Abstract
Anlegget flavonoid luteolin viser ulike biologiske effekter, inkludert kreft egenskaper. Lite er kjent om de molekylære mekanismene bak sine handlinger i tykk- og endetarmskreft (CRC). Her undersøkte vi effekten av luteolin på tykktarm kreft celler, med fokus på balansen mellom ceramid og sfingosin-1-fosfat (S1P), to sphingoid meklere med motsatte roller på celle skjebne. Ved hjelp av dyrkede celler, fant vi at fysiologiske konsentrasjoner av luteolin indusere heving av ceramid, etterfulgt av apoptotisk død av tykktarm kreft celler, men ikke av differensierte enterocytes. Puls studier viste at luteolin hemmer ceramider anabolisme til komplekse sphingolipids. Ytterligere eksperimenter førte oss til å demonstrere at luteolin induserer en endring av det endoplasmatiske retikulum (ER) -Golgi strømning av ceramid, vesentlig for den metabolske behandling til komplekse sfingolipider. Vi rapporterer at luteolin utøver sin virkning ved å hemme både Akt aktivisering, og sfingosin kinase (SphK) 2, med påfølgende reduksjon av S1P, en Akt stimulator. S1P administrasjon beskyttet tykktarmskreftceller fra luteolin-indusert apoptose, mest sannsynlig av en intracellulær, reseptor-uavhengig mekanisme. Totalt denne studien viser for første gang at kosten flavonoid luteolin utøver toksiske effekter på tykktarmskreftceller ved å hemme både S1P biosyntese og ceramid trafikk, noe som tyder på sin kost innføring /tilskudd som en potensiell strategi for å forbedre eksisterende behandlinger i CRC.
Citation: Abdel Hadi L, Di Vito C, Marfia G, Ferraretto A, Tringali C, Viani P, et al. (2015) Sphingosine kinase 2 og Ceramide Transport som sentrale mål i natur flavonoid Luteolin å indusere apoptose i Colon kreftceller. PLoS ONE 10 (11): e0143384. doi: 10,1371 /journal.pone.0143384
Redaktør: Ashley Cowart, Medical University of South Carolina, USA
mottatt: 15 juli 2015; Godkjent: 04.11.2015; Publisert: 18.11.2015
Copyright: © 2015 Abdel Hadi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
CRC er en av de mest vanlige neoplasi og en ledende dødsårsak over hele verden. Dette kreft ble anerkjent som, og er fremdeles, en miljø kreft, dens forekomst økes parallelt med økonomisk utvikling, med de fleste tilfellene oppstår i industrialiserte land, og i hovedsak knyttet til kosthold [1, 2]. Tallrike studier har knyttet rikelig forbruk av matvarer fra plante opprinnelse med redusert risiko for å utvikle forskjellige krefttyper, en chemo-forebyggende effekt som er knyttet til det høye innholdet av flere fytokjemikalier med potente anticancer egenskaper [3], blant annet forbindelser av flavonoid-familien [4 , 5]. En av de mest vanlig komponent i denne familien er luteolin (3 «, 4», 5,7-Tetrahydroxyflavone), som er til stede i høye nivåer i vanlige frukter, grønnsaker og urter, og oppviser et bredt spekter av virkninger, inklusive antikreftaktiviteter [6, 7]. Luteolin anti-kreftfremkallende egenskaper ekspandere over et vidt område av ondartede sykdommer, og er forbundet til flere effekter, slik som inhibering av celleproliferasjon, angiogenese, metastase, induksjon av apoptose, og sensibilisering for kjemoterapi [6, 7]. Til tross for, de molekylære mekanismer som ligger under luteolin handlinger, og særlig de som er knyttet til dens kjemoterapeutisk potensial, forblir stort sett uklare.
i forskjellige tumorceller, ceramider, nøkkelmellomproduktet av sfingolipid metabolisme, har vist seg å virke som celle mediator av flere kreft forbindelser, være i stand til å regulere ulike signalveier, og som fører til cellesyklus og apoptose [8, 9]. Flere enzymer i forskjellige subcellulære steder er involvert i kontrollen av ceramid nivå [10]. De pro-apoptotiske og tumorhemmende effekter av ceramid er antagonisert av S1P, et pro-mitogen og overlevelsesfaktor for en rekke celletyper [11-13]. S1P metabolisme er direkte knyttet til det av ceramid, sin biosyntese krever sfingosin, avledet fra ceramid hydrolyse, og SphKs (isoform SphK1 eller SphK2). S1P utstillinger både intracellulære og ekstracellulære handlinger, primært gjennom aktivering av pro-mitogen og pro-overlevelse signale [11, 14]. Riktig regulering av sphingolipid rheostat, er at balansen mellom S1P og ceramider, er avgjørende for cellulær homeostase, og spiller en fundamental rolle i regulering av celleegenskaper og skjebne [11, 13].
Ceramide nivåer har vært rapportert å være betydelig redusert i CRC sammenlignet med vanlig kolon vev [15], og flere kjemoterapeutika ble funnet å påvirke ceramider stoffskiftet og fremme sin akkumulering i tykktarm kreft celler (anmeldt i [16]). Dessuten stimulerer S1P vekst, invasjon og overlevelse av kolon tumorceller [17, 18], og SphK1 og S1P lyase er opp- og ned-regulert, noe som fører til S1P opphopning i CRC [19, 20]. Disse bevisene tyder på at ubalansen i sphingolipid rheostat favorisere CRC.
Til tross luteolin ser lovende som kjemoterapeutiske i enkelte kreftceller [7], er lite kjent på seg rollen som den sphingolipid rheostat på sine handlinger, og spesielt i barnekonvensjonen. Denne studien var designet for å undersøke den potensielle rolle både ceramid og S1P i luteolin cytotoksisitet i CRC. Ved hjelp av menneskelige Caco-2 celler som CRC modell, avslører vår studie for første gang sphingolipid rheostat som et mål av luteolin cytotoksiske effekter.
Materialer og metoder
Material
alle reagenser var av høyeste tilgjengelige analytisk kvalitet. Eagles Minimum Essential Medium (EMEM), Brefeldin A (BFA), fri fettsyre-BSA (FFA-BSA), N-acetyl-D-erytro-sfingosin (C2-Cer), N-heksanoyl-D-erytro-sfingosin ( C6-Cer), O-tricyklo [5.2.1.02,6] dec-9-yl ditiokarbonat kaliumsalt (D609), Hoechst 33342, luteolin, kikhoste toksin (PTX), og vanlige kjemikalier var fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). S1P ble kjøpt fra Enzo miljø- og biovitenskap (Farmingdale, NY, USA), og bur S1P fra Alexis Biochemicals (Plymouth Meeting, PA, USA). Høy ytelse TLC (HPTLC) silikagel-plater og alle løsningsmidler var fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Føtalt kalveserum (FCS) var fra EuroClone (Milan, Italia). LY294002, SEW2871, og W123 var fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA), og N- (4,4-difluor-5,7-dimetyl-4-bora-3a, 4a-diaza-
s
-indacene-3-pentanoyl) -sphingosine (BODIPY-C
5-Cer) fra Life Technologies (Monza, Italia).
3H-serin (30 Ci /mmol),
3 H-D-erytro-sfingosin (
3H-Sph) (20,0 Ci /mmol) og D-erytro- [4,5-
3H] dihydrosphingosine (60,0 Ci /mmol) var fra PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA, USA) og amerikanske Radiomerket Chemicals, Inc. (St. Louis, Missouri, USA).
Cell kultur
den menneskelige kolon karsinom cellelinje Caco-2 (BS TCL 87) ble hentet fra Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna (Brescia, Italia), og vedlikeholdes i EMEM supplert med 15% FCS, 2 mM L- glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 100 ug /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin, og 0,25 ug /ml amfotericin-B ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2. Caco-2 celler ble sådd på 1,25 × 10
4 /cm
2, og brukes enten som tykktarmskreft cellemodell (CC celler) (ved samløpet, 3 dager etter plating), eller differensierte enterocytes (DES) ( 21 dager etter samløpet) [21]. Tarm differensiering ble bekreftet ved å evaluere spesifikke morfologiske funksjoner og biokjemiske markører som tidligere rapportert [21]
Cell behandlinger
Stamløsninger av de administrerte molekyler ble fremstilt ved å oppløse dem som følger:. Luteolin, SEW2871 , W123, og bur S1P i DMSO, C2-Cer og BFA i absolutt etanol, C6-Cer som 1: 1 kompleks med FFA-BSA, og S1P i FFA-BSA (4 mg /ml i PBS). På tidspunktet for forsøkene, ble stamløsninger fortynnet i frisk medium til den passende konsentrasjon og administrert til celler. I parallelle forsøk ble celler inkubert med fortynnet kjøretøyer som kontroll. Alle oppløsningsmidler, ved de benyttede sluttkonsentrasjonene ble funnet uten virkning på enten sfingolipid metabolisme eller celleoverlevelse. Når den brukes, ble W123 og PTX administrert 1 time før og under behandling. For intracellulære S1P generasjon, ble CC-celler lastet med bur S1P (i EMEM inneholdende 1 mg /ml FFA-BSA) ved 37 ° C i 2 timer. Mediet ble deretter fjernet, og fotolyse ble utført med en 30-s UV-puls ved 360 nm med maksimal intensitet.
Bestemmelse av cellelevedyktighet og apoptose
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT analyse. I korthet, etter behandling i angitte tidsrom, ble mediet erstattet med MTT oppløst i friskt medium (0,8 mg /ml) i 4 timer. De formazankrystaller ble deretter løst i isopropanol /maursyre (95: 5 v /v) i 10 minutter, og absorbansen (570 nm) ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Wallack Multilabel Counter, Perkin Eimer, Boston, MA, USA).
for å evaluere apoptose, Hoechst farging og analyse av caspase 3 cleavage ble utført. Spesielt ble cellene dyrket på dekkglass som er merket med 10 uM Hoechst 33342 fargestoff i 15 minutter ved 37 ° C, i mørket. Etter vasking med PBS ble cellene fiksert med 0,5% glutaraldehyd i PBS (10 min, 4 ° C). Den kjernefysiske morfologi ble undersøkt ved hjelp av et fluorescens-mikroskop (Olympus BX-50), utstyrt med en rask høy oppløsning CCD-kamera (Colorview 12) og en bildeanalyseprogramvare (Analyse fra Soft Imaging System GmbH). Caspase-3 cleavage ble evaluert av western blotting (se nedenfor).
Ceramide kvantifisering og metabolske studier
For å vurdere ceramider innhold og sphingolipid metabolisme, ble celle sphingolipids merket med 25 nM
3H-Sph (0,5 pCi /ml) eller 200 nM L-
3H-serin (6,0 pCi /ml) som tidligere rapportert [22, 23], til forskjellige tider. Spesielt for ceramid kvantifisering, utførte vi en 6 timers puls etterfulgt av en 24 timers jakt, en tilstand warranting et steady-state metabolsk merking. For metabolske studier ble puls eksperimenter utført i 1-2 timer. Ved slutten av pulsen /chase tid, ble mediet forsiktig oppsamlet, ble cellene skrapet av platen og sfingolipider og S1P ble ekstrahert og delvis renset som tidligere beskrevet [22, 24]. Når telleren for radioaktivitet ved væskescintillasjon, ble den endelige organiske og vandige faser sendes til HPTLC, ved anvendelse av kloroform /metanol /vann 55: 20: (. Vol) 3 og i n-butanol /eddiksyre /vann 3: 1: 1 (vol.) for separering av komplekse sfingolipider og SLP, henholdsvis. HPTLC Platene ble deretter oversendt digital autoradiografi med Beta-Imager 2000 instrument (Biospace, Paris, FR). Radioaktiviteten forbundet med individuelle lipider ble bestemt med M3-Vision programvare som følger med instrumentet.
3H-sphingolipids ble identifisert ved co-migrering med interne standarder kromatografert på samme plate. Ceramide Innholdet ble bestemt ved å beregne steady-state
3H-ceramid /
3H-sphingomyelin forholdet, og multiplisere det for endogen sphingomyelin innhold (22, 23). Lignende ceramid nivåer (forskjellige for mindre enn 12%) ble oppnådd etter celle merking ved likevekt med
3H-Sph og
3H-serin.
3H-S1P degradering ble vurdert som tritiert vann ved fraksjonert destillasjon av den vandige fase fra kulturmediet, og måling av radioaktiviteten ved væskescintillasjon [22]. Kontroll eksperimenter med ekstra
3 H
2o viste at ingen tap av tritium ved fordampning skjedde under de brukte forsøksbetingelser.
Intracellulær lokalisering av fluorescerende ceramid
ER-Golgi transport av ceramid ble kvalitativt vurdert med BODIPY-C
5-Cer som tidligere rapportert [25]. I korthet ble celler dyrket på dekkglass lastet med 2,5 pM BODIPY-C
5-Cer i 30 min, ved 4 ° C, og deretter inkubert i kondisjonert medium (30 minutter ved 37 ° C), i fravær eller nærvær av luteolin. Prøvene ble deretter fiksert med glutaraldehyd, og analysert ved fluorescens mikroskopi (se ovenfor).
SphK aktivitet
Cellene ble høstet i SphK buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 inneholdende 40 mM β-glycerofosfat, 1 mM EDTA, 0,5 mM deoxypyridoxine, 15 mM NaF, 1 mM β-merkaptoetanol, 1 mM Na
3VO
4, 0,4 mM PMSF, 10% glycerol, og komplette proteasehemmere), og forstyrret ved fryse-tining. Like mengder av proteiner [26] ble analysert for SphK-aktivitet, ved hjelp av eksperimentelle betingelser som er kjent for selektivt å favorisere SphK1 eller SphK2 aktivitet [27, 28]. Blandingen ble inkubert ved 37 ° C i 15-30 min. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av kloroform /metanol (2:. 1 på volumbasis), etterfulgt av dobbelt partisjonering, først i alkalisk og deretter i sure betingelser. S1P i slutt organiske fasen ble løst ved HPTLC, og kvantifisert ved digital autoradiografi. Bakgrunnsverdier ble bestemt i negative kontroller hvor ATP ikke ble tilsatt til reaksjonsblandingen.
Western blotting
Celler ble lysert (20 minutter ved 4 ° C) i Tris-bufret saltvann (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) inneholdende 1% Nonidet P-40, 10 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4, 10 mM natriumpyrofosfat, 1 mM PMSF, og proteaseinhibitorer. Etter sentrifugering ble supernatanten analysert for proteiner [26], og lik mengde proteiner (15-30 mikrogram) ble sendt til SDS-PAGE på 10% polyakrylamid gel. Etter overføring til nitrocellulosemembraner, ble prøvene inkubert (over natten, 4 ° C) med følgende antistoffer: anti-SphK1 og anti-SphK2 (Abcam, Cambridge, UK), anti-fosfo-Akt, anti-caspase-3-antistoff (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA), og deretter med en anti-HRP-konjugert antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Anti-β-aktin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) og anti-GAPDH antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ble brukt som lasting kontroll. Immunreaktive signalene ble visualisert ved Supersignal West Femto (Thermo Scientific (Rockford, IL), og eksponering for Kodak Biomaks film (Rochester, NY) immunoreactive bandet tetthet ble bestemt med et densitometer (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA,. Antall Én programvare ).
Statistisk analyse
data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av minst tre uavhengige eksperimenter i to eksemplarer. data ble analysert ved hjelp av StatMate programvare, versjon 4.0 (GraphPad). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Student
t
-test Forskjeller ble ansett som statistisk signifikant på
p
. . 0,05
Resultater
Luteolin induserer apoptose i CC celler
Vi evaluerte først virkningen av luteolin på Des og CC celleviabilitet. Som vist i figur 1A, opp til 100 uM luteolin utøver ingen åpenbare toksiske effekt i DES, og selv ved den høyeste konsentrasjon (200 uM), en beskjeden , om noen, ble cytotoksisk effekt observeres. til den motsatte, i det samme konsentrasjonsområde, luteolin induserte en doseavhengig reduksjon av CC cellelevedyktighet (figur 1A). Ved luteolin konsentrasjoner høyere enn 20 uM, endringer i cellemorfologi CC karakteristisk for apoptotiske celler, inkludert krymping og omfattende løsgjøring fra kulturen substratet, ble det observert (ikke vist). Etter 24 timers behandling med cytotoksiske doser av luteolin, analyser fluorescens mikroskopisk med Hoechst 33342 avslørte at CC celler presenteres apoptotiske morfologiske endringer, med kondens og fragmentering av kjerner, og viste strålende blå fluorescens (figur 1B, til høyre). Omvendt, ved de samme betingelser, ble DES funnet med normalt utseende, og det fluorescerende fargestoff Farget morfologisk normale kjerner, med en svakt blå fluorescens (figur 1B, venstre). I tillegg farging av caspase-3 avslørte at luteolin indusert pro-kaspase-3 aktivering i CC-celler, men ikke i des (figur 1C).
(A) CC-celler (CCS) og Des ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av luteolin, og etter 48 timer cellenes levedyktighet ble analysert ved MTT. Dataene er gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige eksperimenter; *, P 0,05 og **, p 0,01 vs. kontroll. (B) Representative mikroskopiske bilder av Des og CCs farget med Hoechst 33342 etter behandling med 100 mikrometer luteolin for 36 timer. (C) Western blot analyse av Pro-caspase-3 og aktiv caspase-3 intracellulære nivåer av Des og CCs behandlet eller ikke med 100 mikrometer luteolin for 36 timer.
Opphopning av ceramid er involvert i luteolin indusert apoptose
i de benyttede forsøksbetingelser, det basale nivået av ceramid var signifikant lavere i CC-celler enn i des (2,45 ± 0,38 og 4,73 ± 0,59 nmol /mg protein, henholdsvis). Etter 24 timers behandling med cytotoksiske doser av luteolin, fant vi at ceramid nivået av CC celler betydelig høyere (mer enn 3 ganger) ved luteolin ved giftig, men ikke sub-toksiske doser (Fig 2A). Den luteolin-indusert ceramid økningen var målbar i CC celler før tydelig morfologiske og kjernefysiske endringer. Under de samme betingelsene for luteolin behandling, var det ingen signifikant variasjon i ceramid-innhold er observert i des (figur 2A). Resultatene bedt oss om å undersøke mekanismene bak luteolin-indusert ceramid økning, med fokus på CC celler.
(A) DES og CC-celler ble behandlet med luteolin, og etter 24 timer, ble celle ceramid kvantifisert. (B) og (C) CC-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av C2-Cer (B, firkantet), C6-Cer (B, trekant) eller D609 (C), og etter 48 timer cellelevedyktigheten ble bedømt ved MTT. Alle data er gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. *, P 0,05; **, P 0,01 vs kontroll.
eksponering av celler til CC økende doser av cellepermeable C2- og C6-Cer resulterte i en doseavhengig cytotoksisk effekt (figur 2B). Styrken av disse ceramid analoger, for å indusere CC celledød var omvendt relatert til deres lengde på deres acylkjede, som forventet på basis av deres celle permeabilitet. I tillegg celle behandling med D609, en inhibitor av sfingomyelin syntase [29], induserte en cytotoksisk virkning også (figur 2C). D609 behandling (0,5 mm for 24 h), induserte en signifikant økning (1,94 ganger, p 0,01) av ceramid (fra 2,45 ± 0,38 til 4,76 ± 0,59), noe som indikerer at denne behandlingen var effektiv i å heve intracellulær ceramid. CC celler behandlet med ceramider eller D609 viste kromatin kondensasjon og kaspase-3 aktivering (ikke vist), noe som indikerer en indusert økning av cellulær ceramid ble i stand til å etterligne luteolin i indusering av apoptose.
Luteolin inhiberer metabolismen til ceramid komplekse sfingolipider
For å undersøke mekanismen bak ceramid opphopning indusert av luteolin, vi deretter utført puls eksperimenter med merket sfingosin. Vi fant at
3H-Sph ble hurtig inkorporert i CC-celler, uavhengig av luteolin behandling. Faktisk utgjorde totalt inkorporert radioaktivitet for 373 ± 20 og 385 ± 25 nCi /fatet i kontroll og luteolin behandlet CC celler, henholdsvis. I begge tilfeller, etter en time puls, nivået av intracellulær
3H-Sph representerer mindre enn 5% av total radioaktivitet inkorporert (ikke vist), noe som indikerer en effektiv sfingosin metabolisme forekom i CC-celler, og var upåvirket av luteolin. Størstedelen av inkorporert radioaktivitet var forbundet til N-acylerte sfingosin-derivater, hovedsakelig representert ved ceramid og sphingomyelin, og, i mye lavere mengder, av glykosfingolipider. Luteolin behandling økte signifikant mengden radioaktivitet inkorporert i N-acylerte metabolitter (213,7 ± 17,3 og 282,4 ± 24,9 nCi /skål, i kontroll og luteolin-behandlede celler), og modifisert dens fordeling mellom forskjellige sfingosin metabolitter. Faktisk, i luteolin-behandlede celler, ble radioaktivt merket ceramid funnet mer enn 2 ganger høyere enn den for kontrollceller (figur 3A, øvre panel), og er parallelt med en betydelig reduksjon av komplekse sfingolipider, herunder både sphingomyelin og glykosfingolipider (fig 3A , øvre panel). Lignende resultater ble oppnådd i puls eksperimenter med merket serin som brukes som forløper for de novo syntese sfingolipid (figur 3A, nedre panel). I det hele tatt, disse variasjonene resulterte i en betydelig økning av ceramid /komplekset sfingolipid-forholdet i luteolin-behandlede celler sammenlignet med kontroll de (mer enn 10- og 7-fold etter
3H-Sph og
3H-serin puls, henholdsvis p. 0,001)
(A) CC celler ble pulset med 25 nM
3H-Sph (øvre panel) eller 200 nM
3H-serin (nedre panel) i fravær (hvit strek) eller nærvær (grå linje) på 100 mikrometer luteolin i 2 timer. Ved slutten av innholdet av cellulære radiomerket ceramid (Cer), sfingomyelin (SM) og glykosfingolipider (GSLs) ble målt. **, P 0,01. (B) CC-celler ble inkubert i fravær (CT) eller nærvær av luteolin (LU), deretter med BODIPY-C
5-Cer og analysert ved fluorescens mikroskopi (bar, 10 um). (C) CC cellene ble inkubert uten (a) eller med (b) BFA (1 pg /ml) i 30 min, og deretter pulset med
3H-Sph eller
3H-serin med luteolin (100 pM) i 2 timer. Ceramid /komplekset sfingolipid-forholdet er rapportert. Data er gjennomsnitt ± S.D. av to uavhengige eksperimenter. **, P 0.01.
Etter en to timers puls med L-
3H-serin, kontroll og luteolin-behandlede celler innlemmet tilsvarende mengder radioaktivitet i total sphingolipids (22,3 ± 2,7 og 24,9 ± 3,0 nCi /matrett). I de benyttede forsøksbetingelser, representert
3H-ceramid store merket sphingolipid, og ble funnet signifikant økt i luteolin-behandlede celler (figur 3A, lavere panel). Som i tilfellet med
3H-Sph puls, ceramid høyde ble ledsaget av en betydelig reduksjon av både sphingomyelin og glykosfingolipider (figur 3A, nedre panel).
Luteolin svekker ER-Golgi trafikk av ceramid
på baser av resultatene ovenfor, var det av interesse å undersøke om reduksjon av ceramider metabolismen til komplekse sphingolipids skyldes endringer i sin transport fra eR til Golgi-apparatet. For dette formål vi først studert effekten av luteolin på intracellulær transport av BODIPY-C
5-Cer, et fluoriserende analog ceramid i stand til å etterligne den ER-Golgi-trafikk av naturlig ceramid i levende celler [30]. Når du har merket kontrollceller med BODIPY-C
5-Cer, sterkt fluorescerende intracellulære vesikler akkumulert i kompakte perinukleære strukturer, representant for Golgi-apparatet (fig 3B, til venstre), som indikerer normal exit av ceramid fra ER. I motsetning i luteolin-behandlede celler en fluorescens sprer seg over hele cellene med en diffus retikulære mønster, og ledsaget av en reduksjon av perinukleært fluorescens var tydelig (figur 3B, til høyre). Disse variasjonene, sammen med resultatene av puls studien, er i samsvar med hypotesen om at cytotoksiske doser av luteolin forringe ceramid transport fra ER til Golgi. For ytterligere å underbygge dette undersøkte vi effekten av BFA, som forstyrrer Golgi ved å fremkalle dens fusjon med ER [31], på luteolin-indusert svekkelse av ceramid metabolisme. Vi fant ut at BFA betydelig redusert luteolin-indusert ceramid akkumulering, og dette ble stadig av heving av både sphingomyelin og glukosylceramid. Som en konsekvens av dette, i nærvær av BFA, den luteolin-indusert heving av ceramid /komplekse sfingolipider forholdet ble betydelig redusert (figur 3C).
Akt er involvert i luteolin-indusert svekkelse av ceramid trafikk
Som aktivering av serin-treonin-kinase Akt (proteinkinase B) er avgjørende involvert i overlevelse signalering i forskjellige celletyper [32], ved siden undersøkte vi hvorvidt Akt er involvert i luteolin toksisitet. Vi fant at luteolin behandling forårsaket en doseavhengig reduksjon av fosforylert Akt i CC-celler (figur 4A). Videre, LY294002, en spesifikk inhibitor av PI3K /Akt, var i stand til å etterligne virkningene på luteolin ceramid metabolisme, ved å øke ceramid og redusere kompliserte sfingolipider (figur 4B).
(A) CCs ble behandlet med 50 og 100 mikrometer av luteolin i 2 timer og sendt til immunblotting med anti-Pakt antistoffer. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. (B) Celler ble levert til puls med
3H-Sph i fravær (CT) eller nærvær av LY294002 i 2 timer. Nivåene av ceramid (Cer), sfingomyelin (SM) og glykosfingolipider (GSLs) er rapportert som gjennomsnitt ± S.D. av minst tre uavhengige eksperimenter. **, P 0,01 vs CT celler.
Luteolin ubalanser den sphingolipid rheostat ved å hemme SphK2
Analysene av 1-fosforylering metabolitter av
3H-Sph (inkludert
3H- S1P og
3H-vann, dets nedbrytningsprodukt) viste at både S1P- og vann-assosiert radioaktivitet ble signifikant redusert ved luteolin (figur 5A og 5B). Oppdagelsen av at Luteolin induserte en nedgang på både S1P og dets nedbrytningsprodukt bedt oss om å vurdere mulig effekt av cytotoksiske konsentrasjoner av luteolin på SphK uttrykk og aktivitet. Western blot viste ingen vesentlige forskjeller i uttrykket av både SphK1 og SphK2 proteiner (Fig 5C). Av interesse, fant vi ut at 50-100 mikrometer luteolin betydelig hemmet SphK2 aktivitet på en doseavhengig måte, men var ineffektive på SphK1 (Fig 5D).
(A) og (B) CC celler ble pulset med
3H-Sph i 2 timer i fravær (hvit strek) eller tilstedeværelse av 100 mikrometer luteolin (grått felt). Ved slutten, ble merket S1P (A) og vann (B) undersøkt i celler og medium, respektivt. (C) CC-celler ble behandlet med 50-100 uM luteolin i 2 timer, og like mengder av protein ble så analysert med hensyn SphK1 og SphK2 proteiner ved immunblotting. GAPDH ble brukt som lasting kontroll. (D) SphK1 og SphK2 aktiviteter ble undersøkt i fravær eller nærvær av luteolin, ved hjelp av CC cellehomogenat som enzymkilde. Dataene er gjennomsnitt ± S.D. av tre eksperimenter i to eksemplarer. **, P 0,01 vs. kontroll
luteolin-indusert hemming av både ceramid anabolisme og SphK2 aktivitet ført til en betydelig økning av ceramid /S1P ratio (mer enn seks ganger, p 0,01)., som er en relevant ubalanse av sphingolipid rheostat.
S1P reduksjon er funksjonelle til luteolin toksisitet
luteolin-indusert reduksjon av intracellulær S1P ledet oss til å vurdere om S1P administrasjon påvirker luteolin cytotoksisitet. Vi først fant ut at S1P behandling betydelig økt Akt fosforylering i CC-celler (fig 6A, opp). I tillegg samtidig bruk av S1P og luteolin resulterte i en betydelig økning av levedyktige celler (fig 6A, ned), og redusert luteolin hemming av Akt fosforylering (fig 6B)
(A) Øvre panel.: CC-celler ble behandlet med 0,5-1 uM S1P i 2 timer. Like mengder av celleproteiner ble deretter analysert for fosforylert Akt (pakt) ved immunblotting. Nedre panel: CC-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av S1P i nærvær av 50 uM luteolin, og etter 48 timer cellenes levedyktighet ble analysert ved MTT-analyse. (B) P-Akt /β-aktin-forhold (gjennomsnitt ± S.D) før og etter behandling av CC-celler med 1 uM S1P og /eller 50 uM luteolin i 2 timer. *, P 0,05 og **, p 0,01 vs. ubehandlede celler; #, P 0,05 vs. luteolin-behandlede celler. En representativ Western blot er rapportert i den nedre del. (C) CC-celler ble inkubert med luteolin alene (Lu), eller i nærvær av 1 uM S1P og /eller 1 uM SEW2871; 5 mikrometer W123; eller 100 ng /ml PTX. (D) CC-celler ble inkubert med luteolin i fravær eller nærvær av 1 uM bur S1P uten eller med 100 ng /ml PTX i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble målt uten (mørk grå) eller med (lys grå) UV-bestråling i 30 sek. I (C) og (D), ble cellenes levedyktighet bestemt ved MTT-analysen, og levedyktigheten til luteolin-behandlede celler ble betraktet som 100%. Dataene er gjennomsnitt ± S.D. av minst to uavhengige eksperimenter. **, P 0.01.
For å avgjøre om S1P utøver beskyttende effekt på luteolin-indusert død gjennom en sti som involverer S1PRs, to farmakologiske hemmere med ulike virkningsmekanismer ble utnyttet. Siden binding av S1P til S1P1-reseptoren har blitt vist å være involvert i kolitt-indusert kreft [33], evaluerte vi først den mulige rollen til S1P1 reseptoren i S1P effekt på CC celler. Den spesifikke S1P1 agonister SEW2871 var ute av stand til å etterligne S1P beskyttende effekt på luteolin toksisitet (figur 6C), og den S1P antagonist W123 var uten relevante effekter på S1P-mediert overlevelse av CC-celler (figur 6C, kolonnene 3 og 4, henholdsvis). For å løse spørsmålet om S1P indusert pro-overlevelses effekter var avhengig av dens spesifikke G-protein koblede reseptorer, analysert vi celleoverlevelse i nærvær av PTX, fordi alle kjente S1P reseptorer er, i det minste delvis, sammen med Gi /o proteinet [34]. Som vist i figur 6C, PTX var ute av stand til å påvirke den stimulerende effekt av S1P på celleoverlevelse, noe som tyder på at PTX-sensitive G-proteiner som ikke er involvert i signalbaner av S1P forbedring av celle-overlevelse. Til slutt, for å undersøke muligheten for S1P å opptre som intracellulære mellommann, lastet vi CC celler med en photolysable (bur) derivat av S1P. Som vist i figur 6D, etter fotolyse, bur S1P viste en significative, beskyttende effekt mot luteolin-indusert celledød, og denne effekten holdt seg unmodified.in tilstedeværelsen av PTX.
Diskusjoner
I denne studien, vi innledningsvis rapportere at, luteolin viser en doseavhengig apoptotiske effekt på CC-celler i størrelsesorden 50-200 pM, kjent som fysiologisk konsentrasjon av diett polyfenoler i mage-tarmkanalen [35]. Av betydning, i det samme området av konsentrasjoner, det flavon viste ingen toksisitet i DES, brukt som modell av normale intestinale epitelceller. Dermed kommer det frem at luteolin utviser cytotoksisk aktivitet mot humane CC celler med liten eller ingen effekt på normale celler, noe som tyder på det kan representere en ideell kandidat for nye behandlingsformer.
Vår studie viser også for første gang at et økt innhold celle~~POS=TRUNC ceramid er ved roret av forskjellig følsomhet for dES og CC celler til luteolin toksisitet. Vi funnet at i de benyttede dyrkingsbetingelsene, CC-celler viste omtrent halvparten av nivåene av ceramid sammenlignet med DES. Av interesse, ble en tilsvarende nedgang i det cellulære innholdet av ceramid funnet i human kreft i tykktarmen, sammenlignet med normal tykktarmsslimhinne (15), hvilket antyder at CC-celler er spesielt følsomme for heving av ceramid. I tillegg fant vi at luteolin behandling forbedret ceramid nivået i CC celler, men ikke i Des. Puls eksperimenter med merket Sph og serin avslørte at både resirkulering vei, og
de novo
vei av ceramid syntese er involvert i luteolin-induserte økningen av ceramid i CC.
