Abstract
prostatakreft-genet 3 (
PCA3
) er innebygd i et intron av et annet gen
BMCC1 plakater (Bcl2- /adenovirus E1B nitten kDa- samspill protein 2 (BNIP-2) og Cdc42GAP homologi BCH-motivet holdig molekyl ved karboksyterminale region 1) som også er oppregulert i prostata kreft. BMCC1 ble opprinnelig kommentert som to gener (
C9orf65 /PRUNE
og
BNIPXL
) på hver side av PCA3 men våre data antyder at det representerer et enkelt gen som koder for et protein med høy molekylvekt. Her viser vi for første gang ekspresjonen av et 300 kDa BMCC1 protein (BMCC1-1) i prostata cancer og melanom-cellelinjer. Dette proteinet ble funnet eksklusivt i den mikrosomale fraksjon og lokalisert til cytoplasmatiske vesikler. Vi har også observert uttrykk for BMCC1 protein i prostatakreft seksjoner ved hjelp immunohistologi. GST trekke ned, immunoutfellingsstudier og massespektrometri protein interaksjonsstudier identifiserte flere medlemmer av Adaptor Related Complex 2 (AP-2) som BMCC1 interactors. I overensstemmelse med en rolle for BMCC1 som en AP-2 samspill endosomale protein, BMCC1 samlokalisert med β-adaptin ved perinukleære region av cellen. BMCC1 viste også delvis samlokalisering med tidlig endosomet lite GTP-ase Rab-5 samt sterk samlokalisering med internalisert puls-chase merket transferrin (Tf), som gir bevis for at BMCC1 er lokalisert til funksjonelle endocytiske vesikler. BMCC1 knockdown påvirket ikke Tf opptak og AP-2 knockdown ikke spre BMCC1 vesikulært fordeling, unntatt en viktig rolle for BMCC1 i kanonisk AP-2 mediert endocytic opptak. I stedet posit vi en ny rolle for BMCC1 i post-endocytic menneskehandel. Denne studien gir grunnleggende karakterisering av BMCC1 kompleks i prostatakreftceller og for første gang impliserer det i vesikkel trafficking
Citation. Harris JL, Richards RS, Chow CWK, Lee S, Kim M, Buck M, et al. (2013) BMCC1 Er en AP-2 Associated endosomal Protein i prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (9): e73880. doi: 10,1371 /journal.pone.0073880
Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA
mottatt: 05.02.2013; Godkjent: 23 juli 2013; Publisert: 06.09.2013
Copyright: © 2013 Harris et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble finansiert av Prostate Cancer Foundation of Australia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en vanlig diagnostisert kreft og en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Denne tilstanden viser et bredt spekter av histologiske endringer og atferd, alt fra premaligne lesjoner, til lokaliserte prostata kreft som følger en lat kurs til en prosentandel av kreft som metastasize tidlig og utvikle seg raskt [1]. Derfor, i tillegg til utvikling av forbedrede diagnostiske og prognostiske redskaper, er en detaljert forståelse av cellebiologi av prostatakreft utvikling og progresjon er nødvendig. En av de mest lovende biomarkører for prostatakreft er den ikke-kodende RNA PCA3 [2,3]. Dette RNA ble identifisert som en prostatakreft biomarkør ved differensial visning analyse av RNAer fra histologisk normalt og ondartet vev fra samme pasient, og ble opprinnelig beskrevet som Differential Display klon 3 (DD3) [2]. Høye nivåer av PCA3 uttrykket er sterkt assosiert med malign transformasjon av prostata epitel, men det biologiske grunnlaget for denne sammenhengen er ikke klarlagt [2-4].
Vi har tidligere vist at
PCA3
er innebygd i intron av et annet gen,
BMCC1 product: [5].
BMCC1
ble opprinnelig kommentert som to atskilte gener
c9orf65 /PRUNE plakater (koding for N-terminal region) og
BNIPXL plakater (koding for C-terminal region). En
BNIPXL product: (
BMCC1-4
) åpen leseramme ble identifisert av databasen søke etter homologer til BCL-2 samhandlende protein BNIP-2 [6]. Forfatterne identifiserte
BNIPXL /BMCC1-4
som et gen med et område med høy
BNIP-2
homologi, og kalte den homologe regionen BCH (BNIP-2 /Cdc42GAP homologi) domene [ ,,,0],6]. Ved hjelp av eksogent uttrykt tagget BNIPXL proteiner, viste de at det samhandler med RhoA og dens aktivator proto-Lbc [6]. Koekspresjon og interaksjonsstudier vist at BNIPXL binder RhoA og proto-Lbc via ulike regioner og at BNIPXL uttrykk blokker RhoA signalering, i det minste delvis ved å hemme den stimulerende RhoA-Lbc interaksjon [6]. Machida et al. [7] identifisert en lengre isoformen av BMCC1 i human neuroblastom (BMCC1-3), som strakte koding eksoner 7-19 senere identifisert BMCC1-1. Høye nivåer av uttrykk for denne transkripsjon ble korrelert med en mer gunstig prognose for denne kreftformen. Bevis for uttrykket av full lengde BMCC1-1 transkripsjon spenner over
c9orf65 Hotell og
BNIPXL
gener ble gitt av Iwama et al. [8], som klonet en full-lengde cDNA fra Hela celler. I denne studien og senere, har BMCC1 transkripsjoner blitt oppdaget i avgrensede områder av mus hjernen [8,9]. Clarke et al. [5] viste at BMCC1 RNA-ekspresjon er forhøyet i prostata cancer og metastaser sammenlignet med benign vev, hvilket indikerer at BMCC1 kan virke forskjellig på forskjellige kreftformer og vevstyper. En oversikt over BMCC1 isoform uttrykk og de ulike funksjonene i BCH domene som inneholder proteiner er gitt i nyere publikasjoner [10,11].
Første identifikasjon av et protein som tilsvarer BMCC1-1 ble demonstrert av Iwama et al. [8]. Denne gruppen hevet et antistoff som er spesifikt til det ytterste N-terminale område av BMCC1-1, og selv om flere bånd ble påvist ved Western blot av Hela MR, HEK293T og KNS81 gliomceller, bare båndene 250 kDa var følsomme for spesifikk siRNA uttømming. Massespektrometri ble anvendt for å identifisere disse høymolekylære band som BMCC1-1. I den samme studien, ekspresjon av eksogent protein fra en cDNA-klon produserte også flere bånd på SDS-PAGE, noe som indikerer sannsynligvis vesentlig proteolyse, noe som gjør tolkning vanskelig. Mer nylig, Li et al. [12] identifisert olfaxin proteiner som tilsvarer alternative BMCC1 transkripsjonsstartsider uttrykt i luktelappen, med den dominerende band på 52 kDa. Søk et al. [11] har oppdaget et bånd av samme størrelse i hele hjernen lysater og dyrkede neuroner og astrocytter, som de kalte BMCC1s. I den foreliggende undersøkelse, ekspresjon og første karakterisering av en enkelt 340 kDa BMCC1 protein i prostatacancer LNCaP-cellelinjen er beskrevet. Identiteten av dette protein ble robust etablert ved deteksjon med flere antistoffer mot C- og N-terminale områder i proteinet, uttømming av spesifikk siRNA og støttes av MALDI TOF /TOF-analyser. For første gang vi identifisert endogene protein interaksjoner som involverer en region utenfor BCH domene. Vi fant ut at en BMCC1 regionen uten beregnings identifiserbare funksjonelle domener samhandler med Adaptor protein kompleks 2 (AP-2). Vi har også demonstrert samlokalisering av BMCC1 med β-adaptin og ulike endosomal markører, inkludert Rab5 og internalisert transferrin (Tf). Foreløpige funksjonelle analyser tyder BMCC1 er en ikke-kanonisk AP-2 samspill protein som er involvert i post-endocytic trafficking.
Materialer og metoder
Vev og cellelinjer
Menneske prostata vev ble donert av pasienter ved Royal Brisbane Hospital med henhold etisk godkjenning av Queensland Institute for Medical Research menneskelig etikk komité skriftlig informert samtykke. Pasientsamtykkeerklæringer er beholdt. Muse vev ble hentet fra a5 måneder gamle villtype mannlig BalbC mus under etisk godkjenning av Queensland Institute for Medical Research (QIMR) dyr etikkomité. LNCaP, 22Rv1, DU145, RWPE1, ALVA, PC3 og MCF-7 ble innhentet fra ATCC. A11, D11, D28, D33 og D38 var gaver fra Chris Schmidts laboratorium (QIMR). Disse ble innhentet fra pasienter som deltok i kliniske studier på QIMR, med skriftlig informert samtykke fra QIMR menneskelige forskningsetisk komité. En microarray studie på cellelinjer A11 og D11 har blitt publisert [13], som har en klinisk studie på D-serien pasienter [14]. Alle cellelinjer ble holdt i DMEM (Gibco) med penicillin og streptomycin, supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (Gibco).
RNA Utvinning og cDNA-syntese
Total RNA fra cellelinjer og vev ble renset ved hjelp Trizol (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Dette RNA ble revers transkribert til cDNA ved hjelp Hevet III (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
PCR og generasjon av cDNA kloner
cDNA kloner av BMCC1 og andre gener ble generert ved forsterkning av målet fra LNCaP cDNA. Oligonukleotider ble kjøpt fra Sigma Aldrich, ble standard PCR presiseringer utført wth
PFU
Turbo (Roche). Typiske sykkelforhold var 92 ° C 2 minutter etterfulgt av; 92 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sek, 72 ° C i 90 sekunder /kb (2 sykluser); 92 ° C i 30 sek, 57 ° C i 30 sek, 72 ° C i 90 sekunder /kb (2 sykluser); 92 ° C i 30 sek, 53 ° C i 30 sek, 72 ° C i 90 sekunder /kb (30 sykluser). All q-PCR ble utført ved hjelp av Corbett Rotorgene-6000 (Qiagen, Australia), Rotorgene-6000-serien programvare (Qiagen, Australia) og Quantitect® SYBR® Grønn PCR Kit (Kat. Nr 204143, Qiagen, Australia). Reaksjoner ble fremstilt i triplikat og inneholdt hver 7.5μl av qPCR konsentrat-blanding, 0,5 ul av hver 10 uM forover og revers primer og 5 ul av fortynnet cDNA (1:10 fortynning). Sykling betingelse for BMCC1 og p
2M-primere var som følger: 95 ° C i 15 minutter, etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 20 sek, 58 ° C i 20 sekunder og 72 ° C i 20 sek. Sykkel betingelser for AP2M1 primere var som følger: 95 ° C i 15 minutter, etterfulgt av 45 sykluser på 95 ° C i 20 sek, 60 ° C i 20 sekunder og 72 ° C i 20 sek. Data ble generert med Rotorgene-6000-serien programvare og relative genuttrykk nivåer ble beregnet ved hjelp av metoden beskrevet i Pfaffl [15]. Primer sekvenser og restriksjonssetene er angitt i tilleggsmaterialet (tabell S1). Alle restriksjonsenzymer ble kjøpt fra NEB.
Rekombinant protein uttrykk, rensing og kryssbinding
Rekombinant protein uttrykk og rensing og kryssbinding ble utført som tidligere beskrevet [16].
Antistoffer
Rekombinant BMCC1-GST-fusjonsproteinene ble uttrykt og renset som beskrevet ovenfor. De kaninantistoffer Ab-1 og Ab-3 ble generert ved injeksjon av kaniner med eluerte, ikke-denaturert GST fusjonsproteiner (ved hjelp av Institutt for medisinsk og veterinærhøgskole, Adelaide standard dose rate, tidsplan og hjelpestoffer). BMCC1 Ab-2-antiserum ble dannet ved inokulering av en kanin med denaturert GST-fusjonsprotein innebygd i ufikserte polyakrylamid gel skiver (IMVS). BMCC1 sau-antiserum ble dannet ved inokulering av en sau med eluerte ikke-denaturert BMCC1-GST-fusjonsprotein (IMVS) (Ab-4). Alle proteiner hadde N-terminale GST koder når inokulert og de spesifikke BMCC1 sekvenser for hvert antistoff er beskrevet i tabell S1. Spesifikke antistoffer og ikke-spesifikke kontroll antistoffer ble renset fra serum som beskrevet [16].
Kommersielle antistoffer som brukes i dette prosjektet var mus anti-DNA PKCS (Santa Cruz produkt 18-2), mus anti- RNA polymerase II (Abcam, ab5408), kanin anti-β-adaptin (som oppdager AP-1B1 og AP-2B1) (Santa Cruz A-5), mus anti-EEA1 (BD Transduction Laboratories, 610457), mus anti-α-tubulin (Sigma T9026) og muse anti-GAPDH (Millipore MAB374). Passende Alexafluor konjugert esel sekundære antistoffer ble oppnådd fra Invitrogen og HRP konjugerte sekundære antistoffer var fra Sigma.
Plasmid og siRNA transfeksjon
LNCaP ble sådd ut i 6-brønners skåler i antibiotika gratis vekstmedium minst 48 h før transfeksjon. Plasmider ble transfektert inn LNCaP hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner (2 mikrogram av plasmid og 5 pl Lipofectamine 2000 per 9,5 cm
2 i tillegg). siRNA tomannsboliger ble kjøpt fra Invitrogen (sekvenser i tabell S1) og transfektert hjelp Lipofectamine RNAiMAX eller Lipofectamine 2000 (100 pmol av siRNA duplex og 5 pl Lipofectamine per 9,5 cm
2 i tillegg).
Generering av celle og vev lysater
Cellene ble løsnet fra sin vekstsubstrat ved trypsinering i serumfritt DMEM med 0,025% trypsin (Gibco), og trypsin ble inaktivert ved tilsetning av DMEM inneholdende 10% serum. Celler ble pelletert ved sentrifugering (500 x g i 5 min) og vasket to ganger i PBS. Vaskede cellepelletene ble deretter lysert i iskald Mammalian Cell Lysis Buffer (MCLB, 50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40). Alle lysatene inneholder en 2 x konsentrasjon av Roche Komplett EDTA-fri proteasehemmer. Grundig vask for å fjerne cellekultur trypsin og tillegg av en høy konsentrasjon av proteasehemmere er
kritisk
å oppdage nedbrutt BMCC1, som ellers er underlagt rask proteolyse. Tissue lysater ble dannet ved homogenisering i MCLB, ved maling i en Kontes størrelse 22 slipt glass Dounce homogenisator. Celle og vev lysater ble fjernet ved sentrifugering (17 000 x g i 20 minutter ved 4 ° C). Hjernevev lysater ble underkastet ytterligere behandling for å fjerne et lag av flytende lipider. Hjernevev lysatene ble separert på å Biorad Micro Biospin avsalting kromatografikolonner som hadde vært pre-likevekt med MCLB, som fjernet klebrig uløselig materiale. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved bruk av Biorad, Lowry proteinanalyse med BSA standarder.
Western blotting
Prøver i Laemelli SDS-PAGE lasting buffer ble utsatt for standard SDS-PAGE. Proteiner ble overført på nitrocellulose Amersham i overføringsbuffer (6 g /l tris base, 3 g /l glycin, 0,36 g /l SDS, 20% metanol) for 100 V.h. Membranene ble blokkert i blokkeringsoppløsning (PBS-0,05% Triton-X100 med 5% BSA eller PBS /0,07% Tween 20 med 4% skummet melkepulver). Membraner ble probet ved bruk av mellom 0,2 og 5 ng /mL av de angitte antistoffer i blokkeringsløsning ved romtemperatur i 2 timer eller 4 ° C over natten og påvist ved anvendelse av HRP-konjugerte sekundære antistoffer og Western Lightning luminol-reagens (Pierce).
Immunoutfellingsunder og GST pulldowns
Cellelysater ble generert som beskrevet ovenfor. For immunoutfelling, ble lysater inkubert med renset null eller BMCC1 antistoffer (0,5-2 ug av antistoff per mg lysat) ved 4 ° C over natten. BMCC1-antistoffkompleksene ble utfelt ved tilsetning av protein G-agarose-harpiks i 2 timer ved 4 ° C. For GST nedtrekk, ble lysater inkubert med BMCC1-GST-fusjonsprotein tverrbundet harpiks ved 4 ° C over natten. I begge tilfellene ble ubundne proteiner vasket fra harpiksen i 3 x 20 sjiktvolum vaskinger med kald lyseringsbuffer. Utfelte proteiner ble eluert ved tilsetning av 2 harpikssjiktvolumer av SDS-PAGE ladningsbuffer. Eluerte proteiner ble deretter analysert ved SDS-PAGE og Western blotting.
massespektrometri
sølvfarget gel stykker ble avfarget i 15 mM kaliumferricyanid og 50 mM natriumtiosulfat og vasket i vann. Stykker ble dehydrert i 25 mM ammoniumbikarbonat /50% acetonitril og vakuumtørket. De ble sekvensielt redusert og alkylert med 25 mM DTT og 55 mm jodacetamid, både i 25 mM ammoniumbikarbonat. Gelbitene ble dehydrert i 25 mM ammoniumbikarbonat /50% acetonitril og tørket på nytt. De ble deretter utvannet med 20 ng /mL sekvense grade trypsin (Promega) i 40 mM ammonium bikarbonat /10% acetonitril, toppet opp for å hindre uttørking og fordøyd over natten ved 37
° C. Peptidene ble ekstrahert ved å vaske stykkene i 0,1% TFA. Eluerte peptider ble avsaltet ved hjelp av C-18 ZipTips (Millipore) i henhold til produsentens instruksjoner. Peptidene ble deretter blandet med MALDI matrise (Bruker) og analysert ved hjelp av Bruker Ultraflex i positiv ion-modus reflektor med et MS /MS-Toleranse på 100 ppm. Analysen ble utført i huset ved hjelp av Mascot, søke mot 2012 pattedyr ikke-redundante database, noe som åpner for standard posttranslasjonelle modifikasjoner og opp til en savnet trypsin cleavage [17].
Rensing av mikrosomer
LNCaP-celler ble separert i nukleære og cytoplasmiske fraksjonene av douncing i hypotonisk oppløsning som tidligere beskrevet [16]. Mikrosomer ble renset fra cytoplasmisk ekstrakt ved ultrasentrifugering (100.000 x g i 1 time ved 4 ° C ved anvendelse av et Beckman SW55Ti rotor). Mikrosomer ble resuspendert i SDS-lyseringsbuffer (2% SDS, 1 mM DTT, 125 mm Tris pH 6,8) og fjernet ved 17 000 x g i 20 min. Cytosol ble konsentrert til 1/10 sitt opprinnelige volum ved hjelp av et 10K cut-off sentrifugale filterenhet (Millipore) før SDS-PAGE.
Immunohistologisk farving
En standard immunhistokjemisk fargingsprosedyre ble fulgt. Parafin-embedded seksjoner ble kuttet ved 4 pm og ble montert på 5-aminopropyltrietoksysilan (AAS) belagte lysbilder, som så ble overlatt til tørk over natten. De parafininnstøpte snitt ble avvokset i xylen og ble behandlet med mikrobølgeoppvarming ved 60 ° C i 20 min i en citratbuffer (2,1 g /1000 ml, pH 6,0) for antigen gjenfinning. Etter blokkering av endogen peroksidase, vasking i fosfat-bufret saltvann (PBS) og blokkering av ikke-spesifikk binding av sekundært antistoff med normalt svineserum, ble rutinemessig streptavidin-biotin-peroksidase immunofarging med diaminobenzidin anvendt. Seksjonene ble inkubert over natten i BMCC1 Ab-3. Det primære antistoff ble byttet ut med PBS i seksjoner anvendt som negative kontroller. Seksjonene ble kontra med Harris haematoxylin. Siden BMCC1 er kjent for å være positive i benign prostata vev, ble en kjerne av prostatavev med benign hyperplasi inkludert som en positiv kontroll i hver av matrisen.
Skårer for BMCC1 protein ekspresjon i cellene i vevsprøven av de 74 pasientene som ble undersøkt, var basert på andelen av celler farget med BMCC1 polyklonalt antistoff og intensiteten av flekken i cellene. Fargeintensitet ble scoret på følgende skala: Ingen flekker, mild, moderat og sterk. Alle prøvene ble analysert under mikroskopisk undersøkelse ved hjelp av et Olympus mikroskop. (Modell: BX40), ved en forstørrelse på X200
immunfluorescens-mikroskopi og
Cellene ble sådd ut på sterile dekkglass i minst 24 timer før fiksering. Media ble aspirert og cellene ble vasket en gang i PBS før tverrbinding (i PBS med 10% foramlin i 10 min ved værelsestemperatur). Fiksativ ble fjernet og cellene vasket i PBS før permeabiliseringen og blokkering i PBS med 0,05% Triton-X100 og 5% FBS. Cellene ble deretter farget med mellom 0,4 og 2 ng /mL av de angitte primære antistoffer ved omgivelsestemperatur i 2 timer eller 4 ° C over natten. Arter matchet renset IgG ble ansatt som en passende kontroll for antistoff kryssreaktivitet /adsorpsjon. Alle antistoffer ble detektert ved hjelp av egnede Alexafluor488 eller Alexafluor 594 esel sekundære antistoffer. Konfokalmikroskopi ble utført på en Zeiss LSM710. Samlokalisering ble kvantifisert ved hjelp av Zen 2011 programvare. Overlapping koeffisient /overlapping koeffisient etter Manders, en metode ufølsom for forskjeller i signalintensitet, ble brukt til å kvantifisere samlokalisering i bildeparene.
Transferrin opptak
LNCaP ble sådd på sterile dekk 24 timer før merking. Puls-chase opptak av et konjugert transferrin-reseptor-komplekset (Tf-R) ble utført hovedsakelig som beskrevet av Aschen et al. [18]. I korthet ble cellene serum sultet i serumfritt medium (fenol rød-fri DMEM-F12, Life Technologies) i 2 timer ved 37 ° C. Til overflaten etikett celler med konjugert transferrin ble cellene plassert på is i 30 minutter og deretter inkubert med 20 ug /ml Alexafluor-594-konjugert transferrin (Molecular Probes) fortynnet i iskald serumfritt medium i 30 min. Cellene ble vasket to ganger med iskald serumfritt medium for å fjerne ubundet transferrin og t = 0 glassene ble høstet for BMCC1 immunfluorescens, som beskrevet. De resterende Dekk ble jaget i forvarmet serum frie medier for de angitte tidsperioder før innhøsting. Opptak av konjugert transferrin-reseptor-komplekset ble også utført ved anvendelse av en metode lik Boucrot et al. [19]. Cellene ble skylt en gang med DMEM-F12 /5% FCS og så inkubert i 10 minutter med 10 uM Alexafluor-594-konjugert transferrin i DMEM-F12 /5% FCS. Cellene ble deretter vasket med iskald PBS før de ble høstet for immunfluorescens.
Resultater
BMCC1-1 protein er uttrykt i utvalgte kreft
hBMCC1
er en stor og kompleks transkripsjonsenhet, med rutinemessig brukt prostatakreft biomarkør
hPCA3
innebygd i
BMCC1
intron 6.
BMCC1
har tidligere blitt kommentert som diskrete
PRUNE2 Hotell og
BNIP
gener flankerer
PCA3
, med eksogen uttrykksbaserte studier som gjenspeiler dette. Nyere resultater har vist at
BMCC1
produserer en transkripsjon (angitt BMCC1-1) som strekker seg over den innebygde anti
PCA3
genet [5,8]. Her viser vi at det BMCC1-1 RNA uttrykkes i 10/10 PCA3 positiv prostatakreft vevsprøver (figur S1).
Vi har tidligere vist at prostatakreft-cellelinjen LNCaP uttrykker høye nivåer av både BMCC1- 1 og PCA3 RNA [5]. For å utvide disse studiene til endogen BMCC1 protein, genererte vi flere polyklonale antistoffer ved hjelp av rekombinant uttrykte fragmenter av BMCC1 som antigener (skjematisk i Figur S2, kloning primere i tabell S1). Disse antistoffene var ansatt for å demonstrere at
BMCC1
produserer en 300 kDa protein i LNCaP (figur 1). Størrelsen av dette protein tilsvarer den forutsagt fra BMCC1-1 cds og oversatt peptidsekvens (
ie
3088 aminosyrer, ~ 340 kDa). 340 kDa BMCC1 protein ble påvist med både C-terminale Ab-1 (dannet mot aminosyre 2345-2705) og N-terminal Ab-3 (dannet mot aminosyre 1-369) i LNCaP-celler. Uttrykk av dette proteinet ble ikke oppdaget i PCA3 negative prostatakreft cellelinjer PC3, DU145, ALVA, RWPE-I (figur 1A). BMCC1 ekspresjon var også fraværende fra PCA3 negative brystkreftcellelinje MCF7. BMCC1 ble ikke påvist i normale celler som vi tidligere har rapportert [5]. Identiteten til 340 kDa båndet ble bekreftet av immunoprecipitation av BMCC1 fra LNCaP ekstrakter bruker Ab-3, etterfulgt av Western blot påvisning med Ab-2 (hevet mot aminosyre 222-276) (figur 1B). Spesifisiteten til BMCC1 påvisning ble ytterligere bekreftet ved forbigående utarming av BMCC1 ekspresjon av siRNA og påvisning med flere antistoffer. BMCC1 siRNA transfeksjon førte til en dramatisk reduksjon i intensiteten av det 340 kDa proteinbånd påvises ved både C- og N-terminale antistoff Ab-1 og Ab-3 (figur 1C). Dette støtter immunoutfellingsstudier data til robust vise at
BMCC1
er en proteinkodende gen, produsere et 340 kDa protein i PCA3 uttrykke cellelinje LNCaP. Vi oppdaget ikke uttrykk for siRNA sensitive anti-BMCC1 reaktive bånd ved lavere molekylvekt, noe som indikerer at BMCC1-1 protein er det dominerende genet produktet i prostatakreftceller (data ikke vist). BMCC1 protein ekspresjon ble ikke påvist i flere cellelinjer avledet fra neuroblastom, bryst og eggstokk-karsinom (data ikke vist). BMCC1 protein ble påvist i 3/5 primære melanomcellelinjer, og i noen tilfeller en dublett ble observert (figur S3). Identiteten av båndene i melanomcellelinjer ble demonstrert robust ved påvisning av BMCC1 med antistoffer mot forskjellige regioner av proteinet, Ab-1 og Ab-3. Dette indikerer at BMCC1 kan ha en rolle i andre tumortyper.
A. BMCC1 immunoblot av totale celleekstrakter. 30 ug lysat per cellelinje ble utsatt for 5% SDS-PAGE. BMCC1 ekspresjon ble påvist ved anvendelse av et kanin-antistoffer dannet mot aa 2345-2705 (C-terminal, kanin anti BMCC1, Ab-1) og et andre antistoff, Ab-3 som gjenkjenner den N-terminale ende av BMCC1. DNA PKCS ble anvendt som en kontroll lasting.
B. Immunpresipitasjon av BMCC1 fra LNCaP total lysat. BMCC1 ble immunopresipitert ved inkubering av 1 mg av LNCaP-lysat med 1 ug Ab-3 i 8 timer ved 4 ° C, etterfulgt av utfelling med protein G-agarose. Ikke-spesifikk (NS) IgG ble brukt i stedet for Ab-3 i en kontroll IP. Vasket resin ble eluert i SDS-PAGE lasting fargestoff og vestlige utslettet. IgG tung kjede (lasting) demonstrerer lik antistoff innspill.
C. Nedbryting av BMCC1 uttrykk av siRNA. LNCaP celler ble transfektert med BMCC1 siRNA 1730 (siBMCC1) eller kontroll siRNA (siControl). Total lysat ble høstet 3 dager etter transfeksjon og ekspresjon BMCC1 analysert ved western blotting med BMCC1 Ab-1 (C-terminale) og Ab-3 (N-terminal). Blottet ble fullstendig strippet mellom sekvensielle sonder. RNA polymerase II er en lasting kontroll.
Machida et al. [7] og Li et al. [12] brukes
in situ
hybridisering av mus embryo for å vise at BMCC1 RNA uttrykkes hovedsakelig i nervevev, og Zhou et al. [20] benyttes PCR fra mus vev RNA for å vise at i det minste BCH-domenet er uttrykt i en rekke vevstyper. Iwama et al. [8] anvendt PCR-primere som spenner over hele genet for å demonstrere sterk ekspresjon i dorsal root ganglion med mellomliggende uttrykk i hele hjernen, ryggmarg, prostata og livmor og lav ekspresjon i andre vev. For å løse dette avviket fra konstituerende versus begrenset RNA uttrykk, og for å få mer informasjon om protein uttrykk og mulige skjøtes genprodukter, immunoblottet vi proteinlysatene fra et panel av voksne mus vev ved hjelp BMCC1 Ab-4. I denne ikke-tumorigen innstilling oppdaget vi en sterk ~ 80 kDa-båndet i hjernevev, med lavere ekspresjon av et mindre 72 kDa bånd (fig S4). Den 52kDa BMCC1s identifisert av Arama et al. [11] ble ikke observert her fordi antigenet for Ab-4 spenner over aminosyrene 2192 til 2433 av BMCC1-1 og ikke inneholder noen del av BMCC1s (se fig S2). For å bekrefte uttrykk for BMCC1 i en prostata kreft svulst innstilling, ble immunhistokjemi farging av prostata kreft vev utføres ved hjelp av Ab-3. Minimal BMCC1 farging ble observert i benign prostata hyperplasi kjertel epitel og stroma, med sterkere farging observert i kjertel epitel av prostatakreft (figur S5).
BMCC1 samhandler med AP-2 i prostatakreftceller
for å få innsikt i den cellulære funksjon BMCC1, i samspill proteiner ble identifisert ved rensing med BMCC1-GST affinitet harpiks. Vi genererte en serie overlappende kloner BMCC1-GST i pGEX som dekker full-lengde cDNA (tabell S1). Rekombinante proteiner ble uttrykt og tverrbundet til glutation-agarose for å generere en serie av affinitet matricies for å kommunisere proteiner. Krysskoblet GST-BMCC1 fusjons harpiks ble inkubert med total LNCaP lysat å rense BMCC1 interactors. Resin assosierte proteiner ble eluert, løst og visualisert ved sølvfarget SDS-PAGE. BMCC1 GST fragmenter 1-2 og 4-10 trukket ned en rekke proteiner ofte identifisert som ikke-spesifikke eller ikke-funksjonelle interactors. Disse inkluderer eEF1γ, 40S ribosomalt protein, GRP75 og GRP78 (data ikke vist). BMCC1 GST F3 (aminosyrer 575-904) utfelt spesifikke bånd på 50 kDa og 110 kDa (figur 2A). De 50 kDa og 110 kDa samvirkende bånd ble skåret ut og identifisert ved massespektroskopi (MALDI MS /MS på et Bruker Ultraflex III). Et sammendrag av Mascot søkedata er vist i tabell S2. Dette avslørte at BMCC1-F3 samhandler med flere medlemmer av Adapter Relaterte protein Complex 2 (AP-2). AP-2-komplekset er et endosom forbundet heterotetramer bestående av tre forskjellige konstitutive komponenter (AP-2S1, AP-2M1 og AP-2B1 /β-adaptin) og en av to gjensidig utelukkende komponenter (AP-2A1 eller AP-2A2) [ ,,,0],21]. Den 50 kDa BMCC1-F3 samspill protein ble identifisert som AP-2M1, basert på to separate identifikasjoner med totalt 8 ikke-redundante peptider (Tabell S2). Den 110 kDa BMCC1 samspill bandet inneholdt en blanding av tre høy molekylvekt AP-2 komplekse medlemmer: AP-2A1, AP-2A2, og AP-2B1 (tabell S2). AP-2B1 ble identifisert i to prøver med et total av 5 unike peptider. Den homologi mellom AP-2A1 og AP-2A2 gjør enkelte unike identifikasjoner kompleks (figur S6). AP-2A1 ble identifisert i 3 prøver med totalt 6 peptider som ikke svarer til AP-2A2. AP-2A2 ble identifisert i en prøve med en peptid som ikke kan tilskrives AP-2A1. I disse prøver, ble tre individuelle peptider har tilsvarte enten AP-2A1 eller AP-2A2 og kan ikke tilskrives med sikkerhet til den ene eller den annen på grunn av sekvensidentitet (tabell S3). Ingen beregnings identifiserbare domener kunne tilskrives denne regionen, slik funksjonell interaksjon kartlegging av BMCC1 identifisert et nytt protein-protein interaksjon motiv. Samspillet mellom BMCC1 og AP-2 komplekset ble bekreftet av co-immunoprecipitation. BMCC1 ble immunoutfelt fra lysater LnCap og de resulterende samvirkende proteiner ble eluert og analysert ved Western blotting (figur 2B) avslørte at endogen BMCC1 samhandler med β-adaptin og AP-2A1 /2 (figur 2B). Den endogene samspillet mellom BMCC1 og AP-2 komplekset ble ytterligere underbygget av BMCC1 immunoprecipitation fra lysater av celler som hadde vært BMCC1 oppbrukt med siRNA. En 340 kDa båndet ble påvist på den høye molekylvekt oppløsnings Coomassie farget gel (figur 2C). Dette båndet var redusert intensitet i immunpresipitatet fra BMCC1 utarmet celler sammenlignet med kontrollen siRNA cellene. Selv om immunoutfellingen er ikke en kvantitativ tilnærming, denne reduserte intensitet styres båndet utvalg for påfølgende MS-analyse. Identifiseringen av dette bandet som BMCC1 ble bekreftet av MALDI-TOF /TOF av tryptiske peptider fra utskåret gel skive. Viktigere, den ekstreme BMCC1 N-terminal peptid TEFNYFTETR, ikke er til stede i den avkortede isoform (BMCC1-3) rapportert av Machida et al. [7] ble identifisert blant disse (tabell S4). Dette ga
de novo
bevis på BMCC1-1 protein uttrykk i LNCaP celler. Interaksjonen profilen til BMCC1 ble undersøkt ved Western blotting disse immunopresipitater for AP-2A1 /2 og β-adaptin. I samsvar med det reduserte nivået av BMCC1 protein i siBMCC1 immunoprecipate, reduserte signaler for AP-2A1 /2 og β-adaptin ble påvist i bunnfallet fra siBMCC1 lysat enn kontroll-lysat. Dette ga ytterligere bevis på at disse proteinene spesielt samhandle med BMCC1 (figur 2C).
