Abstract
Stress-induserbare transkripsjonsfaktorer spiller en sentral rolle i cellulære tilpasning til miljøet for å opprettholde homeostase og integritet av genomet. Aktivering av transkripsjonsfaktor 3 (ATF3) induseres ved en rekke av spennings og inflammatoriske tilstander og er overuttrykt i mange typer kreftceller. Imidlertid har molekylære mekanismene bak pleiotrope funksjonene ATF3 vært unnvikende. Her anvendes vi systemanalyse for å identifisere genom mål for ATF3 som enten er indusert av et alkyleringsmiddel metyl metansulfonat (MMS) eller overuttrykt i en prostata tumorcellelinje LNCaP. Vi viser at stress-indusert og kreft-assosiert ATF3 rekrutteres til 5,984 og 1,423 mål, henholdsvis, i det humane genom, 89% av de som er vanlig. Spesielt, er ATF3 mål høyanriket for ikke bare ATF /CRE motiver, men også bindingssteder på flere andre stress-induserbare transkripsjonsfaktorer som indikerer et omfattende nettverk av stressrespons faktorer i transkripsjonsregulering av målgener. Videre analyser av effektene av ATF3 knockdown på disse målene viste at stress-indusert ATF3 regulerer gener i metabolske veier, cellesyklus, apoptose, celle adhesjon og signale inkludert insulin, p53, Wnt, og VEGF veier. Kreft-assosiert ATF3 er involvert i regulering av distinkte sett av gener i prosesser såsom kalsiumsignalering, Wnt, p53 og diabetes veier. Spesielt, binder stressutløst ATF3 til 40% av p53 mål og aktiverer pro-apoptotiske gener som TNFRSF10B /DR5 og BBC3 /PUMA. Kreft-assosiert ATF3 derimot undertrykker disse pro-apoptotiske gener i tillegg til CDKN1A /p21. Til sammen våre data indikerer et omfattende nettverk av stress-induserbare transkripsjonsfaktorer og vise at ATF3 har motstridende, cellekontekstavhengige effekter på p53 målgener i DNA skade respons og kreftutvikling
Citation. Tanaka Y, Nakamura A, Morioka MS, Inoue S, Tamamori-Adachi M, Yamada K, et al. (2011) Systems Analysis of ATF3 i stressrespons og kreft avslører motstridende effekter på Pro-apoptotiske Gener i p53 Pathway. PLoS ONE 6 (10): e26848. doi: 10,1371 /journal.pone.0026848
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 15 august 2011; Godkjent: 04.10.2011; Publisert: 26 oktober 2011
Copyright: © 2011 Tanaka et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd til SK (18012015, 18055008, og 21590302) og et tilskudd til Y.T. (20510183) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Transkripsjonsfaktorer faktorer~~POS=HEADCOMP spiller viktige roller i tidsmessig regulering av genekspresjon i serum stimulering av humane celler [1], [2]. Cellular tilpasning til ulike miljøstressbetingelser er også regulert av transkripsjonsfaktorer som co-ordinately modulerer uttrykket av gener som er involvert i vedlikehold av mobilnettet homeostase og genetisk integritet. Et slikt system spiller en viktig rolle for ikke bare overlevelse av normale celler, men også motstanden av kreftceller til metabolske og genotoksiske påkjenninger. Et viktig skritt mot å forstå molekylære mekanismene bak stressresponser er identifisering av målgener av hver transkripsjonsfaktor. Studier i gjær ved anvendelse av genekspresjon profilering [3], [4] og mer nylig systemer analyse av kromatin immunoutfelling av transkripsjonsfaktorer [5] har avdekket et genom nettverk av transkripsjonsfaktorer som regulerer ekspresjon av gener som arrangerer cellesyklus, gentranskripsjon, proteinsyntese, og DNA-reparasjon i respons til MMS. I pattedyr, spiller p53 tumor suppressor en sentral rolle i DNA-skade reaksjon ved transkripsjonen kontroll av flere hundre gener [6], [7]. Viktigere er bare en liten del av p53 mål aktivert som under visse betingelser [8], noe som indikerer at enten bindingen av p53 til målene [9] – [11] eller trans-aktivering potensialet av p53-proteiner [12], [13] kan bli berørt av tilbehør molekyler.
ATF3 er medlem av ATF /CREB familie av basic-leucine glidelås (b-Zip) type transkripsjonsfaktorer [14] og er en svært allsidig spenning sensor for en rekke forhold herunder hypoksi, hyponutrition, oksidativt stress, ER stress og forskjellige genotoksiske påkjenninger [15], [16], så vel som inflammatoriske reaksjoner [17], [18]. ATF3 blir også aktivert av serum stimulering og nedstrøms av c-Myc [19], og er ofte over-uttrykt i forskjellige tumorer inkludert de av prostata [20], bryst [21] og Hodgkin lymfom [22]. Viktigere, har flere linjer med bevis indikerte en tett kobling mellom ATF3 og p53 signalveier. Således er ATF3 indusert nedstrøms for p53 på DNA-skade, og fungerer som en effektor av p53-mediert celledød [6], [23] – [25]. I tillegg forsterker ATF3 p53 ved direkte binding og hemme dens ubiquitilation, noe som tyder på at ATF3 kan modulere aktiviteten av p53 [26], [27]. Videre synes ATF3 for å gi en negativ feedback til p53-reaksjonsveien ved å nedregulere
TP53
genekspresjon [28], rekapitulere en tilsvarende tilbakemelding regulering av inflammatoriske cytokin-gener ved ATF3 [17]. Bekreftende slik negativ feedback modell, har en fersk studie viste at ATF3 er indusert av Cyclosporin, en immun Lyddemper, og fremmer hudkreft ved å nedregulere
TP53 product: [29]. Samlet utgjør disse studiene tyder på at ATF3 samhandler med p53 vei både som en nedstrøms effektor av p53-mediert celledød og som en positiv og negativ regulator av p53 signal.
Endring i samspill mellom ATF3 og transkripsjonsfaktorer slike som p53 i forskjellige typer av celler og /eller omgivelsestilstander kan delvis står for forskjellige effekter av ATF3 på celle skjebne (dvs. pro-apoptotiske eller vekstfremmende for ikke-transformerte celler eller malignantly transformerte celler, henholdsvis) [21]. Tidligere arbeid fra vårt laboratorium har også beskrevet pleiotrope funksjoner av ATF3 under forskjellige stressbetingelser [18], [19], [25], [28], [30]. Her gjennomførte vi systemer analyse av ATF3 mål og identifisert tusenvis av ATF3 bindingssteder i genomet. Vi viser at ATF3 utgjør en omfattende overlapp gennettverk med andre stress-induserbar transkripsjonsfaktorer og regulerer cellesyklus, celledød, heft, og flere signalveier inkludert p53. Spesielt ATF3 binder seg til 40% av kjente mål av p53 og regulerer apoptotisk celledød gjennom co-aktivering av en undergruppe av pro-apoptotiske gener stressrespons mens undertrykke de samme målene i kreftceller konstitutivt uttrykker ATF3. Mulige koblingsmekanismer mellom pro-overlevelse og pro-apoptotiske ATF3 funksjoner vil bli diskutert.
Resultater
Systemanalyse identifiserer tusenvis av ATF3 mål i det menneskelige genom
For å identifisere genomisk mål for ATF3 ble kromatin immunpresipitasjonsanalyse utføres ved hjelp av HCT116 humane tykktarmskreft cellelinje stimulert av MMS og LNCaP prostatakreft cellelinje som konstitutivt uttrykker ATF3. Som rapportert tidligere [24], MMS behandling av HCT116-celler indusert forbigående ekspresjon av ATF3 nådde en topp ved 6 timer etter stimuleringen (fig. 1A), mens økte nivåer av ATF3 proteiner ble detektert etter 3 timer og nådde et maksimum ved 12 timer av stimulering (fig. 1B). Genomisk DNA ble fremstilt fra enten HCT116-celler behandlet med MMS i 6 timer eller ubehandlede LNCaP celler, immunoutfelt med anti-ATF3 antistoffer, og hybridisert til NimbleGen menneskelige RefSeq HG18 promoter flislegging arrays. Deretter ble toppdeteksjon utføres ved hjelp av modell-basert Analyse av to-farge Arrays (MA2C) pakke [31], som viste et uventet stort antall av ATF3 mål på en cut-off på 0,2% FDR (fig. S1A og S1B) . Vi identifiserte 5,984 og 1,423 målene for ATF3 i MMS-behandlede HCT116-celler og LNCaP-celler, henholdsvis, 1,269 (det vil si 89%) som ble skåret mellom de to modellene. (Fig. 1C). Vi oppdaget ingen mål på Y-kromosomet fra HCT116 samsvar med sin kvinnelige opprinnelse. Vi har også med hell identifisert tretten ATF3 mål som tidligere var blitt vist å være regulert av ATF3 i forskjellige celletyper.
(A) RT-PCR-analyse av ATF3 i HCT116-celler behandlet med 50 ng /ml MMS. (B) Western blot-analyse av proteiner ATF3 i MMS-behandlede HCT116-celler. (C) Vanlige og unike mål for ATF3 i HCT116-celler og LNCaP celler.
Motiver av stressrelatert transkripsjonsfaktorer er overrepresentert i ATF3 mål
ATF3 kan bli rekruttert til sine mål, enten ved direkte binding til en konsensus gjenkjennelsessekvens TGACGTCA eller alternativt ved å interagere med andre transkripsjonsfaktorer, inkludert et stort antall av b-Zip-proteiner [14], [32]. For å vurdere om ATF /CRE motiv eller andre transkripsjonsfaktor motivene er anriket blant potensielle ATF3 mål, ble antallet av promotorer i ATF3 målene inneholdende minst ett treff i en gitt motiv i TRANSFAC databasen analysert ved P-Match algoritme (fig. S2). Tabell 1 oppsummerer anrikning av et gitt motiv som representert ved antall aktivatorer i ATF3 målene inneholdende motiv trekkes med antall aktivatorer i en bakgrunn gen sett inneholdende det samme motiv. Som forventet, ATF /CRE bindingssteder var de mest beriket motivene i ATF3 mål (
p
-verdi for HCT116-spesifikke mål: 3,76 × 10
-40 til 4,34 × 10
-22,
p
-verdi for felles mål for HCT116 og LNCaP celler: 0 til 4,20 × 10
-6). Videre fysiske avstanden mellom predikerte ATF /CRE sekvensene av motiv skanne og ATF3 toppene av chip analysen var innenfor et område på noen få hundre basepar (dvs. nær oppløsningen av chip analyse) for de fleste av ATF3 mål (Fig . 2). Derimot, var det ingen slik sammenheng mellom urelaterte BRCA1 og GATA1 motiver og ATF3 topper (fig. 2). Samlet utgjør disse dataene sterkt at flertallet av ATF3 toppene av chip analyse kan forklares ved direkte binding av ATF3 til ATF /CRE motiver.
Fordeling av fysisk avstand mellom ATF /CRE, BRCA1 og GATA1 motiver på ATF3 mål fra ATF3 topper identifisert av Chip analyse. ATF3 toppene i stor grad sammenfallende med ATF /CRE motiver, men viser ingen sammenheng med urelaterte BRCA1 og GATA1 motiver.
Forbløffende motivet skanning avslørte også at bindingsstedene for andre stress-induserbare transkripsjonsfaktorer var sterkt overrepresentert i ATF3 mål som svar på DNA-skade (tabell 1). Disse inkluderte store regulatorer av ER stress (DDIT3, NF-E1), hypoksi (HIF-1A), UV stresset (USF2, RFX1), oksidativt stress (c-Ets), og DNA-skader (NF-Y, E2F, EGR- 1, FOXJ2, SP1). Av notatet, medlemmer av b-Zip familien (AP-1, DDIT3, og USF2) har et potensial til å heterodimerize med ATF3 [33] og SP1 har blitt rapportert til fysisk samhandle med ATF3 [34]. Det er derfor mulig at ATF3 rekrutteres til en undergruppe av sine mål indirekte gjennom samarbeid med andre stress-induserbare transkripsjonsfaktorer.
ATF3 regulerer ulike biologiske prosesser i stressresponsen og i kreft
Etter å ha etablert potensielle mål av ATF3 i genomet, neste vi forsøkte å identifisere de gener som uttrykk er regulert av ATF3. For å oppnå dette, vurdert vi virkningen av ATF3 knockdown etter siRNA (fig. 3A) på genuttrykksmønster på 0, 6, 12 og 24 timer etter stimulering av MMS Agilent Antall Human Genome Microarray. Etter normalisering av rekker ved bruk av en gruppe av huset holde gener (fig. S3A), to tredjedeler av gener (dvs. 28,872 prober av 43 925) ble funnet å bli uttrykt over bakgrunnsnivåene i HCT116-celler (fig. S3b). I motsetning til dette ble 90% av ATF3 målene uttrykt over bakgrunnsnivået, noe som tyder på at ATF3 fortrinnsvis assosierer med aktivt transkriberte gener. På et globalt nivå, sammenligning av signaler (log
2 ratio) mellom kontroll og knockdown-celler viste en begrenset effekt av ATF3 nedregulering på transkriptomet (Fig. S3b og S3C).
(A) HCT116 cellene ble transfektert med enten siRNA for ATF3 (siATF3) eller kryptert siRNA (siControl) og behandlet med MMS til 0, 3 og 6 timer. Mengden av ATF3 proteiner ble analysert ved hjelp av Western blot med β-actin som en lasting kontroll. MMS induserer ATF3 3 og 6 timer etter stimuleringen, noe som er betydelig blokkert av siATF3. (B) Heat kartet representasjon av genuttrykk nivåer på 0, 6, 12 og 24 timer etter MMS stimulering for kjente mål for ATF3 (øvre panel) eller transkripsjonsfaktorer som bindende motivene er over-representert i ATF3 mål (nedre panel). Signaler er normalisert mot de på tidspunkt 0 av siControl og relative nivåer eller forholdet mellom siATF3 /siControl er fargekodet fra 2
-2,5 til 2
2,5.
Videre analyser av chip -identified mål for ATF3 indikerte at uttrykket av 6-30% gener ble påvirket av ATF3 knockdown under 0,8 ganger eller over 1,2 ganger på forskjellige tidspunkter etter MMS stimulering. For å identifisere biologiske prosesser regulert av ATF3, ble veien kartlegging utført ved hjelp av DAVID [35] for en undergruppe av ATF3 mål enten ned- eller opp-regulert av ATF3 knockdown (modifisert Fishers eksakte test
p
-verdi 0,1). Som oppsummert i tabell 2, ble stressindusert ATF3 assosiert med diverse cellulære prosesser som metabolske veier (sukkere, aminosyrer, lipid), anabolske og katabolske prosesser (steroid og folat biosyntese, ubiquitilation, ureasyklus), energiproduksjon (TCA syklus , oksidativ fosforylering), cellesyklus, apoptose, vedheft, cytoskjelettet, og signalveier (ErbB, p53, insulin, Wnt, VEGF).
Neste, for å identifisere potensielle mål av ATF3 i kreft-assosiert ATF3, gjennomførte vi ATF3 knockdown og uttrykk profilering ved hjelp av LNCaP celler (fig. S4). Pathway kartlegging analyse av genet undergrupper enten nedregulert ( 0,8-fold) eller oppregulert (mer enn 1,2 ganger) av knockdown av ATF3 er oppsummert i tabell 3. konstitutivt uttrykt ATF3 i LNCaP-celler så ut til å være involvert i biologisk prosesser heller forskjellige fra de i stressresponser, inkludert celleadhesjon, diabetes mellitus, og signalering (ErbB, p53, Wnt, kalsium) med lite krets med metabolske prosesser. Tatt sammen indikerer disse data at metabolske veier, cellesyklus, apoptose, og insulin og VEGF-signalering er unike mål av stress-indusert ATF3, mens diabetes mellitus og kalsiumsignalisering, men ikke cellesyklus og apoptose, er unike mål for ATF3 uttrykt i kreftceller. Potensialet koblingen mellom ATF3 og diabetes sti som finnes i vår studie er i samsvar med en fersk studie som viser at ATF3 aktivert i vektige adipose celler bidra til insulinresistens gjennom nedregulering av adiponectin og en glukosetransportør GLUT4 [36].
DNA-skader indusert ATF3 aktiverer en undergruppe av pro-apoptotiske gener av p53 pathway
Identifikasjon av p53 sti som et potensielt mål for ATF3 bedt oss om å ytterligere analysere regulering av p53 målgener ved ATF3 . Først analyserte vi hvordan mange av tidligere kjente p53 mål [6] er også mål for ATF3 i vår ChIP analysen. Vi fant at stress-indusert ATF3 ble rekruttert til så mange som 40% (dvs. 97/244) av p53 mål, noe som tyder på for første gang at en stor andel av p53 mål kan være transcriptionally co-regulert av ATF3. Deretter vurderte vi virkningen av ATF3 knockdown på ekspresjon av de vanlige mål for ATF3 og p53 ved forskjellige tidspunkter etter stimulering av HCT116-celler med MMS. Som illustrert ved hjelp av varme kartet i fig. 4A (forholdet mellom signaler i siControl og siATF3), de fleste av dem er litt nedregulert ved ATF3 knockdown inkludert pro-apoptotiske gener som BBC3 /PUMA, TNFRSF10A /DR4 og TNFRSF10B /DR5.
(A) Heat kart representasjon av genuttrykk nivåer på 0, 6, 12 og 24 timer etter MMS stimulering for felles mål for ATF3 og p53. Signaler er normalisert mot de på tidspunkt 0 av siControl og relative nivåer eller forholdet mellom siATF3 /siControl er fargekodet fra 2
-2,5 til 2
2,5. Gener er gruppert i henhold til uttrykk mønstre etter MMS stimulering: en, sterkt aktivert; b, sterkt undertrykt, c, svakt aktivert; d, blandet; e, svakt undertrykt. De fleste gener er svakt nedregulert ved ATF3 knockdown, mens DNMT1 er et unntak som er oppregulert ved ATF3 knockdown. (B) Kvantitativ RT-PCR analyse av ATF3 og pro-apoptotiske mål av p53. Uttrykk nivåer i siATF3-transfekterte celler (hashed barer) er angitt i forhold til de som har kontroll (åpne søyler). (C) Fasekontrast mikrofotografi av HCT116-celler etter behandling med 50 ng /ml MMS i 12 timer i nærvær av siControl eller siATF3. (D) Antall levende HCT116-celler etter behandling med 50 ng /ml MMS for 0, 8, 12 og 24 timer i nærvær av siControl (åpne sirkler) eller siATF3 (lukkede sirkler). (E) Aktivering av Caspase 3 som målt ved dens spaltede produkter. HCT116-celler ble transfektert med siControl eller siATF3 og behandlet med 50 ng /ml MMS til 0, 3, 6 og 12 timer. Hele celle ekstrakter ble utsatt for Western blot analyse ved hjelp av antistoffer mot ATF3, β-aktin, caspase 3, og kløyvet caspase 3. Arrowhead viser kløyvde caspase 3 av den anslåtte molekylvekt.
For ytterligere å vurdere funksjon av ATF3 i p53 target genekspresjon, gjennomførte vi kvantitativ RT-PCR analyse av pro-apoptotiske gener i MMS-stimulerte celler pre-transfektert med enten kontroll siRNA eller siATF3. Som vist på fig. 4B, ATF3 knockdown forårsaket betydelig redusert induksjon av TNFRSF10A /DR4, TNFRSF10B /DR5, og BBC3 /PUMA av MMS behandling. Neste vi analysert virkningene av ectopically uttrykt ATF3 på p53 målgener ved hjelp av luciferase journalister husing proksimale arrangører med en ATF /CRE motiv som vist i fig. 5A. Co-transfeksjon av HCT116-celler med luciferase journalister og ATF3 ekspresjonsvektorer resulterte i betydelig aktivering av TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, og DDIT4 (Fig. 5B), i samsvar med microarray data som viser at ATF3 knockdown forårsaket dempet uttrykket av disse genene (fig. 4A). I motsetning til dette vimentin-genet, som ble undertrykt av MMS-behandling (fig. 4A), ble ikke signifikant aktivert ved ektopisk ekspresjon av ATF3 (Fig. 5B).
(A) DR5-luciferase reporter konstruksjon innehold en DR5 promoter fragment fra -1226 (PstI stedet) 1 (august kodon) som ble subklonet inn PicaGene PGV-B2. ATF /CRE motiver (ATF) og p53 motiv (p53) er angitt. (B) Tvilling luciferaserapportørplasmid analyser for TNFRSF10B /DR5, GADD45A, BBC3 /PUMA, DDIT4, og VIM. HCT116-celler ble transfektert med hver reporter og stimulert med 50 ng /ml MMS i 12 timer. Ildflue luciferase-aktiviteten ble normalisert med CMV-Renilla luciferase-aktivitet. (C) Dual luciferase assay ved hjelp av hvete eller ATF3
– /-. Mus embryonale fibroblaster (MEF)
Å belyse funksjon ATF3
in vivo
, vi tok fordel av ATF3-mangelfull mus nylig etablert i vårt laboratorium ([37]). Muse embryonale fibroblaster ble transfektert med DR5-luciferase reportere og stimulert med MMS. Interessant, tap av ATF3 forårsaket betydelig redusert nivå av basal DR5 promoter-aktivitet som vist i fig. 5C, noe som tyder på at basal DR5 uttrykk var avhengig ATF3. Videre MMS-indusert aktivering av DR5-promoteren ble ca. redusert til det halve i ATF3
– /- celler sammenlignet med villtype-celler, noe som tyder på at DNA-skade-indusert aktivering av DR5 var delvis avhengig av ATF3. Til sammen disse taps og få-of-funksjon studier viser at ATF3 aktiverer velger målene av p53.
DNA-skader indusert ATF3 sensitizes celler til celledød
For å vurdere biologiske betydningen av kryss -Snakk mellom ATF3 og p53, vi neste analyserte effekten av ATF3 knockdown på celleviabilitet etter stimulering med MMS. Som vist på fig. 4C og 4D, var det et større antall HCT116-celler transfektert med siATF3 enn de som er transfektert med kontroll siRNA etter MMS behandling. En slik forskjell i celleantall kunne reflektere enten økt cellevekst eller minsket celledød. For å løse dette problemet, analyserte vi aktivering av caspase 3, et kjennetegn på apoptotisk celledød ved Western blot. Som vist på fig. 4E, knockdown av ATF3 forårsaket reduksjon i aktivering av Caspase 3 som bedømt ved fremstilling av spaltede Caspase 3. Disse data er i overensstemmelse med ATF3-mediert aktivering av pro-apoptotiske gener (fig. 4B, fig. 5), og tyder sterkt på at DNA skade-indusert ATF3 bidrar til stress-fremkalt celledød ved ko-aktivere en undergruppe av p53 målgener.
kreft-assosiert ATF3 fremmer celleproliferasjon og inhiberer apoptose
Interessant nok knockdown av ATF3 i LNCaP-celler forårsaket økning i p21-proteiner (fig. 6a) samtidig med reduksjon av cellevekst (fig. 6B). Disse funn er i overensstemmelse med tidligere rapporter som tyder på en rolle ATF3 i celleproliferasjon i kreft [20], [22], [38] og c-Myc-indusert cellevekst [19]. I tillegg har dagens analyse av ATF3 regulert baner i LNCaP-celler (tabell 3B) indikerte at så mange som 13 gener i p53-reaksjonsveien kan bli aktivert av ATF3. For å vurdere effekten av ATF3 på p53-mediert celledød, gjennomførte vi kvantitativ RT-PCR analyse av pro-apoptotiske gener i p53 veien. Som illustrert i fig. 6C, ATF3 knockdown forårsaket oppregulering av FAS, TNFRSF10B /DR5, BBC3 /Puma, og CASP10 samt CDKN1A /p21, noe som tyder på at ATF3 regulerer negativt p53-indusert celledød og forbedrer celleproliferasjon gjennom inhibering av p21-ekspresjon.
(A) Western blot-analyse av ATF3 og p21 i LNCaP-celler transfektert med siControl eller siATF3 med β-actin som en lasting kontroll. (B) Antall levedyktige celler ved 0, 3 og 5 dager etter transfeksjon med siControl (åpne sirkler) eller siATF3 (lukkede sirkler). (C) Kvantitativ RT-PCR-analyse av pro-apoptotiske gener i p53-reaksjonsveien og p21 etter transfeksjon. Nivåene av uttrykk i siATF3 (hashed barer) i forhold til de i siControl (åpne søyler) er angitt.
Diskusjoner
Vi viste at DNA-skader indusert ATF3 binder seg til nesten en tredjedel av den menneskelige RefSeq arrangører. Identifikasjon av et så stort antall av mål er ikke enestående, ettersom E2F1 og MYC er kjent for å bli rekruttert til 20.000 og 17.000 mål, henholdsvis i det humane genom [39], og gjær INO4 har blitt rapportert å binde seg til 1,078 mål ved MMS stimulering [5]. Antallet mål for kreft-assosiert ATF3 var mindre enn den for DNA-skade-indusert ATF3, kanskje skyldes både høyere og høyere fold-induksjon av ATF3 i MMS-respons enn de som oppnås ved knockdown av ATF3 i LNCaP-celler (data ikke vist) . Ikke desto mindre, analysen var bemerkelsesverdig konsekvent siden 89% av mål i LNCaP-celler ble også funnet i MMS-behandlede HCT116-celler, og elleve av 41 tidligere kjente ATF3 mål inkludert EGR1 [40] og HIF-2A [30] kan bli identifisert. En undersøkelse av ATF3 ChIP-Seq data av KODE database (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeHaibTfbs/) indikerer også at betydelige andeler av ATF3 mål, det vil si 37,6% (768/2041 ) i K562 (leukemi), 71,9% (742/1032) i HepG2 (leveren), og 76,2% (809/1062) i H1-hESC (embryonale stamceller), deles med 2711 mål i GM12878 (lymfoblastoid), som kan anses som konservative tall gitt variasjoner chip-seq datakvalitet (som påvirker følsomheten toppdeteksjon) og forskjell i vevstyper.
Spesielt bindinger nettstedene til flere andre transkripsjonsfaktorer forårsaket av DNA-skader (NF- Y, E2F, YY1 /NF-E1, FOXJ2, SP1), UV-bestråling (USF2, RFX1), og oksidativt stress (c-Ets) var betydelig overrepresentert i ATF3 målene (tabell 1) indikerer et omfattende nettverk av disse spenning responsfaktorer (fig. S6). En mulig forklaring på en slik sammentreff av stressrelaterte transkripsjonsfaktorer er at ATF3 kan virke synergistisk med disse transkripsjonsfaktorene til å modulere mål genekspresjon. Alternativt kan ATF3 mål identifisert av Chip analyse inkludere indirekte binding av ATF3 gjennom interaksjon med andre stress-indusert transkripsjonsfaktorer. Faktisk er ATF3 et medlem av en stor familie av bzip typen transkripsjonsfaktorer, inkludert de som er identifisert i denne studien (dvs. AP-1, DDIT3, og USF2), som danner homo- og hetero-dimerer med forskjellige affiniteter til varianter av konsensus ATF /CRE motiv [32]. I tillegg er Sp1 i den aktuelle analysen er kjent for å fysisk samvirker med ATF3 [33], [34]. Videre studier vil være nødvendig for å avgjøre hvilken rolle stress-induserbare transkripsjonsfaktorer, spesielt de som ikke har vært kjent for å samhandle med ATF3 før, i binding av ATF3 å målrette gener.
Den aktuelle studien indikerer at virkningen av ATF3 på hvert mål genuttrykk er ikke alt eller ingen effekt. Snarere effekter av ATF3 på mange, men utvalgte gener, slik som de som er involvert i cellesyklus og celledød, kollektivt utgjør biologisk signifikant resultat som celledød for ATF3 i stressrespons (fig. 4C-E) eller cellevekst for cancer-assosiert ATF3 (fig. 6B). Dessuten viser våre knockdown studie at bare 6-30% av de potensielle mål av ATF3 var direkte regulert av ATF3 i tråd med tidligere rapporter som viser at bare 25% av p53 mål [6], 26% av STAT1 mål [41], og 11% av gjær transkripsjonsfaktorer målene påvirkes av genet knockdown [5]. Flere mekanismer har blitt foreslått for p53 å forklare hvorfor bare en undergruppe av potensielle mål svare på manipulasjoner av p53 inkludert epigenetiske tilstander av målgener, promoter belegg med RNA polymeraser, og rekruttering av viktige co-faktorer [42]. Lignende mekanismer kan være ansvarlig for gen-selektive effekter av ATF3. Alternativt, flere former for ATF3 komplekser som hetero dimer med forskjellige bzip proteiner, kan ligge til grunn for ulike effekter av ATF3 på målgener.
I de siste årene har et økende antall studier har indikert at ATF3 har pleiotrope funksjoner avhengig celle sammenheng. Viktigere, vår studie viste at stress-indusert ATF3 og kreft-assosiert ATF3 har motstridende effekter på p53 og Wnt trasé: p53 pathway er aktivert i stressrespons (Fig. S5) i samsvar med funksjonen til ATF3 i p53-mediert celledød [6 ], [23] – [25], mens Wnt pathway er aktivert i kreft som tidligere rapportert i en studie på ATF3 transgene mus utvikler brystsvulster [43]. Man kan argumentere for at forskjellen i genetiske bakgrunn og /eller vevstyper mellom HCT116-celler og LNCaP celler kan ha påvirket funksjon ATF3. Faktisk synes ATF3 å spille forskjellige roller i ulike vev: ATF3 fungerer som en tumor suppressor i tykk- og endetarmskreft [24], [44] mens det er onkogene i prostata kreft [20], mammary kreft [21], hudkreft [29] og Hodgkins lymfom [22]. Våre funn i HCT116-celler (colon) og LNCaP celler (prostata) er konsistent med en slik hypotese.
Endringer av regulerende funksjon av ATF3 fremheves av våre funn at ATF3 er nødvendig for både aktivisering og undertrykkelse av pro -apoptotic gener som BBC3 /PUMA og TNFRSF10B /DR5 i stressrespons og kreft. Av notatet, har motstridende effekter av ATF3 på cyclin D1 uttrykk tidligere blitt dokumentert: ATF3 bindes til AP-1 motiv og aktiverer cyclin D1 i mitogenstimulerte muselever-celler [45], mens det binder seg til ATF /CRE stedet og undertrykker cyclin D1 i musefibroblastere stimulert av serum [46]. I litteraturen er det rikelig med presedens av transkripsjonsfaktorer som har kontekstavhengig motstridende funksjoner på kreftutvikling ([47] og referert til i disse). KLF4, for eksempel, aktiverer p21 og p53 undertrykker begge er undertrykket ved hjelp av aktiverte Ras fører til vekststans i fravær av Ras eller transformerende fenotype i nærvær av Ras. Alternativt har en fersk studie vist at Kruppel-lignende faktor 5 (KLF5) er nødvendig for MYC transkripsjon i prolifererende epitelceller men er avgjørende for TGFb-mediert undertrykkelse av MYC [48]. Differensiell binding av KLF5 til TGFp hemmende element i nærvær eller fravær av TGFp ble foreslått som en mekanisme av de motsatte virkninger. Videre studier vil være nødvendig for å avgjøre om kombinasjoner av ATF3 og andre transkripsjonsfaktorer kan bytte funksjonen for ATF3 på spesifikke mål.
Resistance av kreftceller til ulike stressbetingelser forblir en viktig sak. Men vår kunnskap om rollen til cellulær stressrespons machineries i kreft motstand mot hypoksi [49] eller kjemoterapeutika [50] er fortsatt begrenset. Våre funn som ATF3 har motstridende effekter på pro-apoptotiske gener tyder på at man må passe på å enten forsterke eller blokkere funksjonen av ATF3 i en ny tilnærming til kreftbehandling. Ytterligere forståelse av brytermekanismen av ATF3 funksjon som en transkripsjonen aktivator eller repressor kan bidra til utvikling av strategier for selektivt å manipulere en undergruppe av ATF3 målgener for å bistå ved behandling av kjemoterapi-resistente kreftformer.
Materialer og Metoder
Etikk uttalelse
Alle dyr arbeidet ble godkjent og gjennomført i henhold til retningslinjene i komiteene av dyreforsøk og rekombinant DNA Eksperimenter av Tokyo Medical and Dental University (Lisens nr 2010-205).
Plasmider
luciferase journalister for DR5 [51], GADD45A [52], PUMA [53], og vimentin [54] var snill gaver fra Dr. Toshiyuki Sakai (Kyoto Prefectural University, Japan), Dr. Kazuhiro Daino (National Institute of Radiologisk Sciences, Japan), Dr. Jian Yu (The Johns Hopkins Oncology Center, USA), og Dr. Susan Rittling (The Forsyth Institute, USA), henholdsvis. Den DR5 luciferase reporter ble rekonstruert ved subkloning en DR promoter fragment fra Pstl (-1226) til august kodon inn PicaGene PGV-B2 vektor (Toyo B-Net Co., Ltd, Japan). PCI-ATF3 ekspresjonsvektor ble tidligere beskrevet [55].
Cellekultur
Menneskelige kolorektal karsinom HCT116-celler og prostatakarsinom LNCaP-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (USA). Førtiåtte timer før stimulering av MMS, ble kulturmediet av HCT116-celler erstattet med medium inneholdende 0,25% FCS. Tjuefire timer senere ble HCT116-celler transfektert med enten kontroll siRNA eller siATF3 ved hjelp av X-tremeGENE siRNA Transfeksjon Reagens. ON-TARGETplus siRNA SMART bassenget fra Dharmacon ble brukt for knockdown av ATF3.
