenne den pro-peptidet, men binder seg ikke til den modne formen. Derfor ønsker vi å understreke at våre resultater gjelder for den pro-peptid versjon av GDF-15, som fortsatt kan være knyttet til den modne form eller kan også spaltes og uavhengig anerkjent. For å avklare om den modne formen påvirkes til en lignende grad andre antistoffer må testes.
For å teste for effekter av GDF-15 på cellevekst og signalering, utførte vi en spredning analyse og pSmad2 Western blot-analyse ved bruk av humant rekombinant GDF-15 protein (figur 3). TGF-SS1 eller GDF-15-tilsetning alene nedsatt formeringshastigheten, ble imidlertid den veksthemmende virkning mer fremtredende når begge cytokiner ble tilsatt samtidig når man sammenligner TGFBR2 uttrykkende (+ Dox) til TGFBR2-manglende (-Dox) celler i HCT116- TGFBR2 # 5 (figur 3A). Spredning av foreldre Tet-On cellelinje ble ikke endret i det hele tatt ved stimulering med noen cytokin og – /+ Dox i alle kombinasjoner (data ikke vist). Videre har vi undersøkt effekten av eksogent tilsetning av GDF-15 på Smad signalering. Rekombinant GDF-15 alene var i stand til å stimulere pSmad2 ekspresjon i TGFBR2 uttrykkende celler (+ Dox), men ikke i TGFBR2-manglende celler (-Dox) (figur 3B). I fravær av rekombinant GDF-15 og TGF-SS1 ligand ble det ikke påvist pSmad2, mens stimulering med TGF-SS1 alene viste en i økning i pSmad2 nivå i TGFBR2-dyktige celler. vist TGF-SS1 og GDF-15 tillegg den største økningen av fosforylerte Smad2 nivåer som er i overensstemmelse med den observerte redusert formeringshastigheten når begge ligander ble tilsatt samtidig (figur 3A). Dette er, så vidt vi vet, den første rapporten som viser fosforylering av Smad2 av GDF-15 i en TGFBR2 avhengig måte i menneskelige kolorektal kreftceller. I sammenheng med kreft og sykdomsprogresjon hvor TGFBR2 er ikke-funksjonell, kan reduksjonen av GDF-15 ekspresjon fører til en vekstfordel i forhold til villtype, TGFBR2-uttrykkende celler, simulere heller den ikke-kreft fenotype. I Western blot-analyse er det også vist at TGF-SS1 alene er å øke nivået av pSmad2 ekspresjon i fravær av TGFBR2 sammenlignet med ustimulerte celler (figur 3B). Dette basalnivået pSmad2 ble observert i foreldre HCT116-Tet-On og TGFBR2-uttrykke celle klone og er i tråd med våre tidligere publiserte arbeid [13]. Det er en rapport om potensielle regulering av GDF-15 mRNA av TGF-SS1 [25]. Så langt har dette bare blitt observert i makrofager, og det er ingen bevis ennå om TGFBR2 avhengig regulering av GDF-15 uttrykk i andre vev eller sykdommer som tykktarmskreft. Men andre undersøkelser gir noen eksperimentelle bevis for den omvendte situasjon, dvs. at GDF-15 påvirker TGF-ß signalering. For eksempel, studier på mus tyder på at GDF-15 kan fungere som en potensiell ligand for TGFBR2 [26]. Videre synes GDF-15 for å modulere TGFBR2 fosforylering eller signalering som er påvist i rotte cerebellar granule nerveceller [27]. Disse observasjonene er ikke nødvendigvis motsi våre funn, men snarere kan tyde på en potensiell tilbakemeldinger fra GDF-15 på TGFBR2-mediert signalering.
(A) spredningsanalyse vises som et gjennomsnitt av seks replikater. (B) Western blot-analyse av TGFBR2-avhengige pSmad2 nivåer. HCT116-TGFBR2 # 5-celler ble behandlet i fravær og nærvær av humant rekombinant TGF-SS1 (10 ng /ml) og GDF-15 i 1 time. Smad2 fungert som en intern lasting kontroll.
Siden GDF-15 har både pro- og anti-tumor aktivitet avhengig av mobilnettet og microenvironmental sammenheng, utfallet av TGFBR2 avhengig GDF-15 overekspresjon og økt sekresjon er vanskelig å forutsi. En fersk studie viste at sirkulerende GDF-15 er assosiert med en høyere risiko for CRC, og at ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) kan redusere risikoen [28]. Kontroversielt, det er publikasjoner som viser at disse NSAIDs indusere uttrykk for GDF-15 som deretter fører til apoptose i HCT116-celler [21, 29], som er i overensstemmelse med observasjonene vi har gjort i denne studien: TGFBR2 tilberedning representerer heller villtype situasjonen i som GDF-15 er uttrykt på et høyere nivå, mens i svulsten tilstand (TGFBR2 mangel) mindre GDF-15 er uttrykt og utskilt og kreftceller kan unnslippe apoptose.
Når det gjelder den type II-reseptorer som transduce signalene fremkalt av superfamily av TGF-ß /Bone morphogenic protein (BMP) /activin ligander, proteomikk data hentet fra TGF-SS1 stimulert og TGFBR2-rekonstituert celler i denne studien muliggjøre en direkte sammenligning med proteomikk data fått fra vår tidligere arbeid på activin A-stimulerte og ACVR2-rekonstituerte celler. Sammenlignet med
de novo
proteom- av HCT116-ACVR2 celler [14], er det ingen overlapping med den differensielt uttrykte sett av kandidat gener som er identifisert i HCT116-celler TGFBR2. Selv om begge reseptorer er medlemmer av samme familie av type II signaldetektorer og overføre sine signaler gjennom felles Smad mediator proteiner i den kanoniske vei, kan den observerte mangelen på overlapping delvis skyldes binding til forskjellige ligander.
Samlet, ved hjelp av et godt karakterisert modell system som tillater induserbart uttrykk for en viktig driver for tykktarms tumorigenesis i en isogen bakgrunn har vi identifisert et sett med
de novo
syntetiserte kandidat proteiner som differensial uttrykk synes å være regulert i en TGFBR2-avhengig måte. Blant disse kandidatene vi identifisert TGF-ß super medlem GDF-15 som en potensiell ny mål hvis mRNA, intracellulære og utskilt protein nivåene ble oppregulert på TGFBR2 tilberedning. Dette TGFBR2-GDF15 koblingen kan være en del av en reguleringssløyfe som også innebærer en tidligere beskrevet GDF-15-TGFBR2 linken [27].
