Abstract
Mastermind-lignende en (MAML1) er en transkripsjons coregulator av aktivatorer i ulike signale veier, for eksempel Notch, p53, myocyte forsterker faktor 2C (MEF2C) og beta-catenin. I tidligere studier, viste vi at MAML1 forbedret p300 acetyltransferase aktivitet, noe som økte acetylering av Notch av P300. I denne studien viser vi at MAML1 sterkt indusert acetylering av transkripsjonsfaktoren tidlig vekstrespons-1 (EGR1) av P300, og øket EGR1 protein ekspresjon i embryoniske nyreceller.
EGR1
mRNA transkripter ble også oppregulert i nærvær av MAML1. Vi viser at MAML1 fysisk interaksjon med, og handlet samarbeide med EGR1 å øke transkripsjonen aktivitet av EGR1 og P300 arrangører, som begge inneholder EGR1 bindingssteder. Bioinformatikk vurdering avdekket en sammenheng mellom
p300
,
EGR1 Hotell og
MAML1
kopiere nummer og mRNA endringer i nyre klart cellekreft og
p300
,
EGR1 Hotell og
MAML1
genet endringer ble assosiert med økt totaloverlevelse. Våre funn tyder på MAML1 kan være en del av transkripsjons nettverk som regulerer EGR1 målgener under nephrogenesis og kan også ha betydning for utvikling av nyrecellekreft
Citation. Hansson ML, Behmer S, Ceder R, Mohammadi S, Preta G, Grafström RC, et al. (2012) MAML1 Apg samarbeide med EGR1 å Aktiver EGR1-regulert Arrangører: Konsekvenser for Nephrogenesis og utvikling av nyre kreft. PLoS ONE 7 (9): e46001. doi: 10,1371 /journal.pone.0046001
Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile
mottatt: 23 april 2012; Godkjent: 27 august 2012; Publisert: 27.09.2012
Copyright: © Hansson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne fikk støtte fra Vetenskapsrådet, svensk Kreftforeningen og svenske Barnas Cancer Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mastermind-lignende en (MAML1) er den menneskelige homolog av
Drosophila
Mastermind, en nevrogen genet genetisk koblet til Notch funksjon [1], [2]. Notch signalveien spiller en viktig rolle i mange utviklingsmessige prosesser ved å påvirke cellulær proliferasjon, differensiering og apoptose. I kjernen, Notch intracellulære domenet (Notch ICD) forbinder med transkripsjonsfaktor CSL (også kjent som RBP-Jk eller CBF1 i virveldyr, lyddemper av naken i
Drosophila Hotell og Lag-en i
C . elegans
) når det er bundet til DNA, og coactivators som PCAF [3], GCN5 [3], p300 [4] og MAML1 [1], [2] blir rekruttert for å aktivere ekspresjon av Notch målgener . Nylig MAML1 har vist seg å fungere som en coactivator for transkripsjonsfaktorer som er involvert i en rekke Notch-uavhengige signalveier, inkludert myocyte enhancer faktor 2C (MEF2C) [5], p53 [6] og p-catenin [7], og den N-terminale ende av MAML1 er avgjørende for disse interaksjonene. Disse funnene tyder på at MAML1 fungerer som en coactivator i ulike cellulære prosesser og kan være en formidler av crosstalk mellom ulike signalveier. MAML1 kan også påvirke ulike signalveier ved å samhandle med P300, en vanlig brukt coactivator. Vi og andre forskere har tidligere rapportert at MAML1 formidler Notch ICD-mediert transkripsjon in vivo, og kan også danne kromatin maler in vitro, ved å rekruttere p300 til en DNA-CSL-Notch kompleks [8], [9], [10]. Vi har nylig rapportert at MAML1 forbedrer p300 autoacetylation, histon acetyltransferase (HAT) aktivitet og coactivator funksjon [11]. Vi fant også at p300 acetylates den Notch1 ICD i cellekulturanalyser og
in vitro
, og at regionene ligger innenfor Notch C-terminalen er avgjørende for Notch acetylering. MAML1 og CSL, komponenter av Notch transkripsjon kompleks, sterkt forbedre hakk acetylering og vi foreslo at MAML1 øker Notch acetylering ved potensiering p300 autoacetylation [12]. P300 kan også acetylere MAML1, selv om virkningen av denne posttranslasjonell modifikasjon på funksjonen av MAML1 er for tiden ukjent. MAML1 er en fosfoprotein, og vi tidligere identifisert GSK3ß som en kinase ansvarlig for fosforylering av MAML1
in vitro product: [13]. Den aktive form av GSK3ß kommuniserer direkte med N-terminalen av MAML1 å inhibere MAML1 transkripsjonen aktivitet [13]. I tillegg er det MAML1 N-terminalen i henhold til SUMOylation, som også undertrykker transkripsjonen aktivitet av MAML1 [14].
transkripsjonsfaktor tidlige vekstrespons-1 (EGR1) uttrykkes som reaksjon på forskjellige ekstracellulære signaler , slik som vekstfaktorer, cytokiner, bestråling, og forskjellige typer stress. I mange normale celler, vekstfaktor stimulering raskt induserer ekspresjon av EGR1, som senere fører til aktivering av nedstrøms vekstbanene [15]. Imidlertid kan EGR1 også undertrykke vekst når den overuttrykkes i transformerte celler i en rekke eksperimentelle systemer [16]. Den cellulære responsen på EGR1 med hensyn til apoptose varierer: EGR1 kan indusere apoptose ved å stimulere enten p53 eller PTEN; kan imidlertid EGR1 også fremme overlevelse i visse celletyper ved å motvirke p53-avhengig apoptose [17]. EGR1 spiller en viktig rolle som en tumor suppressor i bryst, hjerne og lungekreft, som EGR1 er dårlig uttrykt i disse vev og fungerer som en suppressor av vekst og transformasjon når overexpressed [16]. I motsetning til dette synes ekspresjonen av EGR1 å bli opprettholdt på en høy andel av prostata og nyrekreft, hvor den fremmer vekst. EGR1 er fraværende eller uttrykt på lave nivåer i normale prostata vev; mens EGR1 promoteren reguleres ved en positiv tilbakekoplingssløyfe mellom EGR1 og vekstfaktorer i prostatakreftceller, noe som resulterer i konstitutiv vekst. Prostata kreftvev også uttrykker høye nivåer av p300, noe som fører til konstitutivt høye nivåer av stabil acetylert EGR1 protein, som er en viktig komponent i transformasjonen og utviklingen av sykdommen [18]. Nivåene av EGR1 øker med graden av malignitet i prostata cancer, som antydet med Gleason tumor stillingen [15]. Evnen til å redusere EGR1 uttrykk kan gi et effektivt klinisk behandling for prostatakreft, som nedregulering av EGR1 kan redusere vekstfaktor induksjon og positive tilbakemeldinger til EGF1 arrangøren.
EGR1 har vært innblandet som en viktig faktor i nephrogenesis og utvikling av nyrekreft. I løpet av embryogenesen, er EGR1 uttrykt i nesten alle celler deriblant metanephric blastems; men det er imidlertid vanligvis nedregulert under nedsatt utvikling [19]. Uttrykk for EGR1 er også forhøyet i mange Wilms «tumor i forhold til normal nyre vev. Wilms tumor er en pediatrisk malignitet i nyrene, noe som ofte er av embryonale opprinnelse [20]. Overekspresjon av EGR1 er rapportert å øke spredning, øke tumorvekst og motvirke effekten av tumor suppressor Wilms tumor 1 (WT1) i babyrottenyreceller [21]. Nyrecellekarsinom (RCC) er den vanligste nyrekreft hos voksne, sto for 80-85% av primære nyre malignances. Clear celle (vanlig) RCC og renal papillær karsinom er de mest og nest hyppigste typer RCC, henholdsvis. Strefford og kolleger rapporterte at kromosom 5 var overrepresentert og bearbeidet i en betydelig andel av 19 nyrecellekreft cellelinjer, med gener som koder
EGR1 plakater (5q31.1) og
CSF1R plakater (koloni stimulerende faktor 1 reseptor) (5q33-q35) oftest endret på kromosom 5, ytterligere støtte en rolle for EGR1 i nyrekreft [22]. I en tidligere studie rapporterte vi at MAML1 økt p300 autoacetylation og p300 acetylering aktivitet i embryonale nyre (HEK293) celler [11]. Målet med denne studien var å undersøke om MAML1 og p300 regulere nivåene av EGR1 i nyreceller.
Materialer og metoder
Plasmider
pcDNA3.1-FLAG- EGR1 og pGL3-p300 ble kjøpt fra Addgene (Cambridge, MA, USA). Plasmidet 4xEBS1-Luc var en slags gave fra Dr. G. Thiel (Universitetet i Saarland Medical Center, Homburg, Tyskland) og pGl3-EGR1 ble sjenerøst gitt av Dr. T.E. Eling (National Institute of Environmental Health Sciences, NC, USA). pcDNA3.1-FLAG-MAML1 (1-1016), (1-625) og CMV-P300-HA har blitt beskrevet tidligere [11]. CDNA koding MAML1 (1-127) og (75-1016) ble forsterket ved PCR og subklonet inn i ekspresjonsvektoren FLAG-pcDNA3.1.
Cellelinjer
MAML1 cellelinjer var konstruert ved trans humane embryonale nyre (HEK) -293 celler med vektorene pcDNA3.1-FLAG-MAML1 eller pcDNA3.1-MAML1 og stabile kloner ble valgt med geneticin [11].
siRNA transfeksjon
HEK-293 celler ble transient transfektert med 100 nM MAML1 siRNA (forhåndsutformet MAML1 SMARTpool sett av 4 siRNAs, Dharmacon) eller styrer siRNA hjelp DharmaFECT 1 siRNA reagenser (Dharmacon, Lafayette Colorado, USA), og dyrket i nærvær eller fravær av 50 ng /ml TPA (12-tetradekanoylforbol-13-acetat) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA).
Reporter gen assay
HEK-293 celler i 24 -vel platene ble transient transfektert ved hjelp av transitt-LT1 reagens (Mirus, Madison, WI, USA) med 200 ng reporter plasmid DNA og 150 ng EGR1 eller MAML1 uttrykk vektor-DNA, som indikert på figurene. Cellene ble lysert i Reporter Lysis-buffer (Promega, Madison, WI, USA) etter 24 timer og luciferase-aktiviteten ble målt under anvendelse av LucySoft3. Dataene er angitt som middelverdier av minst tre uavhengige eksperimenter.
real-time PCR
Total RNA ble renset ved anvendelse av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge produsentens protokoll og cDNA ble syntetisert ved å bruke Superscript III første-strand syntese system (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Real-time PCR ble utført ved hjelp av Power SYBR Grønn mester mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) på en Applied Biosystems 7500 Sequence detektor ved hjelp av følgende primere sett:
EGR1
fremover, 5′-TACGAGCACCTGACCGCAG- 3 «;
revers, 5′-CACCAGCACCTTCTCGTTGTT-3′;
18S rRNA fremover, 5′-CCTGCGGCTTTAATTTGACTCA-3 «;
revers, 5′-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGTC- 3 «.
EGR1
mRNA uttrykk var normalisert til 18S rRNA i hver prøve.
In vivo
acetylering analysen
HEK -293 celler ble transient transfektert med pcDNA3.1-FLAG-EGR1, pcDNA3.1-MAML1 og CMV-P300-HA bruker transitt-LT1 transfeksjon reagens (Mirus, Madison, WI, USA). Etter 24 timer ble cellene behandlet med 10 mM natriumbutyrat. Cellene ble høstet 40 timer etter transfeksjon ble lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 og komp EDTA-fri proteaseinhibitor Pierce). Immunpresipitasjon av FLAG-EGR1 ble utført ved hjelp av M2-agarose som gjenkjenner FLAG epitop. Inngangs og immunoutfellingsstudier (IP) Prøvene ble analysert ved Western blotting ved hjelp av følgende antistoffer: EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), den acetylerte lysines i EGR1 (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA), p300 (Santa Cruz Bioteknologi, CA, USA), MAML1 (Bethyl Laboratories, Cambridge, Storbritannia,. Millipore, Billerica, MA, USA) og acetylert p300 lysin 1499 (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA)
Co- immunoprecipitation
Hel-cellelysater fra HEK-293 celler ble pre-ryddet og endogene MAML1 ble immunopresipitert ved hjelp av en MAML1 antistoff (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Inngangs og IP-prøvene ble analysert ved Western blotting ved hjelp av følgende antistoffer:. MAML1 (Bethyl laboratorier, Cambridge, Storbritannia) og EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)
farging
HCT116-celler ble transfektert med pcDNA3-FLAG-EGR1 og pcDNA3.1-MAML1 bruker transitt-LT1 transfeksjon reagens (Mirus, Madison, WI, USA), inkubert i 24 timer, vasket med PBS, fast med 4% paraformaldehyde, og permeabilized med 0,5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Cellene ble immunostained hjelp FLAG (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) og MAML1 (Millipore, Billerica, MA, USA) antistoffer, og analysert ved hjelp av en Leica konfokal mikroskopi (Leica Microsystems, Wetzler, Tyskland).
GST rullegardin analysen
HEK293 celler ble transfektert med pcDNA3.1-FLAG-EGR1 bruker transitt-LT1 transfeksjon reagens, og dyrket i 2 timer med 50 ng /ml TPA 24 timer etter transfeksjon . Helcellelysater ble fremstilt, og 100 ul alikvoter av proteinekstrakt i lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM DTT og 1 x komplett EDTA-fri protease-inhibitor cocktail) var inkubert med GST-proteiner (fremstilt som beskrevet i [14]) bundet til glutation Sepharose 4B kuler (GE Healthcare, Little Chalford, Storbritannia) i BC-150 buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM KCl, 10% glyserol ) over natten ved 4 ° C. Etter vasking med BC-150 buffer, ble de bundne proteiner eluert i SDS-PAGE ladningsbuffer (1 M Tris-HCl pH 6,8, 50% glycerol, 10% SDS, 1% bromfenolblått, 1 mM DTT), separert ved hjelp av 7,5% SDS-polyakrylamidgeler, overført til PVDF membraner (GE Healthcare, Little Chalford, Storbritannia) og inkuberes med et antistoff som gjenkjenner EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).
Protein stabilitet analysen
HEK-293 FLAG-MAML1 og HEK-293-kontroll-celler ble dyrket i 24-brønners plater og behandlet med 50 ng /ml TPA i 2 timer og 50 ug /ml cykloheksamid (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) i 1 time. Cellene ble høstet i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 og komp EDTA-fri protease-inhibitor cocktail), ble proteinene separert ved hjelp av SDS-PAGE og utsatt for immunblotting ved anvendelse av en antistoff som gjenkjenner EGR1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Intensiteter av båndene ble kvantifisert med bilde J (rsb.info.nih.gov/ij/index.html).
bioinformatiske analyse av
MAML1, EGR1 Hotell og
p300
uttrykk for
MAML1
,
EGR1 Hotell og
p300
ble analysert i tumorprøver fra 20 ulike studier av kreft ved hjelp av web-baserte cBio Cancer Genomics Portal (https://www.cbioportal.org/, sist 07/26/12) inkludert genomikk data, for eksempel DNA kopitalldata fra 5134 prøver (matrise-komparativ genomisk hybridisering) og mRNA uttrykk data fra 2430 prøver ( RNA-sekvensering). Antatte kopitall endringer som presiseringer og homozygot slettinger ble utledet i portalen ved hjelp av «genomisk identifikasjon av betydelige mål i kreft» algoritme [23]. De mRNA uttrykk forandringene anses vesentlig dersom prøvene viste en Z-score ≥2 sammenlignet med referansegruppen (diploide tumorer eller normale nærliggende vev hvis aktuelt). Foreningen av endret genuttrykk med total overlevelse ble undersøkt i utvalgte kreftstudier ved hjelp av Kaplan-Meier analyse. Pasientprøvene ble delt i to grupper basert på «genet sett endret» eller «genet satt ikke endret» ved hjelp av de valgte genomikk data, og betydelig overlevelse forskjeller mellom gruppene ble bestemt ved bruk av log-rank test;
p
-verdier 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Diskusjon
MAML1 regulerer EGR1 mRNA og protein uttrykk
Resultater og
EGR1 protein stabilitet har vært. rapportert å være stabilisert av p300 acetylering, noe som resulterer i at transaktivering av overlevelses gener [18]. Som vi tidligere har funnet at MAML1 øker p300 autoacetylation, som forbedret acetylering aktivitet av p300 [11], vi dro ut for å undersøke om EGR1 uttrykk nivåer kan være forhøyet ved MAML1. Først transfektert vi embryonisk nyre (HEK-293) celler med
MAML1
siRNA eller kontroll (Ctrl) siRNA, og dyrkes cellene i nærvær av TPA for å indusere ekspresjon av EGR1. Proteinene ble oppdaget av immunblotting med antistoffer som gjenkjenner MAML1, EGR1 og GAPDH. Ekspresjon av EGR1 ble indusert i celler dyrket med TPA (figur 1A, banene 3 og 4); mens nivåene av EGR1 ble redusert i celler behandlet med
MAML1
siRNA (felt 4), sammenlignet med celler behandlet med kontroll siRNA (felt 3). Neste, vi forberedt hele celleekstrakter fra HEK-293 celler stabilt uttrykker MAML1 og kontroll HEK-293 celler, etter induserende uttrykk for EGR1 med TPA. Proteinene ble oppdaget av immunblotting med antistoffer som gjenkjenner MAML1, EGR1 og GAPDH. Som vist i figur 1B, ble EGR1 indusert med TPA (sporene 2 og 4), og ekspresjonen av EGR1 betydelig øket i celler som overuttrykker MAML1 (felt 4). Deretter undersøkte vi om MAML1 påvirket
EGR1
mRNA nivåer. HEK-293 celler ble transfektert med
MAML1
siRNA eller kontrollere siRNA, dyrket med TPA i 2 timer, og
EGR1
mRNA uttrykk ble analysert ved real-time RT-PCR. Transfeksjon av HEK-293 celler med
MAML1
siRNA betydelig redusert uttrykk for
EGR1
mRNA, sammenlignet med celler transfektert med kontroll siRNA (figur 1C). Etter avtale med denne observasjonen,
EGR1
mRNA økte i MAML1-uttrykkende cellelinje etter induksjon med TPA, sammenlignet med kontroll HEK-293 celler (figur 1D). Dermed våre data antydet at MAML1 kan være involvert i reguleringen av EGR1 mRNA og protein uttrykk i embryonale nyreceller.
(A) HEK-293 celler ble transfektert med
MAML1
siRNA eller kontroll (Ctrl) siRNA, og dyrket i nærvær av TPA å indusere uttrykk for EGR1. Proteiner ble oppdaget av immunblot bruker antistoffer som gjenkjenner MAML1, EGR1 og GAPDH. (B) Hele celleekstrakter ble fremstilt fra celler som uttrykker MAML1 og kontroll HEK-293-celler dyrket med TPA. Proteiner ble påvist ved immunblotting ved å bruke de angitte antistoffer. (C) HEK-293 celler ble transfektert med
MAML1
siRNA eller kontrollere siRNA, dyrket med TPA; deretter
EGR1
mRNA uttrykk ble analysert ved real-time PCR. (D) HEK-293 kontrollceller og HEK-293 celler stabilt uttrykker FLAG-MAML1 ble dyrket med TPA; deretter
EGR1
mRNA uttrykk ble analysert ved real time PCR. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM) og uttrykt i forhold til
EGR1
nivåer i kontroll HEK-293-celler dyrket i fravær av TPA.
EGR1 har en distinkt rom-tid-uttrykk mønster under nephrogenesis [19], og forstyrrelser i reguleringen av EGR1 protein uttrykk kan føre til uønskede effekter på normal celle skjebne. Overekspresjon av EGR1 har blitt rapportert å øke proliferasjonen av nyreceller og forbedre tumorigenesis [21]. Derfor proteiner påvirker uttrykket av EGR1, slik som MAML1, kan til slutt være koblet til EGR1 signalveien, som avgjør celle skjebne.
MAML1 fysisk kommuniserer med EGR1
Vi neste undersøkt om MAML1 kan indusere uttrykk for en EGR1 mål promoter, ved trans den 4xEBS-Luc reporter inneholder fire EGR1 bindingsseter til celler som uttrykker FLAG-MAML1 og kontroll HEK-293 celler, og dyrking av cellene med TPA. Reporteren aktiviteten økt når EGR1 ble indusert i kontrollceller ved hjelp av TPA; imidlertid, ble det rapportøraktivitet forbedrede nesten tre ganger i FLAG-MAML1 celler dyrket med TPA, sammenlignet med kontroll-celler dyrket med TPA (figur 2A). I tillegg HEK-293-celler ble ko-transfektert med 4xEBS-Luc og vektorer som uttrykker EGR1 og /eller MAML1. Mens både EGR1 og MAML1 økt aktivitet av EGR1 arrangøren; sammen EGR1 og MAML1 synergi induserte en 500-gangers økning i aktiviteten i EGR1 målet promoter (figur 2B). Dermed våre data tyder MAML1 kan bli rekruttert til arrangører regulert av EGR1, for å øke uttrykket av gener som reguleres av EGR1.
(A) FLAG-MAML1 uttrykke celler og HEK-293 kontrollceller ble transfektert med en luciferase reporter inneholder fire EGR1 bindingsseter (4xEBS-Luc) og kultivert med TPA å indusere uttrykk for EGR1. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. (B) HEK-293 celler ble ko-transfektert med 4xEBS-Luc og vektorer som uttrykker EGR1 og MAML1. (C) Hel-celle-ekstrakter ble fremstilt fra HEK-293-celler og MAML1 protein ble immunopresipitert ved bruk av et antistoff som gjenkjenner MAML1. Proteinene ble separert ved SDS-PAGE og analysert ved western blotting ved bruk av antistoffer som gjenkjenner og MAML1 EGR1. (D) vektorer som uttrykker FLAG-EGR1 og MAML1 var co-transfektert inn HCT116-celler; etter 24 timer ble cellene immunostained bruker de angitte antistoffer og analysert ved konfokalmikroskopi med 100 × olje linse.
For å belyse om MAML1 samhandler med EGR1, ble hel-celle ekstrakter fremstilt fra HEK-293 celler og MAML1 immunoutfelt bruker et antistoff som gjenkjenner MAML1. Proteinene ble separert ved SDS-PAGE og Western blotting ble utført ved anvendelse av antistoffer som gjenkjenner og MAML1 EGR1. Som vist i figur 2C, MAML1 og EGR1 interaksjon i de cellulære ekstrakter (kolonne 3). For å avgjøre om EGR1 colocalized med MAML1, HCT116 cellene ble ko-transfektert med flagg EGR1 og MAML1 vektorer og immunostained med antistoffer gjenkjenne FLAG og MAML1. EGR1 og MAML1 var sterkt colocalized i kjernen (figur 2D). Vi la merke til at uttrykket mønster av EGR1 i kjernen endret i nærvær av MAML1. Vi, og andre, har tidligere rapportert at MAML1 colocalize MAML1-samspill proteiner til kjernefysiske organer [24]. Våre data antyder at EGR1 og MAML1 kan utgjøre en del av en transkripsjonen enhancer kompleks, noe som kan øke ekspresjonen av gener med EGR1 bindingssteder. Både MAML1 og EGR1 er endogent uttrykt i embryonale nyreceller, og begge disse transkripsjonsfaktorer er blitt vist å regulere genekspresjon i løpet av utviklingsprosesser [25], [26]; Imidlertid er det fortsatt ikke klarlagt hvorvidt MAML1 og EGR1 samarbeide for å regulere noen av disse genene.
MAML1 og EGR1 synergi aktivere p300 arrangøren
p300 arrangøren har blitt rapportert å inneholde EGR1 bindingssteder og for å bli regulert av EGR1 [18]. Derfor vi co-transfekterte HEK-293-celler med en p300-luc reporter og vektorer som uttrykker EGR1 og MAML1, og deretter dyrket cellene i nærvær av TPA. EGR1 alene aktivert P300-luc reporter i nærvær av TPA, og ko-transfeksjon av MAML1 med EGR1 økt kraftig aktiviteten av P300 reporter (figur 3A). Vi antok at MAML1 kan regulere ekspresjonen av P300, samt acetylering aktiviteten til p300 [11]. Lysater ble fremstilt fra en FLAG-MAML1 cellelinje og HEK-293-kontrollcellene, og nivåene av p300 ble analysert ved Western blotting ved å bruke et antistoff som gjenkjenner P300. Ekspresjonen av P300 økte i MAML1-uttrykkende cellelinje, sammenlignet med kontrollceller (figur 3b, sammenlign spor 2); mens uttrykket nivået av GAPDH, som ikke er en MAML1 mål, var den samme i begge cellelinjene (banene 1 og 2).
(A) HEK-293-celler ble ko-transfektert med et P300-luc reporter , EGR1 og MAML1, deretter dyrket i nærvær av TPA for å indusere ekspresjon av EGR1. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. (B) Hele celle ekstrakter ble preparert fra FLAG-MAML1 transfekterte og kontroll HEK-293 celler (Ctrl) og MAML1, P300 og GAPDH ble oppdaget av Western blotting. (C) Hel-celle ekstrakter ble fremstilt fra HEK-293 celler transfektert med vektorer som uttrykker FLAG-EGR, MAML1 og p300; FLAG-EGR1 ble immunoutfelt bruker et antistoff som gjenkjenner den FLAG epitop. Proteinene ble separert ved SDS-PAGE og detektert ved Western-blotting ved bruk av antistoffer som gjenkjenner EGR1, acetylerte lysiner i EGR1, MAML1, p300 og acetylert lysine1499 av P300. (D) HEK-293 celler som stabilt uttrykker FLAG-MAML1 og HEK-293-kontroll-celler ble dyrket med TPA (2 timer) i nærvær eller fravær av cykloheksamid (1) og EGR1 protein-ekspresjon ble analysert ved Western blotting ved å bruke et antistoff som gjenkjenner EGR1 . I diagrammet, er EGR1 protein ekspresjon i MAML1 stabil cellelinje uttrykkes i forhold til kontrollceller behandlet med cykloheksamid. Forholdet mellom båndintensitetene før tilsetningen av cykloheksimid og etter 1 time med behandling med cykloheksimid ble bestemt med bilde J.
EGR1 er et substrat for acetylering av p300 [18], og vi har tidligere vist at MAML1 regulerer p300 aktivitet ved å øke p300 autoacetylation [11]. Derfor undersøkte vi om MAML1 regulerer p300 avhengige acetylering av EGR1. Hel-celleekstrakter ble fremstilt fra HEK-293-celler og EGR1 ble immunpresipitert ved hjelp av et antistoff som gjenkjenner EGR1. Proteinene ble separert ved SDS-PAGE og Western blotting ble utført ved anvendelse av antistoffer som gjenkjenner EGR1, den acetylerte lysinene i EGR1, MAML1, P300 og det acetylerte lysin i 1499 av P300 (en markør for P300 autoacetylation). Vi la merke til at uttrykket av EGR1 økt i nærvær av co-uttrykt MAML1 og /eller p300 (figur 3C, sammenlign spor 1 til baner 2-4). Men vi bare har registrert acetylert EGR1 i nærvær av ko-uttrykt p300 (banene 3 og 4), som sterkt økt i nærvær av MAML1 (felt 4). Den økte ekspresjon av EGR1 protein i nærvær av ko-uttrykt MAML1 (kolonne 2) kan være på grunn MAML1 avhengig opp-regulering av EGR1 mRNA (se figur 1). Etter avtale med våre tidligere observasjoner, ble p300 autoacetylation signifikant økt med MAML1 (sammenlign spor 3 og 4). Derfor antar vi at autoacetylated p300 acetylates EGR1 mer effektivt.
Mange rapporter har beskrevet hvordan acetylering kan øke proteinstabilitet [27]. Derfor indusert vi uttrykk for EGR1 hjelp TPA i celler som stabilt uttrykker MAML1 og HEK-293 kontrollceller. Etter 1 time inkubering med cykloheksamid, betydelig mer EGR1 protein var til stede i den MAML1-uttrykkende cellelinje sammenlignet med kontrollceller (Figur 3D). Derfor foreslår vi at MAML1 kan være involvert i regulering av stabiliteten i EGR1, muligens ved å øke acetylering av EGR1. Acetylering av EGR1 av p300 er blitt rapportert å øke proteinnivåer EGR1, for å stimulere ekspresjon av cellevekst og overlevelse gener som FGF2, PDGFB, TGFB1 og IGF2, og følgelig spiller en avgjørende rolle i prostatakreft [15], [18 ]. Som EGR1 blir uttrykt ved høye nivåer i prostata kreft, og også visse renale kreft [21], [22], gjenstår det å bli undersøkt hvorvidt P300-avhengige acetylering av EGR1 påvirker ekspresjonen av EGR1 målgener eller spiller en rolle i utviklingen av nyrekreft.
N-terminalen av MAML1 samarbeider med EGR1 under transkripsjonen aktivering
MAML1 protein inneholder ulike domener, som er viktig for protein interaksjoner og funksjonen til MAML1 (se skjematisk i Figur 4A). Aminosyrer 1-74 av MAML1 samhandle med Notch ICD og MEF2C, mens aminosyrer 75-305 er viktig for samspillet med P300. Det N-terminale domenet av MAML1 interagerer med p53 og GSK3ß [24]. For å undersøke hvilke MAML1 domenet er nødvendig for aktivering av arrangører regulert av EGR1, plasmider uttrykker EGR1 og ulike MAML1 domener ble co-transfektert med 4xEBS-Luc reporter, som inneholder fire EGR1 bindingsseter, i HEK-293 celler. Som vist i figur 4B, MAML1 (1-1016) og (75-1016) sterkt forbedret luciferasereportergenet aktivitet i nærvær av EGR1, mens MAML1 (1-625) hadde ingen påviselig virkning på EGR1-promoteren aktivering. MAML1 (1-1016) og (75-1016) ble uttrykt på samme nivå i cellekultur-analyse, mens vi oppdaget at høyere nivåer av MAML1 (1-625) (figur 4C).
(A) Skjematisk illustrasjon av MAML1 domener. (B) HEK-293 celler ble ko-transfektert med 4xEBS-Luc og vektorer som uttrykker EGR1, MAML1 og trunkeringer av MAML1, som vist i figuren. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD. (C) Western blot som viser ekspresjonsnivåene av MAML1 full-lengde og mutante proteiner i HEK-293-celler. (D) PageBlue Protein-farget SDS-gel som viser migrering av de rensede GST-merkede MAML1 proteiner som brukes for protein-protein interaksjon assay. (E) GST-taggede MAML1 derivater og GST koblet til glutation-Sepharose perler ble inkubert med HEK-293 hele celleekstrakter, og MAML1-samspill EGR1 ble oppdaget av immunblotting. Inngangs utgjør 2% av hele celleekstrakt anvendt i bindingsreaksjonen. (F) HEK-293-celler ble ko-transfektert med 4xEBS-luc og vektorer som uttrykker EGR1, MAML1 (1-1016) og (1-127). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD.
For å undersøke hvilken del av MAML1 samhandler med EGR1 ble full-lengde GST-merket MAML1 protein og MAML1 derivater (Figur 4D) inkuberes med helcelle ekstrakter fra HEK293 celler transfektert med EGR1. EGR1 samhandlet sterkt med full lengde GST-MAML1 protein og MAML1 (1-300); men bare viste en uke interaksjon med MAML1 (1-625) og (309-625) (figur 4E). Siden vi oppdaget en sterk EGR1-interaksjon spesielt med MAML1 (1-300), vi undersøkes nærmere rollen som den N-terminale MAML1 i EGR1 transkripsjon av co-trans HEK-293 celler med 4xEBS-Luc reporter og plasmider uttrykker EGR1, MAML1 full lengde og MAML1 (1-127). Som vist på figur 4F, MAML1 (1-127) trykt den MAML1-EGR1 synergistisk aktivering av EGR1-promoteren. Vi konkluderer med at et domene innenfor aminosyrer 75-127 av MAML1 kan være viktig for synergistisk effekt av MAML1 og EGR1 på gentranskripsjon. Den MAML1 N-terminus er rapportert å samvirke med hakk, MEF2C, p53 og GSK3beta, og å spille en viktig rolle i den transkripsjonelle aktivitet av disse faktorene [1], [2], [5], [6], [13] . Det N-terminale domenet av MAML1 er også nødvendig for interaksjonen av MAML1 med p300, noe som fører til økt P300 autoacetylation og HAT-aktivitet [12]. I tillegg inneholder MAML1 to N-terminale SUMOylation steder (K217 og K299) som undertrykker MAML1 aktivitet [14]. Derfor bør interaksjoner av MAML1 undersøkes nærmere, for å avgjøre om samspillet mellom EGR1 med MAML1 skjer i konkurranse, eller kanskje i synergi med andre transkripsjonsfaktorer som Notch og p53.
MAML1 positivt korrelerer med EGR1 og p300 i nyrekreft
Basert på den sterke mekanistisk bevis presenteres for co-regulering mellom MAML1, EGR1 og p300, vurderes vi en genomikk database for slike forhold. Vår bioinformatiske analyse av kopinummer endringer (inkludert presiseringer og homozygot slettinger) i
MAML1
,
EGR1 Hotell og
p300
gen sett avdekket forandringer i 18 av 20 kreft
