Abstract
Selv om leger kan forutsi hvilke pasienter som er i faresonen for å utvikle metastaser, tradisjonell terapi ofte vise seg å være ineffektiv og metastatisk sykdom er den primære årsaken til kreftpasient død; Derfor er det et behov for å utvikle anti-metastatiske behandlinger som kan administreres over lange varigheter for å spesifikt hemme motiliteten av kreftceller.
Withania
somnifera
root ekstrakter (WRE) har anti-proliferativ aktivitet og den aktive komponenten, Withaferin A, hemmer pro-metastatisk protein, vimentin. Vimentin er en mellomliggende filament protein og er en del av epiteliale til mesenchymale overgang (EMT) program for å fremme metastaser. Her har vi avgjort om WRE standardisert til Withaferin A (sWRE) besitter anti-metastatisk aktivitet og om det hemmer kreft motilitet via hemming av vimentin og EMT program. Flere formuleringer av sWRE ble opprettet for å anrike for Withaferin A og en stamløsning av sWRE i EtOH kunne gjenvinne over 90% av den Withaferin A som finnes i det opprinnelige ekstrakt pulver. Dette sWRE formulering hemmet brystkreft cellemotilitet og invasjon i konsentrasjoner mindre enn 1 um samtidig ha ubetydelig cytotoksisitet ved denne dosen. sWRE behandling forstyrret vimentin morfologi i cellelinjer, bekrefter sin vimentin hemmende aktivitet. For å avgjøre om sWRE hemmet EMT, ble TGF-β brukes til å indusere EMT i MCF10A menneskelige mammary epitelceller. I dette tilfellet, sWRE hindret EMT induksjon og hemmet 3-D sfæroide invasjon. Disse studiene ble tatt inn i en menneskelig xenograft og mus brystkreft modell. I begge modellene, sWRE og Withaferin A viste doseavhengig hemming av tumorvekst og metastatisk lunge nodule formasjon med minimal systemisk toksisitet. Samlet utgjør disse data støtter hypotesen om at lave konsentrasjoner av sWRE hemme kreft metastase potensielt gjennom EMT hemming. Videre disse doser sWRE har nesten ingen toksisitet i normale mus organer, noe som tyder på potensialet for klinisk bruk av oralt administrerte WRE kapsler
Citation. Yang Z, Garcia A, Xu S, Powell DR, Vertino PM, Singh S, et al. (2013)
Withania
somnifera
Root Extract Hemmer melke kreft metastase og Epitelial til Mesenchymale Transition. PLoS ONE 8 (9): e75069. doi: 10,1371 /journal.pone.0075069
Redaktør: Michael Klymkowsky, University of Colorado, Boulder, USA
mottatt: 1 mars 2013, Godkjent: 09.08.2013; Publisert: 12. september 2013
Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en R21 fra Nasjonalt Senter for komplementær og alternativ medisin (1R21AT005231) tildelt AIM, den Godfrey Charitable Trust, og Golfer mot kreft. Dette arbeidet ble også støttet av en P30 CCSG tildelt Winship Cancer Institute (3P30CA138292). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
brystkreft er en av de vanligste kreftformene blant kvinner i USA og den nest største årsaken til kvinnelig kreftdød [1]. Større enn 90% av brystkreftpasientdødsfall tilskrives metastatisk sykdom der den primære svulsten har invadert fjerne områder. Siden disse metastatiske celler er ofte svært aggressive, vanskelig å oppdage, og kjemoresistent [2], en terapeutisk strategi kan være å forhindre metastatisk sykdom i stedet for å behandle det når det skjer.
metastatisk prosess kan kategoriseres i tre etapper tumorcelle invasjon inn i omkringliggende vev, intravasation i blod eller lymfekar, og bloduttredelse inn i en ny vert miljø [3-5]. I mange tilfeller, metastatiske celler som gjennomgår epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), hvor genetiske og epigenetiske hendelser forårsake en polarisert epitel celle til å bli trekkende og invasiv [6]. På molekylært nivå, fører EMT en gevinst på vimentin og fibronektin uttrykk, og tap av E-cadherin på cellemembranen [7,8]. Samle bevis viser at EMT er en viktig mekanisme kjører brystkreft progresjon og metastase [9-13].
Withania
somnifera plakater (Ashwagandha) planter er mye brukt i Øst- indisk medisin. Den W. somnifera root extract (WRE) består av 14 forbindelser kjent som withanolides, med Withaferin A er den mest fremtredende [14-16]. Withaferin A er et steroid lakton som induserer apoptose og hemmer tumorvekst ved å målrette signalerings proteiner, slik som P53, FOXO3A, Notch-1, HSP90 og STAT3 [17-22]. Withaferin En behandling fører til cellesyklusstans, øket reaktiv oksidativt stress [23-26], inhibering av JAK /STAT sti [27], inhibering av angiogenese [28], og modifisert celleform og opptreden [29]. Withaferin En besitter også potent anti-invasiv aktivitet, noe som potensielt kan være på grunn av dets interaksjon med pro-vandrende protein vimentin.
vimentin er type III mellomfilament og klassisk EMT protein markør [30]. Skjønt vimentin funksjoner i å opprettholde cellestrukturen, er det også et høyt dynamisk polymer som samler og dissembles i en motile celle. Når celler gjennomgår EMT er vimentin ekspresjon økes, og dette er tenkt å tilveiebringe celler med en mer mesenchymale, pro-bevegelige fenotype [31]. Den nøyaktige rollen vimentin under EMT og utvikling er uklart, siden en vimentin mus knockout modellen ikke viser alvorlige utviklingsdefekter [32]. Ytterligere studier men gikk på å vise at disse musene hadde svekket fibroblast sårheling, og en redusert evne til å trekke en kollagen nettverk [33].
Withaferin En foreslås å binde seg til vimentin gjennom en kovalent modifikasjon av cystein 328 [34], noe som fører til forandringer i morfologi og vimentin fosforylering [29]; Men andre data viser at mutasjon av cystein 328 ikke påvirker Withaferin A-indusert vimentin hemming [29]. Når gitt intra-peritonealt (IP), Withaferin A hemmer effektivt brystkreft metastaser, og har nesten ingen observerbar toksisitet [35].
Mindre er kjent om den anti-tumor aktivitet av Withaferin En forelder rot ekstrakt, WRE . Liknende effekter observeres på tumorvekst, cellesyklus, og angiogenese med WRE behandling [36-40] sammen med immunmodulerende virkninger i kolon og lungekreft [41,42]. Likevel studier som direkte sammenligner WRE til Withaferin A er ikke utført, og sin anti-metastatisk aktivitet ikke er godt studert. Videre besitter WRE flere fordeler i forhold Withaferin A, ettersom det kan gis oralt i en kapsel, og de aktive withanolides kan ha farmakologisk synergi; Derfor ønsket vi å bestemme anti-metastatisk effekt av WRE standardisert (sWRE) til den rene aktive komponenten, Withaferin A, i brystkreft. Vi viste at sWRE kan hemme human brystkreft celle invasjon
in vitro Hotell og metastasering i begge allograft og xenograft brystkreft musemodeller, lik den rene lite molekyl Withaferin A. sWRE induserer vimentin omorganiserings- og morfologiske celleforandringer i human brystkreft celler og, viktigst, hemmer EMT induksjon i normale menneskelige mammary epitelceller. Våre resultater belyse potensialet for sWRE som en roman komplementær alternativ medisin brukt som et anti-metastatisk forebyggende behandling hos høyrisikobrystkreftpasienter.
Metoder
Reagenser og antistoffer
WFA ble kjøpt fra Chromadex (Irvine, California) og WRE ble levert av Verdure Sciences (Noblesville, IN) med sertifikat for analyse som sier at den er fri for tungmetaller, bakterier og sopp. Antistoffet mot vimentin ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO), E-cadherin fra BD Biosciences (Bedford, MA), fibronektin fra Abcam (Cambridge, MA), og GAPDH fra Cell Signaling (Beverly, MA).
sWRE fremstilling
100% etanol ble oppvarmet til 60 ° C og deretter blandet med WRE til konsentrasjonen på 250 mg /ml i 30 minutter i et glassbeger. Destillert H
2o ble deretter langsomt tilsatt for å redusere etanolkonsentrasjonen til 90%, og omrøring ble fortsatt i ytterligere 30 minutter. Blandingen ble deretter sentrifugert ved 4000rpm i en sentrifuge i 15 minutter ved romtemperatur og supernatanten ble oppsamlet. Supernatanten ble deretter ført en 0.22μm filter, alikvoteres og holdes ved -80 ° C for fremtidig bruk.
Cellelinjer og dyrkningsbetingelser
Humant MDA-MB-231 (ATCC # HTB -26), ble MCF-7 (# HTB-22) og T47D (# HTB-133) brystcancercellelinjer som er kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Hs578-T, HCC1806 og MDA-MB-468 human brystkreftcellelinjer ble gitt av Dr. O, Regan (Emory University [45]). Menneskelig MCF10A mammary epiteliale cellelinje ble gitt av Dr. Vertino (Emory University [45]). Murine brystkreft 4T1 celler ble gitt av Dr. Dewhirst (Duke University [35,45]). T47D og HCC1806 ble dyrket i RPMI 1640 med 10% FBS. MDA-MB-231, MCF-7, ble Hs578-T, MDA-MB-468 og 4T1 dyrket i DMEM 10% FBS. MCF10A celler ble dyrket i DMEM /F12 supplert med 5% FBS, 20 ng /ml EGF, 0,5 ug /ml hydrokortison, 100 ng /ml koleratoksin, og 10 ug /ml insulin. Alle cellelinjer ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære.
Cvtotoksisitetsmålinq
Promega CellTiter 96
® vandig ikke-radioaktive Cell Proliferation Assay (MTS) ble utført for å bestemme
in vitro
cytotoksisitet av sWRE. I korthet ble cellene dyrket i 96-brønners plater over natten og deretter behandlet med sWRE ved den angitte konsentrasjon i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble bedømt ved å bestemme absorbansen ved 490 nm, som beskrevet av produsenten (Promega, Madison, WI). Celleviabilitet ble uttrykt som: A
exp gruppe /A
kontroll X 100.
In vitro sårheling analysen
En celle migrasjon såret Analysen ble utført som beskrevet tidligere [43 ]. Celler ble dyrket i 6 brønner plate til 100% konfluens. Etter såret med en pipettespiss ble cellene vasket med PBS og nye medier med den respektive konsentrasjon av sWRE ble tilsatt. Celler ble deretter tillatt å migrere i 24 timer ved 37 ° C. Bilder av celler ble tatt ved 0 og 24 timer med et Olympus IX51 Widefield mikroskop (Center Valley, PA) på 5X forstørrelse med en Hamamatsu Orca ER CCD kamera.
Matrigel invasjonen assay
Cell invasjonen ble analysert ved bruk av Roche xCelligence RTCA DP (real-Time Cell Analyzer Dual Plate) Instrument (Indianapolis, IN). DMEM med 10% FBS ble tilsatt til den nederste kammer i en CIM-Plate 16. 250 ug /ml Matrigel (BD Biosciences) ble polymerisert i brønnene i toppkammeret i 1 time ved 37 ° C. Serumfritt medium ble tilsatt til den øverste kammer, inkubert i 30 minutter ved 37 ° C, og en bakgrunn måling ble tatt. Cellene ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av sWRE i serumfritt medium over natten. Disse cellene ble deretter tilsatt til det øverste kammeret og platen ble inkubert i 37 ° C med den xCelligence plateleser. Impedansmålinger ble tatt i bunnen godt og impedansen økning korrelerer med økende antall migrerte celler. Endringer i impedans, noe som gjenspeiles av cellen invasjonsindeksverdiene, ble overvåket i minst 24 timer.
Western blotting
Protein nivåer i cellelysatene ble mål ved hjelp av en standard BCA analyse. Cellelysater i prøvebuffer ble separert på en 10% SDS-PAGE-geler, og ble overført til PVDF-membraner (Bio-Rad, Hercules, CA). Etter blokkering med 5% fettfri melk inneholdende TBST ble membranene inkubert separat med antistoffer mot vimentin, E-cadherin, fibronektin, og GAPDH ved romtemperatur i 2 timer. Membranene ble deretter vasket og inkubert med pepperrot peroksidase konjugert sekundært antistoff i 1 time. Båndene ble oppdaget ved hjelp av Amersham ECL Plus reagenser og deretter eksponert til film.
Confocal bilde
Cellene ble dyrket på glass dekkglass og behandlet med sWRE i 24 timer. Cellene ble deretter fiksert og prosessert for immunofluorescens-mikroskopi som tidligere beskrevet [35]. Celler ble farget ved bruk av en primær anti-vimentin-antistoff og sekundære Alexa 488-konjugert geit-anti-mus IgG. Dekk ble montert på lysbilder og avbildes med Zeiss LSM510 META konfokal mikroskop med en 40X Plan-NEOFLUAR olje objektiv (NA 1.3).
Real-time PCR
Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp av RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) og forbehandles med DNase I. cDNA ble så syntetisert ved hjelp av tilfeldige heksamerprimere og MMLV- revers transkriptase. Målspesifikke primere ble anvendt for å amplifisere cDNA in triplo ved bruk av en reaksjonsblanding som inneholdt 1 ul av den passende fortynnet cDNA-prøve, 0.2μmol /l primere og 12.5μl av IQ SYBR grønn SuperMix (Bio-Rad). 18S rRNA ble amplifisert fra de samme prøvene som en intern kontroll. Reaksjonsblandingen ble underkastet en varm start i 3 minutter ved 95 ° C og 40 sykluser av 95 ° C, 10 s; 55 ° C (18S) eller 63 ° C (vimentin), 30 sek. Primere for real-time PCR-analyse var for vimentin: 5 «AATGGCTCGTCACCTTCGTGAA3» og 5 «CAGATTAGTTTCCCTCAGGTTCAG3» og for 18S, 5 «GAGGGAGCCTGAGAAACG G3» og 5 «GTCGGGAGTGGGTAATTT GC3»
Tredimensjonal spheroid invasjonen assay
agarose-belagte plater ble laget ved å laste hver brønn med 0,75% agarose i DMEM med 10% FBS. Etter gelering ble MCF10A-celler tilsatt til brønnene og inkubert ved 37 ° C. Celle sfæroider som dannes i løpet av 3-5 dager. 5-10 kuler ble blandet med Matrigel i DMEM eller DMEM pluss sWRE. Blandingen ble plassert i midten av en 35 mm avbildning petriskål med en # 1,5 dekkglass (Mattek Corporation), og deretter anbragt på toppen med et ekstra dekkglass. Skålen ble så anbragt i en 37 ° C inkubator i 30 min for å tillate Matrigel polymerisasjonen ble deretter 2 ml DMEM med 10% FBS ble tilsatt. Parabolen ble overført til levende celle PerkinElmer Ultra ERS spinne disk konfokalmikroskop [44] og bildene ble anskaffet ved hjelp 20X Zeiss objektiv (NA 0,75) hvert 20. minutt i 24 timer med en Hamamatsu Orca ER kamera.
I vivo sWRE toksisitetsstudie
Åtte ukers gamle kvinnelige Balb /c mus ble kjøpt fra Harlan og ligger i Winship Cancer dyremodeller anlegget i henhold til vår godkjent IACUC protokollen. Musene ble holdt i grupper på fem per bur og matet med AIN76A kontroll diett og vann
ad libitum
. Musene ble randomisert inn i 3 grupper på 3 mus pr gruppe og behandlet ved oral gavage med enten bærer (9% etanol) eller bærer inneholdende sWRE ved 4, og 8 mg /kg kroppsvekt, 3 ganger i uken i 4 uker. Mus kroppsvekt ble registrert hver gang etter oral gavage. Etter 4 ukers behandling, ble musene avlivet og organer (hjerte, lunge, lever, milt og nyre) ble samlet inn og sendt til patologisk analyse. Toksiske effekter ble vurdert av en blindet veterinær patolog basert på tilstedeværelsen av betennelse, nekrose og fibrose ved hjelp av en skala fra normal (1+) til moderat (3+).
brystkreft modell
alle mus studiene ble utført i samsvar med våre godkjente Emory University Institutional Animal Care og bruk komité protokollen. Åtte uker gamle Balb /c-mus ble tilfeldig fordelt i 4 grupper med 10 mus i hver gruppe. 10
6 4T1-celler i PBS ble injisert subkutant inn i melkefettpute hos hver mus. En uke etter injeksjon ble sWRE gitt ved oral gavage med enten bærer eller bærer inneholdende sWRE ved 1, 4 og 8 mg /kg kroppsvekt 3 ganger i uken i 4 uker. Withaferin A ble injisert intraperitonealt ved oppløsning i 10% DMSO, 20% Cremophor-EL og 50% PBS ved 1, 4 og 8 mg /kg, 3 ganger i uken i 4 uker. Tumorvolumet ble registrert før magesonde ved hjelp calipers med volum = (bredde)
2 x lengde /2. Musene ble avlivet etter 4 ukers behandling og metastatisk lunge knuter ble talt under et dissekere mikroskop. For H E farging, lunge og primærtumor fra kjøretøy og sWRE-behandlede mus ble fiksert i 10% nøytral-bufret formalin, behandles i parafin, og delt på 5 um tykkelse. Representative kreft seksjoner fra kjøretøy kontroll, sWRE behandlet, og Withaferin A-behandlede mus ble behandlet for H E farging
Xenotransplantat mus brystkreft modell
Alle musestudier ble utført i samsvar med. vår godkjente Emory University Institutional Animal Care og bruk komité protokollen. Åtte uker gamle kvinnelige atymiske nakne Foxn1nu mus ble kjøpt fra Harlan og ligger i Winship Cancer dyremodeller anlegget. Musene ble holdt i grupper på fem per bur og matet med AIN76A kontroll diett og vann ad libitum. Mus ble delt tilfeldig inn i 7 grupper med 10 mus i hver gruppe og 10
6 MDA-MB-231 celler i PBS ble injisert subkutant inn i melkefettpute hos hver mus. En uke etter injeksjon, ble musene behandlet med bærer (9% etanol), bærer inneholdende sWRE ved 1, 4 og 8 mg /kg ved oral gavage, eller intraperitonealt injisert med Withaferin A oppløst i 10% DMSO, 20% Cremophor-EL og 50% PBS ved 1, 4 og 8 mg /kg 3 ganger i uken i 4 uker. Tumorvolumet ble registrert før sonde. Musene ble avlivet etter 4 ukers behandling og metastatisk lunge knuter ble talt under et dissekere mikroskop. For H E farging, lunge og svulst fra kjøretøy og sWRE-behandlede mus ble fiksert i 10% nøytral-bufret formalin, behandles i parafin og seksjonert på 5 um tykkelse. Representative kreft seksjoner fra kontroll og sWRE-behandlede mus ble behandlet for H . E farging
Statistical Analysis
Data ble analysert statistisk ved hjelp GraphPad Prism for Windows (versjon 5). Enveis ANOVA ble utført for å sammenligne den midlere av lunge knuter mellom forsøksgruppene. Lineær blandede effekter modellen ble brukt til å sammenligne gjennomsnittlig tumorvolum mellom gruppene. Verdier av p. 0,05 ble betraktet som signifikant
Resultater
WRE standardisering, oppløselighet, og Cytotoksisitet
WRE pulver ble oppløst i H
2o eller 90% etanol ( EtOH) ved forskjellige konsentrasjoner for å bestemme optimale betingelser for å standardisere WRE (sWRE) til den rene lite molekyl Withaferin A. konsentrasjonen av Withaferin A i hver sWRE formulering ble målt ved HPLC (figur 1A), og gjenvinningsgraden av Withaferin A etter solubulization var beregnet for hver prøve (figur 1B). Innholdet av Withaferin A i forhold til andre withanolides ved hjelp av HPLC, er vist i tabell 1. Når sWRE på 250mg /ml ble oppløst i vann, den Withaferin en gjenvinningsgrad på 4%. Den største prosentvise gjenvinning av Withaferin A i vann var 16%, observert ved en startkonsentrasjon på 10 mg /ml sWRE. I motsetning til dette, når WRE-pulver ble oppløst i 90% EtOH den Withaferin A utvinningsgraden varierte 80-92%. Disse resultatene viser at gjen oppløseliggjøring av sWRE i 90% EtOH er klart overlegen i forhold til den i H
2O. For å estimere den langtidsstabilitet av den WRE stamløsning i 90% EtOH, ble HPLC-analyse utført på WRE etter 6 og 12 måneders lagring ved -80 ° C. Resultatene viser at ca. 90% av den opprinnelige Withaferin A kan oppdages etter 6 måneder, og omtrent 80% etter 12 måneder (figur 1C, d).
sWRE pulver ble oppløst i forskjellige løsningsmidler og den konsentrasjon ( A) og utvinningsgrad (B) av Withaferin A i sWRE ble målt ved HPLC. Stabiliteten av Withaferin A i sWRE (90% EtOH stamoppløsning) over tid er vist i et stolpediagram med den absolutte (C) og relativ (D) Withaferin En konsentrasjon.
Withanolides
Konsentrasjon (mg /ml)
Andel (%)
Withaferin A5.8879.03Withanoside V0.3564.7812-Deoxywithastramonolide1.0614.25Withanolide A0.1361.83Withanolne0.01370.18Total Withanolides7.44100.00Table 1. withanolides i WRE ved HPLC.
CSV Last ned CSV
for å vurdere cytotoksisitet, ble brystkreftcellelinjer behandlet med økende konsentrasjoner av Withaferin A-standardisert WRE (sWRE) i 24 og 72 timer (figur 2A, B). Blant de seks cellelinjene som ble testet, fire (MDA-MB-468, HCC 1806, Hs587-T, og MDA-MB-231) er trippel negative brystkreft cellelinjer [45]. Siden Withaferin A er en vimentin-målsøkende middel [30,34], vimentin uttrykk sammen med andre EMT markører ble undersøkt i cellelinjene. To av de fire trippel negative cellelinjer (Hs578-T og MDA-MB-231) ble vimentin-positive og alle andre cellelinjer ble vimentin-negative. Disse vimentin positive cellelinjer også utstilt EMT induksjon siden de vises E-cadherin tap og var fibronectin positive (figur 2C). Interessant nok var forskjellig følsomhet overfor sWRE observert i de seks cellelinjer, hvor de to mest følsomme cellelinjer, Hs578-T og MDA-MB 231, var vimentin-positiv med en 72-timers IC
50 til 0,5 pm og 0.4μM henholdsvis (figur 2B). De vimentin-negative cellelinjer hadde IC
50-tallet som varierte fra 1.2μM til 4.0μM. For å undersøke dette, ble cytotoksisitetsassayer utført i isogen kontroll og vimentin siRNA utarmet MDA-MB 231 celler. I dette tilfellet, vimentin utarmet celler viser en liten nedgang i sWRE cytotoksisitet i forhold til isogene kontrollceller (figur 2D).
(A og B) linjediagram som viser% overlevelse av seks brystcancercellelinjer behandlet med økende konsentrasjoner av sWRE av 24 (A) og 72 (B) timene. (C) Western blot som viser EMT markører i forskjellige brystkreft linjer. Triple negative brystkreft cellelinjer er merket med en stjerne. (D) (til venstre) Western blot viser vellykket vimentin siRNA mangel (høyre) Cytotoxciity analysen bruker sWRE i isogen kontroll og vimentin siRNA utarmet celler.
sWRE hemmer brystkreft cellemotilitet og invasjon, og forstyrrer vimentin morfologi
Vi har tidligere vist Withaferin A hemmer brystkreft cellemotilitet og metastasering [35]; Derfor søkte vi å finne ut om sWRE viser anti-invasiv effekt. Effekten av sWRE på celle motilitet trippel negative brystkreftceller (humane MDA-MB-231 og mus 4T1) ble testet ved anvendelse av en sårtilheling assay. WRE inhiberer celle motilitet på en doseavhengig måte etter 24 timers behandling ved 0,5 pm i begge cellelinjer (figur 3A, B). En utvidet eksperiment ved lavere doser i MDA-MB 231 celler viser hemming av cellemotilitet 0.25 mikrometer i tillegg (Figur S1). Vi ønsket da å bestemme hvordan sWRE påvirker cellemotilitet når vimentin protein er fraværende. Dette forsøk ble først forsøkt på MCF7 og MDA MB 468 bryst carcinoma celler, som begge ikke har påvisbar vimentin ved western blotting; men i disse tilfellene ble cellene også ikke bevegelige, slik at eksperimentet ikke kunne utføres (data ikke vist). I stedet vi brukte lunge epitelcellelinje, BEAS-2B, som mangler vimentin (figur S1-B) og viser noen motilitet. sWRE hadde en 24 timers anti-proliferativ IC
50 av 2.9μM og en 48 timers IC
50 på 1,9 mikrometer (Figur S1-C). I en såret analyse, lavere doser av sWRE (0,125 til 1 mikrometer) under IC
50 hadde nesten ingen innvirkning på cellemotilitet (figur S1-D). Det var ikke før behandling med 2 mikrometer sWRE som er i nærheten av 24-timers anti-proliferativ IC
50, fikk vi observere vesentlig hemming av motilitet (figur S1-D).
(A og B) Cell såret assay i (A) MDA-MB-231 og (B) 4T1-celler som ble behandlet med økende konsentrasjoner av sWRE i 24 timer. (C og D) Linjediagram som viser graden av cellulær invasjon gjennom Matrigel innleiret i en Boyden kammer (C) MDA-MB-231 og (D) 4T1-celler som ble behandlet med økende konsentrasjoner av sWRE. (E) Confocal immunfluorescens avbildning av vimentin (grønn), aktin (rød), og DAPI (blå) i MDA-MB-231 celler behandlet med 9% EtOH kontroll, 0,5 pm eller 1.0μM sWRE.
anti-invasive aktivitet av sWRE ble testet ved bruk av en sanntids Matrigel invasjon assay i et Boyden kammer. sWRE var igjen i stand til å inhibere celle invasjon i begge cellelinjer ved doser så lave som 0.25μM i 4T1 og 0,5 pm i MDA-MB-231-celler (figur 3C, D). Disse resultatene viser at sWRE hemmer cellemotilitet og er anti-invasiv i trippel negative brystkreftceller.
Siden Withaferin A hemmer vimentin [30,34], vi utforsket om sWRE har lignende vimentin forstyrrende egenskaper. Vimentin immunfluorescens kontroll MDA-MB-231 celler viser at vimentin er i nettverk gjennom spindel-formet cytoplasma; imidlertid ved sWRE behandling (0,5 pm og 1.0μM) i 16 timer, ble cellene ikke som langstrakt og vimentin nettverk ble opphevet (figur 3E). I stedet, vimentin fremkommet som et perinukleært bunt i de fleste celler, som er lik virkningen av ren Withaferin A [35]. Videre sWRE ikke redusere de totale cellulære protein nivå inntil 48 timer med behandling (fig S2), noe som tyder på at dette ikke skyldes en defekt i total proteinsyntese. Derfor, basert på disse observasjonene konkluderer vi med at sWRE besitter også vimentin hemmende aktivitet ved lave doser.
sWRE hindrer TGFB-indusert EMT
Siden vimentin spiller en nøkkelrolle i EMT, ønsket vi å teste hvis sWRE kunne hemme EMT og EMT-indusert motilitet i brystkreft. For å teste dette, brukte vi MCF10A celler, der behandling med 4NG /ml TGFB forårsaker disse cellene til å gjennomgå EMT, som vurderes av en økning i mesenychmal markører vimentin og fibronectin, og tap av epitel markør, E-cadherin [8,9 ]. Disse dataene viser at sWRE hemmer MCF10A motilitet i en sårtilheling analysen med TGFB (figur 4C) ved doser lik de som brukes i 4T1 og MDA-MB-231cell linjer (figur 3). For å vurdere hvordan sWRE virkninger EMT, MCF10A-celler ble behandlet med TGFp i nærvær av sWRE eller Withaferin A. TGFp alene induserte vimentin og fibronectin proteinekspresjon og redusert E-cadherin proteinnivåer som indikerer vellykket EMT induksjon. I motsetning til dette, behandling med 500nM 500nM sWRE eller Withaferin A potent hemmet TGFp-indusert EMT ved å holde vimentin og fibronektin ved pre-induksjonsnivået og øker E-cadherin nivåer (figur 4A, B). For å finne ut om dette skjer på transkripsjonsnivået, ble real-time PCR av vimentin transkripsjon utføres og disse resultatene viste at TGFB økt vimentin mRNA som forventet, men sWRE påvirke ikke vimentin mRNA nivåer (Figur 4D), tilsvarende den som ble observert ved hjelp Withaferin A [30]. Derfor viser resultatene at sWRE ikke hemmer vimentin ekspresjon på mRNA-nivå, men snarere på proteinnivået.
(A) Western blot av vimentin i TGFβ1-stimulerte MCF10A celler behandlet med økende konsentrasjoner av sWRE. (B) Western blot av vimentin, fibronektin, og E-cadherin i TGFβ1 stimulerte MCF10A celler behandlet med 500nM sWRE eller Withaferin A. (C) Cellemigrering i sårhelende assay med økende konsentrasjoner av WRE. (D) Relative vimentin mRNA nivåer oppdaget av real-time PCR i TGFβ1-stimulerte MCF10A celler behandlet med 500nM sWRE eller WFA. (E) Live-celle time lapse bilder av MCF10A 3D kuler innebygd i Matrigel og stimulert med TGFβ1. Cell ble behandlet med 9% EtOH kontroll, eller 100 nM eller 500nM sWRE.
Disse studiene var flyttet inn i en spheroid modell av invasjonen for å finne ut om sWRE hemmer EMT-indusert invasjon. I denne modellen TGFfi indusert potent invasjon inn i Matrigel ekstracellulære matrise ved hjelp levende celle bildebehandling for å visualisere invasjonen (figur 4E, Movie S1); imidlertid ved behandling med doser så lavt som 100 nM sWRE, invasjonen var potent hemmet (figur 4E, Movie S2). Samlet utgjør disse resultatene viser at sWRE kan hemme EMT og EMT-indusert motilitet og invasjon.
sWRE in vivo toksisitet
For å studere anti-metastatisk effekt av sWRE
in vivo
ble sWRE toksisitet først vurderes i normal BALB /c mus. Mus ble gitt enten 4 eller 8 mg /kg sWRE i 9% EtOH og den midlere kroppsvektsøkning etter 35 dager i behandlede mus var ikke signifikant forskjellig fra kontrollgruppen som fikk 9% EtOH alene (figur 5A). Etter fire ukers behandling, ble det histologi av hjertet, lunge, lever, milt og nyre gradert for fibrose, nekrose og betennelse. Histologiske data viser ingen signifikant forskjell mellom sWRE-behandlede og kontrollgrupper kjøretøy (figur 5B, C).
(A) Relativ kroppsvekt hos mus behandlet med bærer, eller sWRE ved 4 mg /kg og 8 mg /kg. (B) Histologisk gradering av inflammasjon, fibrose og nekrose i organer fra mus behandlet med bærer (9% EtOH) eller sWRE på 8 mg /kg. (C) Representative bilder av H E farget histologiske snitt
sWRE anti-metastatisk effekt
For å bestemme anti-metastatisk effekt av sWRE og sammenligne den med Withaferin A i en. musemodell, mus brystkreft 4T1 metastatisk modell ble anvendt. Denne modellen utvikler metastatiske lesjoner i lunge, lever, milt og 4-6 uker etter injeksjon av celler inn i melkefettputen. Mus ble tilfeldig fordelt i 4 grupper med 10 mus i hver gruppe, og sWRE ble gitt ved oral gavage, og Withaferin A ved i.p. injeksjon på 1, 4 og 8 mg /kg 3 ganger per uke i 4 uker. Doseområdet ble valgt på grunnlag av den foregående sWRE toksisitet eksperiment i BALB /c-mus (figur 5). Ved alle doser, ble primærtumorvolumet ble redusert etter 36 dagers behandling med sWRE eller Withaferin A (figur 6A, B). Representative brutto eksemplarer av primærsvulster viser at både sWRE og Withaferin A behandlede tumorer var mindre (figur 6C). Viktigere, antall metastatiske lunge knuter betydelig redusert i både 4 og 8 mg /kg grupper i sWRE og Withaferin A-behandlede mus (figur 6D, E, og eksempler i figur 6G). H . E farging bekreftet tilstedeværelsen av mikrometastatiske lesjoner i lungen (figur 6F)
(A og B) Midlere tumorvolum hos mus behandlet med 1, 4, 8 mg /kg av (A) sWRE eller (B) Withaferin A (WFA) (* p 0,05 sammenlignet med kontroll). (C) Representative bilder av den primærtumor inn sWRE eller WFA behandlede mus. (D og E) Bar kurve som viser gjennomsnittlig antall metastatiske noduler i lungene (D) sWRE eller (E) WFA-behandlede mus (* p 0,05 sammenlignet med kontrollgruppe). (F) Representant H E fargings bilder som viser histologi av metastatiske knuter i mus lunge; to eksempler vist. (G) Representative bilder av lungemetastatiske knuter (svarte piler) i mus behandlet med kjøretøykontroll (9% EtOH) eller sWRE eller WFA på 8 mg /kg.
For ytterligere å teste anti-metastatisk effekt av sWRE, ble et lignende eksperiment ved bruk av en xenograft modell med humane metastatisk brystkreft MDA-MB-231-celler utført. Cellene ble injisert subkutant i melkefettpute av hunn atymiske nakne mus. Mus ble administrert sWRE ved oralt inntak og Withaferin A ved i.p. injeksjon i en konsentrasjon på 1, 4 og 8 mg /kg, 3 ganger i uken i 4 uker. Primær tumorvolum ble inhibert med sWRE ved 4 og 8 mg /kg doser.
