Abstract
Behandling av
EGFR
-mutant ikke-småcellet lungekreft pasienter med tyrosinkinasehemmere erlotinib eller gefitinib resulterer i høye responsrater og forlenget progresjonsfri overlevelse. Til tross for utviklingen av sensitive mutasjon deteksjon nærmer seg, en grundig validering av disse i en klinisk setting har så langt vært mangelfull. Vi utførte, i en klinisk setting, en systematisk validering av dideoxy «Sanger» sekvensering og pyrosekvensering mot massivt parallell sekvensering som en av de mest følsomme mutasjon sporingsteknologien tilgjengelig. Mutasjons annotering av kliniske lungetumorprøver viste at av alle pasienter med en bekreftet svar på
EGFR
hemming, bare massivt parallell sekvense oppdaget alle relevante mutasjoner. I motsetning dideoksysekvensering tapte fire respondere og pyrosekvensering tapte to respondere, noe som indikerer en dramatisk mangel på sensitivitet på dideoksysekvensering, som er mye brukt for dette formål. Videre presis kvantifisering av mutante alleler avdekket en lav korrelasjon (r
2 = 0,27) av histopatologiske estimater av svulst innhold og hyppighet av mutante alleler, og dermed stille spørsmål ved bruk av histopatologi for stratifisering av prøver for individuelle analytiske prosedyrer. Våre resultater tyder på at forbedret analytiske sensitiviteten er kritisk nødvendig for å korrekt identifisere pasienter som responderte til
EGFR
hemming. I videre forstand, våre resultater understreke behovet for grundig evaluering av alle mutasjonsdeteksjon tilnærminger mot massivt parallell sekvensering som en forutsetning for klinisk implementering
Citation. Querings S, Altmüller J, Ansén S, Zander T, Seidel D , Gabler F, et al. (2011) Benchmarking mutasjon Diagnostics i klinisk Lung Cancer prøver. PLoS ONE 6 (5): e19601. doi: 10,1371 /journal.pone.0019601
Redaktør: Markus Schuelke, Charité Universitätsmedizin Berlin, NeuroCure Clinical Research Center, Tyskland
mottatt: 07.12.2010; Godkjent: 02.04.2011; Publisert: 05.05.2011
Copyright: © 2011 Querings et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den tyske kreft Aid som en del av Centers of Excellence i onkologi program til sentrum av Integrated Oncology Köln – Bonn og ved føderale tyske departementet for vitenskap og utdanning (BMBF) som en del av den nasjonale Genome Research Network program (NGFNplus , gir 01GS08100 og 01GS08101) til Jürgen Wolf, Peter Nürnberg og Roman Thomas. De bevilgende myndighet ikke hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Roman K. Thomas mottatt forskningsstøtte fra Astrazeneca og mottatt forelesnings eller konsulenthonorar fra Roche , Boehringer Ingelheim, Johnson Johnson, Astrazeneca, Lilly, Merck, Atlas Biolabs og Sanofi-Aventis. Jürgen Wolf mottatt forskningsstøtte og fungerte som konsulent for Roche og Astrazeneca. Forskning støtte nevnt i denne delen ble ikke brukt for å gjennomføre denne studien. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
I første omgang begrenset til sjeldne svulster som kronisk myelogen leukemi (KML) eller gastrointestinal stromal tumor (GIST), har suksessen til behandling av mutasjons aktiverte kinaser med kinase hemmere nådde gruppen av de hyppige «solid» svulster og har dermed svært forandret klinisk onkologi. Behandling av pasienter som lider av
EGFR
-mutant kreft med
EGFR
hemmere fører til objektiv respons [1], [2], [3], en dobling i progresjonsfri overlevelse sammenlignet til standard kjemoterapi og til lang samlet overlevelse [4], [5]. Lignende par av genomiske lesjoner og målrettede medikamenter er
BRAF
mutasjon og
BRAF
hemming [6]
PARP
hemming og
BRCA1 /BRCA2
mutasjoner [7 ], [8] eller
PDGFRA Twitter /
KIT
mutasjon og imatinib [9]. I lys av dagens innsats for å systematisk sekvensere genomet til alle de store krefttyper (https://www.icgc.org/eller www.cancergenome.nih.gov), listen over genetisk definerte svulster som er utsatt for en bestemt terapeutisk intervensjon er sannsynlig å utvide dramatisk de neste årene. Sammen utgjør disse observasjonene tyder på et raskt voksende behov for følsom og nøyaktig mutasjonsdeteksjon i kliniske prøver som en del av rutinemessig klinisk omsorg.
Dessverre, selv om den ser trivielt, klinisk implementering av mutasjonsdeteksjon møter både utvalgsmessig og metodiske problemer : først, de fleste av kliniske prøver tilgjengelig er liten størrelse, formalinfiksert og parafin-embedded (FFPE) biopsier eller cytologiske prøver vanligvis som ga begrensede mengder av lav kvalitet DNA, som alle alvorlig påvirke PCR forsterkning og påfølgende analyser. Videre tumor sammensetning samt flere typer ikke-neoplastiske celler påvirke deteksjonen av tumorspesifikke somatiske mutasjoner i en bakgrunn av ikke-mutant, «wild-type» alleler. For det andre, konvensjonelle sekvenseringsfremgangsmåter mangler sensitivitet for påvisning av slike sjeldne alleler.
Flere metoder ble etablert for å gi sensitiv mutasjonspåvisning, alt inkludert DNA-ekstraksjon, PCR-amplifikasjon og påfølgende mutasjonsanalyse ved sekvensering eller genotype-baserte assays [ ,,,0],10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19]. I flere tilfeller er anrikning av tumorceller oppnådd tidligere mutasjonspåvisning, for eksempel ved laserassisterte mikrodisseksjon av tumorprøver [15], [17]. Dessverre er det en nesten universell manglende validering av klinisk relevant mutasjonsdeteksjon tilnærminger i kliniske settinger mot en følsom gullstandard tilnærming.
Vi har nylig introdusert massivt parallell sekvensering for mutasjonsdeteksjon i kliniske kreftprøver [20]. Slike tilnærminger er ansett for å gi den høyeste følsomhet for tiden er tilgjengelig for dette formål på grunn av evnen til å prøve sjeldne mutant alleler i en dominerende bakgrunnen av villtype-allel i enhver tumor prøven [20]. Videre er denne metode ikke er begrenset til et a-priori utvalg av mutasjoner som anses relevante. Derfor er massivt parallell sekvense ideell for å validere andre mutasjon deteksjonsmetoder.
I denne studien har vi validert to sekvensebaserte mutasjonsdeteksjon tilnærminger (dideoxy- og pyrosekvensering) mot parallell sekvensering i en klinisk setting, tar hensyn til tumorcelleinnhold samt kvaliteten og type vev (f.eks FF, FFPE) av hver prøve.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Dette studien ble godkjent av etikkomiteen av det medisinske fakultet ved Universitetet i Köln og alle pasienter ga skriftlig informert samtykke. En undergruppe av pasientene (n = 9) deltok i ERLOPET studie (NCT00568841).
tumorprøver og cellelinjer
I denne studien har vi analysert 24 tumorprøver hentet fra 22 pasienter ( tabell 1). Denne studien ble godkjent av den lokale etikkutvalg og alle pasientene gav skriftlig informert samtykke. En undergruppe av pasientene (n = 9) deltok i ERLOPET studie (NCT00568841). Vevsprøver ble anmeldt av en referanse patolog for å bestemme tumorcelleinnholdet for etterfølgende disseksjon av områdene med høyest tumorcelleinnhold. NSCLC cellelinjer som bærer forskjellig
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner ble oppnådd og dyrket som beskrevet tidligere (Supplementary Tabell S1) [21]. Genomisk DNA av alle vevsprøver og cellelinjer ble hentet ved hjelp Gentra Pure Gene Tissue Kit (Qiagen) etterfulgt av DNA kvantifisering hjelp Picogreen dsDNA reagenser (Invitrogen).
PCR og direkte dideoksysekvensering
EGFR
exon18-21 og
KRAS
ekson 2 og 3 ble forsterket av nestet PCR og genet bestemt ekstern og intern primerpar (Supplementary Tabell S2). Interne primere er utstyrt med M13-primer-sekvensen for å lette sekvensering. For eksterne PCR reaksjoner, brukte vi 5-10 ng (40-60 ng lav kvalitet DNA) av genomisk DNA. PCR-reaksjoner ble utført i et totalvolum på 50 ul (0,2 pM av hver primer, 2 mM MgCl
2, 200 pM av hver dNTP og 1,25 U HotStarTaq
Plus
DNA Polymerase (Qiagen)) og følgende sykkel betingelser: 95 ° C i 5 minutter, 30 sykluser ved 95 ° C i 30 sek, 60 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 minutt og endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 min. Etter ExoSAP-IT (USB Corporation) behandling PCR produktene var toveis sekvensert ved hjelp av M13-sekvense primere og BigDye Terminator Mix versjon 3.1 (Applied Biosystems) på ABI 3730 (Applied Biosystems). Sekvense electropherograms ble analysert ved visuell inspeksjon av electropherograms og ved mutasjon Surveyor 2,03 programvare (SoftGenetics). Fragment lengde analyse av
EGFR
ekson 19 ble utført av standard PCR (For-Hex-ctggatccagaaggtgaga og Rev-ccacacagcaaagcagaaac) resulterer i amplikonene av 118-bp (Ta = 59 ° C) for villtype ekson 19 . PCR produktene ble analysert på ABI 3700 DNA sequencer og scoret etter GeneMarker programvare (SoftGenetics).
pyrosekvensering analysene
Vi har utformet fem forskjellige pyrosekvensering [22] analyser for sekvensering analyse av
EGFR
ekson 19-21 og
KRAS
ekson 2 og 3 (Supplementary tabell S3). Mal DNA (6 ng genomisk DNA eller eksterne PCR-produkter) ble forsterket ved hjelp HotStarTaq
Plus
DNA Polymerase KIT (Qiagen) og standard protokoll (0,2 mikrometer av hver primer, 160 mM dNTP, 2 U enzym) og sykkelforhold (45 sykluser og Ta = 59 ° C for
EGFR
ekson 19, Ta = 60 ° C for
KRAS
ekson 2, Ta = 63 ° C for
EGFR
exon 20, Ta = 61 ° C for
EGFR
ekson 21 og
KRAS
ekson 3 og Ta = 60 ° C for
KRAS
exon 2). Omvendt PCR primere ble biotinylert for påfølgende pyrosekvensering analyse. Pyrosekvensering reaksjoner ble gjennomført på PSQ HS96A instrumentet med PSQ HS96A SNP reagenser og pyrosekvensering SNP analyse programvare (Biotage AB, Uppsala, Sverige, nå kalt PyroMark ™ Q96MD av Qiagen). For følsomhetsstudier, kvantifisert PCR-produkter av
EGFR
-mutant celler eller
KRAS
-mutant celler ble fortynnet med villtype
EGFR
eller villtype
KRAS
amplikonene, henholdsvis. Pyrosekvensering rå data signaler ble normalisert ved anvendelse av kjente vill-type signaler. Betydelig mutasjon kall ble bestemt fra eksperimentell støy ved statistisk analyse av rådata med T-test (p≤0.05).
Massivt parallell sekvense analyse
Massivt parallell sekvensering ble utført ved hjelp av GS FLX Standard eller GS FLX Titanium kjemi i henhold til standard protokoller (Roche). Amplicon bibliotekene ble generert ved hjelp av eksterne PCR-produkter som maler og standardprotokoller og betingelser Faststart Hifi PCR system (Roche) (Supplementary tabell S4). Vi brukte i gjennomsnitt 340.000 perler per løp givende 80,000 til 120,000 leser totalt og en amplicon dekning som strekker seg fra 600 × 1500 × med en gjennomsnittlig amplicon lengde på 250-300 bp dekker hele exon. Alle leser ble justert til chromsome 7 og 12 av referansen genomet (hg18) med BWA [23]. Til slutt, justert leser ble visualisert og analysert av Genomics Viewer (https://www.broadinstitute.org/igv/). Studentene T test ble brukt for sammenligning av relativ lese frekvens mellom
EGFR
mutert og villtype svulster. Vi setter sekvensefeilraten til 0,1% i områder uten homopolymerer [24]. Terskelen for betydelig deteksjon av muterte alleler ble definert ved anvendelse av en Poisson-fordeling av den kjente feilhyppigheten tar hensyn til dekningen som fører til en deteksjonsgrense mellom 0,3 og 0,5% mutante alleler.
Resultatene
pasienter og vevsprøver
fra september 2008 til april 2009, har vi analysert pasienter med histologisk bekreftet NSCLC for tilstedeværelsen av mutasjoner i eksoner 18-21 av
EGFR Hotell og eksoner 2 og 3 av
KRAS
. Pasientene som deltok i denne mutasjonen analysen studien er ikke representative for utbredelsen av slike mutasjoner i NSCLC som de ble beriket for saker med en økt sannsynlighet for å være
EGFR
mutasjonspositive basert på histologiske og kliniske funksjoner (for eksempel lunge adenokarsinom i aldri eller lyse ex-røykere). I denne benchmarking studien har vi analysert 24 svulster fra 22 pasienter (tabell 1) for en systematisk sammenligning av mutasjonsdeteksjon ytelsen av konvensjonell dideoxy- og pyrosekvensering mot en av de mest sensitive sekvenseringsteknologi, massivt parallell sekvensering [20]. Den tumor-celle-innholdet av hver av disse prøvene ble beregnet ved en patolog og varierte fra 5% til opp til 95%. Kliniske prøver omfattet formalinfiksert og parafininnstøpte (FFPE) tumorvev blokker samt fersk frosset (FF) biopsier eller cytologiske lysbilder hentet fra plevravæske (tabell 1).
Påvisning av klinisk relevante mutasjoner av fremgangsmåter for forskjellig følsomhet
Vi først utføres konvensjonelt dideoxy-kjedeterminerings nukleotid-baserte ( «Sanger») sekvensering på alle av disse prøvene, fordi til tross for sine begrensninger, er denne metode fremdeles den mest anvendte metode for deteksjon mutasjon i kliniske prøver. Vi har fastslått at følsomheten av denne sekvensering teknikken å variere fra 20-30% av muterte alleler ved blanding av PCR-produkter av
KRAS
-mutant og villtype-cellelinjer (Tilsetnings fig. S1). Mutasjon screening av 24 tumorprøver ved dideoksy-sekvensering avslørte kortere nukleotid-delesjoner i-ramme i
EGFR
exon 19 (Tabell 1, Fig. 1A og 1B) i åtte prøver, og bare en prøve (case 03) hadde den L858R punkt mutasjon i ekson 21 av
EGFR plakater (tabell 1). Videre tre prøver (case 19, 24 og 30) hadde mutasjoner i ekson 2 av
KRAS
gen (tabell 1).
Sekvense analyse av
EGFR
ekson 19 ble utført av dideoksysekvensering (electropherograms i venstre panel), pyrosekvensering (pyrogams i midten paneler) og massivt parallell sekvensering (programmer i panelet til høyre). (A) Wild-type
EGFR
ekson 19 oppdaget av alle tre sekvense teknikker; (B) L747_A750del, P753S mutasjon påvises ved alle tre sekvense teknikker; (C) E746_A750del (Del-1A) mutasjon identifisert av pyrosekvensering og massivt parallell sekvensering; (D) E746_A750del (Del-1B) bare oppdages av massivt parallell sekvensering. del, sletting; Mut, mutasjon; WT, vill-type. Pilene viser plasseringen av forventede mutasjons konkrete signaler.
Vi neste testet om konvensjonell pyrosekvensering [22] var i stand til å bekrefte mutasjoner funnet av dideoksysekvensering og hvis flere mutasjoner ble funnet ved denne metoden i pasient kohorten testet. Pyrosekvensering tilbyr kostnadseffektiv kvantitativ påvisning av sekvensvarianter og ble tidligere vist å aktivere sensitive
KRAS
mutasjonsdeteksjon i tykk- og endetarmskreft [12], [25], [26]. Den forbedrede følsomhet for påvisning av sjeldne varianter er på grunn av dannelsen av ikke-interfererende, individuelle signaler for muterte og villtype-alleler. Vi etablerte sensitive (5-10% mutant allel), reproduserbare og lineære pyrosekvensering analyser for de mest fremtredende mutasjon hotspots i
EGFR Hotell og
KRAS plakater (Supplementary fig. S2, S3, S4, S5 , S6, S7, S8, S9, S10). Pyrosekvensering bekreftet alle mutasjoner oppdaget av dideoksysekvensering (tabell 1). Men vi har også oppdaget ytterligere fire mutasjoner i vårt utvalg kohort som hadde vært savnet etter dideoksysekvensering (tabell 1, Fig. 1C og analytiker Fig. S3A, S6B, S9A). For eksempel har vi oppdaget at det erlotinib motstand mutasjon, T790M, i tumorprøve 10 (80% tumorcelleinnhold) erholdt ved tidspunktet for tilbakefall (Supplementary fig. S6B), og denne prøve også skjult de L747_S752del_P753S delesjons opprinnelig påvist ved dideoksy-sekvensering (Tabell 1 og S4C) fig.. Vi videre funnet en tidligere uoppdaget G12A substitusjon i exon 2 av
KRAS
i prøve 11 (50% tumorcelle innhold, tilleggs Fig. S9A) og bekreftet denne mutasjonen ved subkloning av
KRAS
exon 2 amplikonene og påfølgende dideoksysekvensering (data ikke vist).
EGFR
exon 19 pyrograms av prøven 27 (40% tumorceller) og av prøven 05 (50% tumorceller) oppviste fluorescens-signaler som angir for nærvær av mutasjoner som var betydelig høyere enn nivået ved eksperimentelle støy (fig. 1C og analytiker fig. S3A). Fragment lengde analyser av
EGFR
ekson 19 PCR produktene validert denne slettingen i prøve 27 (Supplementary Fig. S11).
Til slutt, vi ansatt massivt parallell oppstilling basert pyrosekvensering-by-syntese [ ,,,0],20] for å bekrefte mutasjon resultatene som oppnås ved konvensjonell dideoxy og pyrosekvensering. Vi sekvensert alle av de 24 prøvene til et gjennomsnitt dekning av 1079 x og et minimum dekning på 600 x pr ekson og prøven. Dataanalyse bekreftet tilstedeværelsen av
EGFR Hotell og
KRAS
mutasjoner i 13 prøver først identifisert av begge, dideoksysekvensering og pyrosekvensering (tabell 1). Videre massivt parallell sekvense også validert ytterligere fire mutasjoner som nylig ble oppdaget av sensitive pyrosekvensering:
EGFR
ekson 19 strykninger i prøve 05 og 27, den G12A mutasjon av
KRAS
i prøve 11 og den T790M mutasjon av
EGFR
i prøve 10 (tabell 1). Parallell natur denne sekvense tilnærmingen aktivert presis kvantifisering og identifisering av disse lavfrekvente varianter. Nærmere bestemt har vi identifisert exon 19 mutasjon i prøven 05 for å være en 9-bp delesjon i leseramme som koder for aminosyresekvensen delesjon-substitusjon E746_R748del_A750, med en frekvens på 11% av 1315 leser (tabell 1). Videre kvantifisert vi en 12-bp delesjon (E746_A750) for å forekomme ved en frekvens på 11% av 854 står i prøven 27 (fig. 1C). Den G12A substitusjon i prøven 11 var til stede i 21% av 1358 leser og den T790M motstand mutasjon i prøven 10 forekom med en hyppighet på 20% ut fra 909 leser (tabell 1).
I tillegg til å validere den tidligere påviste mutasjoner parallell sekvense identifisert
EGFR
ekson 19 slettinger i prøven 31 og 13a, som var umulig å skille fra eksperimentell støy i både konvensjonelle dideoxy og pyrosekvensering analyser. Parallell-sekvensering muliggjorde påvisning av en E746_A750del i prøve 31 ved en frekvens på 6% av 1081 leser (tabell 1 og fig. 1 D). Bemerkelsesverdig, denne prøven hadde blitt anslått til å inneholde 60% tumorceller ved histopatologi (tabell 1). Tilsvarende flowgrams av prøven 13a (5% tumorceller) viste en 12-bp delesjon (L747_A750del_T751P) ved en frekvens på ca 8% av 658 leser (tabell 1). Denne mutasjonen var identisk med den som allerede er detektert av dideoksy-sekvensering i en annen prøve av samme pasient (prøver 13b) med høyere tumor-innhold (70%), oppnådd ved tidspunktet for tilbakefall (tabell 1). Således utover validere alle de andre mutasjoner som hadde blitt kalt ved dideoksy-sekvensering (n = 12) og pyrosekvensering (n = 16), identifisert massivt parallell sekvense to ytterligere mutert prøvene som hadde vært savnet av de to andre metodene som følge av utilstrekkelig følsomhet . (Tabell 1 og supplerende tabell S5)
Vi neste analysert høy kvalitet 454 sekvense leser (Phred poengsum 30) med mål om å oppdage T790M mutasjoner som oppstår ved lav frekvens i prøver innhentes før behandling. Exon 20 ble dekket til en gjennomsnittlig dybde av 1018 leser i området ved kodon 790. Hos pasienter med tumorer hadde en delesjon i exon 19 eller L858R vi har observert en signifikant høyere (p = 0,03) antall leser som inneholder T790M mutasjon sammenlignet pasienter med villtype
EGFR plakater (EGFR Mut: gjennomsnitt = 2,5 /1000; range 0 til 7,5 /1000; EGFR vekt. bety 0,8 /1000 (0-2.3 /1000) Vi oppmerksom på at disse allelfrekvensene er i omfanget av den teknologiske grensen av nøyaktighet. men antall leser med T790M var over terskelen for mutasjon ringer i 27% av prøvene med sletting i ekson 19 eller L858R men på ingen prøve uten
EGFR
mutasjon (Supplementary fig. S12).
til sammen massivt parallell sekvense identifisert totalt 18 mutasjoner i
EGFR Hotell og
KRAS
resulterer i en sensitivitet på 67% for dideoxy sekvensering og 89% for pyrosekvensering (Tabell 1 og supplerende tabell S5). til tross for den begrensede størrelsen på vårt prøvesett, disse resultatene understreker den dramatiske mangelen på følsomheten dideoksysekvensering i klinisk påvisning mutasjon.
følsomhet for mutasjonsdeteksjon som en funksjon av tumorcelleinnholdet
tumor-celle-innholdet er en kritisk parameter for utførelsen av mutasjonen påvisning i cancer [20] og er grunnlaget for mikrodisseksjon baserte tumor-celle anrikning. Vi søkte derfor å analysere resultatene av de tre mutasjon analysemetoder som en funksjon av histopathologically anslått tumorcelleinnhold. Den midlere svulst-innhold av prøver identifisert som mutant av dideoksy-sekvensering var 78% (område 35-95%) og 71% (område 35-95%) i tilfellet av pyrosekvensering (fig. 2A). Alle prøver, der dideoksysekvensering hadde savnet mutasjoner, inneholdt 80% tumorceller eller mindre. I motsetning til de prøvene hvor pyrosekvensering hadde tapt mutasjoner hadde 60% tumor-innhold eller mindre (fig. 2A).
(A) Korrelasjon mellom den beregnede tumorcelleinnhold og den faktiske frekvensen av muterte alleler bestemmes av massivt parallell sekvensering av data. Svart, mutasjoner oppdaget av dideoxy og pyrosekvensering; Grønn, mutasjoner påvises ved pyrosekvensering, men savnet av dideoksysekvensering; Rød, mutasjoner bare oppdages ved parallell sekvensering. (B) Sensitivitet av dideoksysekvensering, pyrosekvensering og massivt parallell sekvensering hos pasienter med bekreftet klinisk respons på behandling med erlotinib.
Vi neste vurdert sammenhengen mellom tumorcelleinnholdet og hyppigheten av muterte alleler som bestemmes av massivt parallell sekvensering (fig. 2A). Vi observerte en lav korrelasjon mellom analytisk bestemt allel frekvens og tumorcelleinnhold (
r
2
= 0,27,
p
= 0,029). Bemerkelsesverdig, deteksjonsgrenser for de ulike tilnærminger bestemt ved telling av mutant og villtype-alleler oppdages av massivt parallell sekvensering i primærsvulster var svært lik de som ble observert i de innledende allel blande eksperimenter (Utfyllende fig. S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10): 29% for dideoksy-sekvensering og 11% for pyrosekvensering (Tabell 1 og figur 2A).. Allelfrekvensene mutasjoner funnet av pyrosekvensering, men ikke dideoksysekvensering varierte mellom 11% og 21% (fig. 2A). Mutasjoner bare detekteres av massivt parallell sekvensering forekom ved allel frekvenser på mindre enn 10% (tabell 1 og 2A fig.). Påfallende, svulsten innholdet i disse tilfellene hadde blitt anslått til å være 60% og 5%, respektivt. Således histopatologiske estimater av tumor-celleinnholdet ikke er prediktive for frekvensen av mutante alleler, mens evnen til å påvise mutasjoner er begrenset av allel frekvens, men ikke av tumorcelleinnhold.
EGFR mutasjoner og klinisk resultat
Tidligere analyser av foreningen av
EGFR
mutasjoner og klinisk nytte indusert av
EGFR
hemming har tidvis gitt inkonsistente resultater i at noen studier har rapportert en mangel på en slik forening [ ,,,0],27], [28], [29] Slike uoverensstemmelser kan skyldes manglende påvise mutasjoner med tilstrekkelig følsomhet og nøyaktighet. Viktigere i vår årsklasse, bare massivt parallell sekvense var i stand til å oppdage en sensibiliserende
EGFR
mutasjon i
alle
pasienter som hadde opplevd en delvis respons (i henhold til RECIST kriterier) etter behandling med erlotinib ( fig. 2B). I motsetning til dette ble bare 7 av 11 pasienter med bekreftet PR detektert ved dideoksysekvensering og 9 av 11 ble identifisert ved pyrosekvensering (fig. 2B). Derfor, til tross den begrensede størrelsen på vår pasient kohort, disse resultatene støtter forestillingen om at de dramatiske forskjeller i følsomhet sterkt skjeve sammenheng mellom tilstedeværelsen av
EGFR
mutasjoner og respons på erlotinib. Pasienter med
EGFR
-wild-type tumorer og
KRAS
-mutant svulster som hadde fått erlotinib utstilt stabil eller progressiv sykdom (tabell 1) i samsvar med tidligere rapporter [30].
Diskusjoner
Her viser vi hvordan den begrensede følsomheten av metoder som er mye brukt til kliniske mutasjon diagnostikk kan føre til en kritisk unøyaktighet i genetisk pasientutvelgelse. Spesielt er lav følsomhet av dideoksysekvensering førte til misdiagnoses i 6 av 24 lungekreft prøver. Hvis tilstedeværelsen av en
EGFR
mutasjon hadde vært inklusjonskriteriet for behandling med
EGFR
hemmere, fire pasienter ikke ville ha fått riktig behandling. Derfor, til tross den begrensede størrelsen på vårt prøvesett, disse resultatene understreker utilstrekkelighet dideoksysekvensering for kliniske kreft genmutasjon diagnostikk. I motsetning konvensjonell pyrosekvensering tilbudt økt følsomhet med bare to pasienter som feildiagnostisert. Videre massivt parallell sekvense robust og nøyaktig identifisert alle mutasjoner stede i datasettet. Vi viser videre at parallell sekvensering kan oppdage hatt kontakt T790M mutasjoner i en 27% andel av
EGFR
-mutant pasienter [31]. Disse resultatene støtter konklusjonen om at massivt parallell sekvensering er den mest sensitive teknologi for tiden tilgjengelig i kliniske mutasjon diagnostikk og foreslår at pyrosekvensering kan være et alternativ til dideoksysekvensering.
Mens mange teknikker har dukket opp de siste årene for å matche den stadig økende behov for å gi nøyaktig klinisk mutasjon analyser til onkologer, har ingen av disse blitt systematisk vurdert opp mot massivt parallell sekvensering, metoden med høyest følsomhet for klinisk mutasjonsdeteksjon til dags dato. Ekstrapolering forskjeller slik som de som ble observert i denne studien til det store antall kreftpasienter verden over indikerer at mange pasienter blir diagnostisert for seint hvert år. Dermed nøye utviklet diagnostiske metoder (inkludert grundig validering mot massivt parallell sekvensering) vil bidra til å målrette effektiv behandling til riktig pasient befolkningen.
mikrodisseksjon har blitt brukt mye for å øke brøkdel av kreftceller i et gitt mønster i orden for å forbedre sensitiviteten av dideoksy-sekvensering. Identifisering av tumorrike områder er en forutsetning for en slik prosedyre. Vi fant imidlertid bare en lav korrelasjon av tumor-celleinnholdet og hyppighet av mutante alleler. Vi antar at en rutinemessig undersøkelse av histopatologiske seksjoner ikke nøyaktig kan beregne graden av «forurensning» av mutant allel av friske bystander celler (f.eks normalt lungevev), som skjuler frekvensen av det mutante allelet. Dermed kan mikrodisseksjon bare delvis redde den begrensede følsomheten dideoksysekvensering og bør derfor også godkjennes nøye mot massivt parallell sekvensering.
En annen hyppig diskutert tema er spørsmålet om genotyping eller sekvensering kan være den optimale strategi for klinisk mutasjonsdeteksjon i kreft. Selv om resultatene tyder på at pyrosekvensering er en følsom, nøyaktig og kostnadseffektiv metode for å analysere de aller fleste prøver med en tumor-innhold på 20-70%, kan andre fremgangsmåter, herunder de som er basert på genotyping, fungerer like bra. Ved allerede kjente hot-spot-mutasjoner låst nukleinsyre (LNA) tilnærminger er i stand til å detektere mutante alleler som forekommer ved frekvenser så lavt som 0,1% [14], [16]. Andre teknikker som kan ha verdi i klinisk anvendelse inkluderer immunhistokjemi hjelp
EGFR
mutasjonsspesifikke antistoffer [32] eller anvendelsen av molekylære beacons kombinert med fluorescerende bildebehandling [33]. Det er imidlertid viktig å huske på at den iboende manglende evne til genotyping metoder for å dekke alle klinisk relevante mutasjoner, legger til noen analytisk ufølsomhet. Basert på disse vurderingene, favoriserer vi sekvensebaserte mutasjonsdeteksjon i løpet genotyping. Selv om vår utvalgsstørrelsen er for begrenset til omfattende beregne sensitivitet og spesifisitet av mutasjonsdeteksjon, tror vi at den slående underlegenhet av konvensjonell Sanger-sekvensering for å oppdage terapeutisk relevante onkogene mutasjoner er av stor interesse for molekylær patologer og kliniske onkologer.
Oppsummert har vi vist hvordan sekvense teknologier med dårligere følsomhet kan mislykkes i å oppdage klinisk relevante onkogene mutasjoner hos kreftpasienter. Vi konkluderer derfor med at noen ny metode for kliniske mutasjon diagnostikk bør være grundig validert mot massivt parallell sekvensering for å gi et korrekt genetisk analyse som grunnlag for molekylært målrettet terapi.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Følsomhet studie av dideoksysekvensering og pyrosekvensering. Forskjellige blandinger av PCR-produktene fra villtype eller mutant G12S NSCLC-cellelinjer ble anvendt for å bestemme sensitiviteten grensen for dideoksy-sekvensering (~20-30%) og pyrosekvensering (~ 5%). Mutasjons konkrete signaler er merket med stjerner i dideoksy electropherograms (venstre panel) og røde piler i programmer (høyre panel). Mut, mutasjon; . WT, vill-type
doi: 10,1371 /journal.pone.0019601.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Følsomhet og linearitet testing av
EGFR
ekson 19 pyrosekvensering analyse. Blandinger av E746_A750del (Del-1 a) mutant og vill-type PCR-produktene av NSCLC-cellelinjer ble brukt for å analysere mutasjoner deteksjonsgrensen og assay linearitet. Analysen er følsom for et minimum på 5 til 10% av muterte alleler. Mutasjons konkrete signaler er merket med røde piler. del, sletting; Mut, mutasjon; . WT, vill-type
doi: 10,1371 /journal.pone.0019601.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
pyrosekvensering analyse av
EGFR
ekson 19 i NSCLC tumorprøver. (A)
EGFR
ekson 19 sletting identifisert i prøven med 50% tumorcelle innhold som tidligere ikke var identifisert av dideoksysekvensering; (B) Ingen signifikant mutasjon deteksjon i prøven 13a med en 5% tumorcelleinnhold. Forventet stilling mutasjons konkrete signaler er merket med rød pil. del, sletting; Mut, mutasjon; . WT, vill-type
doi: 10,1371 /journal.pone.0019601.s003 plakater (TIF)
Figur S4.
Pyrograms av
EGFR
ekson 19 mutante NSCLC cellelinje og tumorprøver. (A) Del-B-mutasjon i cellelinje HCC827; (B-D) tumorprøver med et høyt tumor celleinnhold muliggjør presis karakterisering av de enkelte mutasjon;
