Abstract
Vi testet hypotesen om at (i) synonymt variasjoner innenfor de kodende regioner, og (ii) variasjoner innenfor de ikke-kodende regioner av HPV, påvirke livmorhalskreft (CaCx) patogenesen under påvirkning av intakte HPV16 genomer. Hele genomet sekvensanalyse av HPV16 isolerer innen 70 CaCx tilfeller og 25 ikke-maligne prøvene viste at synonyme variasjonene var betydelig høyere i de E6 (p = 0,014), E5 (p = 0,001) og L2 (p = 0,0002) gener av HPV16 isolater i tilfeller sammenlignet med isolater innenfor ikke-maligne prøver. Alle av 25 (100%) humaniserte kodonene identifisert innenfor L2 ORF av de analyserte prøvene, ble næret ved CaCx tilfeller, mens 8 av 25 (32%) ble næret av HPV16-positive ikke-maligne prøver (p = 3.87105E-07 ). L2 (mRNA og protein) uttrykk var tydelig bare blant tilfeller med episomale virale genomer og L2 mRNA uttrykk korrelerte signifikant med E2-genet kopiantall tyder uttrykk fra alle episomale genomer. Blant slike tilfeller isolater asiatiske Amerikansk (AA) fremstilt alle de humaniserte kodoner (100%; 4-6 /prøve) registrert i L2, som var signifikant høyere (p = 2.02E-7) sammenlignet med den europeiske (E) isolerer (22,8%, ingen eller 1-2 /prøve). I tillegg mesteparten av E-variant-isolater i tilfellene (54/57; 94,7%) fremstilt en variant (T4228C) innenfor den korte ikke-kodende region (NCR2) mellom E5 og L2-genene, som skildrer en svak promoter-aktivitet spesifikk for L2-mRNA-ekspresjon . Dette resulterte i tap av 9 av 14 miRNA bindingsseter (HSA-MIR-548 familie), til tross for betydelig overekspresjon av miR548a-5p og miR548d-5p blant slike tilfeller (28.64 og 36.25 folder, henholdsvis), i forhold til HPV negativ kontrollprøver. Funnene eksemplifiserer den biologiske betydningen av sekvensvariasjoner i HPV16 genomer og markere at episomal HPV16 i CaCx tilfeller ansette flere mekanismer for å opprettholde L2 uttrykk, og dermed rettferdiggjøre potensielle rolle L2 i slike kreftformer, i motsetning til de som skjuler viral integrering.
Citation: Mandal P, Bhattacharjee B, Das Ghosh D, Mondal NR, Roy Chowdhury R, Roy S, et al. (2013) ulike uttrykk av HPV16 L2 Gene i livmorhalskreft huse episomale HPV16 genomer: Influence of synonymt ikke-kodende område variasjoner. PLoS ONE 8 (6): e65647. doi: 10,1371 /journal.pone.0065647
Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal
mottatt: 02.04.2013; Godkjent: 26 april 2013; Publisert: 06.06.2013
Copyright: © 2013 Mandal mfl. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Institutt for bioteknologi (Grant No. BT /PR8014 /med /14/1220/2006), Government of India, og delvis av indiske Statistical Institute (egenutført), og National Institute of Biomedical Genomics (Kjerne Grant). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
foreningen av genital humant papillomavirus (HPV) med livmorhalskreft (CaCx) er sterk og uavhengig av andre risikofaktorer, som fremgår av konsistente funnene registrert fra epidemiologiske studier gjennomført i en rekke land [1]. Omtrent 50% av CaCx tilfellene er forårsaket av HPV16 [2], [3]. I India også, er HPV16 infeksjon den mest dominerende typen forbundet med CaCx [4] – [6] og er også den mest utbredte typen identifisert i de generelle populasjoner basert på tilgjengelige data fra enkelte regioner i India [5] – [9].
i løpet av fase av forbigående infeksjon, episomal form av HPV replikerer sammen med de unike epitelceller fra basalmembran til den overfladiske sonen, og viruspartikler i verdien felle av sammen med sloughed-off epitelceller [10] . Imidlertid synes høy klasse cervical neoplasi å være preget av liberaliserte viral genekspresjon og mislykket livssyklus viruset [11]. Derfor er det transformerende potensiale av HPV er sannsynlig å være korrelert med potensialet av deregulere ekspresjonen av viktige virusproteiner [12] – [14], så vel som, sammen med evnen til å unngå immunangrep av verten for å vedvare innenfor verts cervikal epitel [15].
Integrasjon av virale genomer inn i vertsgenomet, først og fremst ved skjøre områder [16], [17], påvirker ulike cellulære veier av vertscellesyklus-maskineri. Dette fører til forstyrrelse av det virale E2-genet, som oftest i regionen som koder for hengsel-regionen til HPV16-E2-proteinet. I fravær av E2-drevet undertrykkelse, blir E6 og E7 uttrykt, dermed kjører infiserte celler mot transformasjon. Tvert imot, har vår studie [18] samt et par andre [19], identifisert som en betydelig andel av personer med CaCx havn intakt E2-genet [20]. Dette kan være enten rent intakt (episomal) eller samtidig, dvs. en blanding av intakte (episomal) og oppbrutte (integrert) former. Slike observasjoner, peker mot biologisk plausibilitet av livmorhalskreftutvikling under påvirkning av HPV16 intakt E2-genet eller intakte virale genomer, i motsetning til E2 avbrudd eller integrering.
I videre utforskning av nye paradigmer av HPV16 relatert CaCx patogenesen henhold virkningen av episomale virale genomer med intakte E2 gener, foretok vi genom bred-sekvensering av slike virale genomer innenfor CaCx tilfeller og ikke-maligne prøver, innledningsvis med unntak av den E1-genet [21], og deretter å innlemme E1 i denne studien. Således genererte vi sekvensdata på hele HPV16-genomet. Den europeiske varianten (E, 86,32%) var det mest utbredt i befolkningen både blant kontrollene samt tilfeller etterfulgt av asiatisk-amerikanske variantene (AA, 13,68%), som vi registrerte bare blant sakene.
Nonsynonymous enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) anses funksjonelle fordi de resulterer i forandringer i aminosyre-nivå som kan funksjonelt å påvirke de proteiner. Vår tidligere analyse [21] ble fokusert på slike variasjoner innenfor det mest vanlige E variant haplotype E-12, basert på SIFT databasen. Denne studien viste at sjeldne skadelige variasjoner innenfor gener involvert i produktiv infeksjon (L1, L2, E2 og E5), over E-12 haplotype bakgrunn av intakt HPV16 isolater, kan være årsaks relevans for CaCx utvikling. Synonymt variasjoner på den annen side, kan også påvirke viral genekspresjon ved å modulere kodon bruksmønster [22].
Tidligere studier fra vår gruppe har også gitt et innblikk i den biologiske betydningen av de ikke-kodende regioner i HPV16, slik som involvering av nukleotidvariasjon i E2BSIV i LCR [18], metylering av CPGs innenfor E2BSI /II i LCR [23] og gjentatte ekspansjoner i NCR-2 [21] i patogenesen av livmorhalskreft huse intakt HPV16 genomer. Vårt mål her var å re-undersøke enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i hele genomet til HPV16, som omfatter E1 genet, blant episomal HPV16 isolerer innen non-maligne prøver og CaCx tilfeller. Spesielt vi lagt vekt på å bestemme sammenslutning av synonymt variasjoner innenfor intakte HPV16 genomer om noen, med CaCx patogenesen og identifisering av gener som næret slike variasjoner, i lys av deres biologiske relevans. Vi utforsket muligheten for at nukleotid variasjoner innenfor ikke-kodende regioner, spesielt de utranslaterte regioner av HPV16 genomer videre er biologisk relevant også, bortsett fra de som er innenfor kodende områder.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Alle prøver, ondartede og ikke-ondartet, ble samlet inn fra de fagene med skriftlig informert samtykke godkjent av institusjonelle etiske komité for menneskelig eksperimentering av det indiske Statistisk Institute, Kolkata, India.
prøver og fag
detaljer om fag, vareprøver, DNA, HPV screening og bestemmelse av HPV16, er E2 kopiantall og avbrudd status er beskrevet i detalj i våre tidligere studier [8], [18], [20] , [21], [23], [24]. Vi analyserte DNA-prøver som består av et panel av HPV16-positive ondartede tilfeller (n = 94) og HPV16-positive cytologisk normale kontroller (n = 29), som vi har betegnet her som HPV16-positive ikke-maligne prøver. Av disse har 70 ondartede prøver og 25 ikke-maligne prøvene er tatt fra vår tidligere rapport om HPV16 sekvens data uten data på E1-genet [21]. De maligne Prøvene ble preget av median alder av 50 år (= 27-60 år) og de ikke-maligne prøver med median alder 34 år (= 27-80 år).
Alle de ondartede prøvene (histopathologically bekreftet invasive plateepitelkarsinom og klinisk diagnostisert som tumor stadium III og ovenfor som per FIGO klassifisering og flertallet ble diagnostisert som moderat differensiert plateepitelkarsinom patologisk) ble avledet fra gifte fag. De ikke-maligne prøvene var normale cervical skraper bekreftet av Pap smøre test og stammer fra gifte og ikke-gravide (eller 6 måneder post partum) kvinner uten tidligere historie med celleforandringer /malignitet. Noen av prøvene fra denne gruppen ble histopathologically bekreftet normale cervical biopsi avledet fra kvinner som gjennomgår hysterektomi for andre enn kreftformer som livmor prolaps, fibroid, cyste etc. og uten forhistorie med celleforandringer /malignitet ulike grunner.
Re-sekvensering av HPV16 genom
re-sekvensering av HPV16 genomer var begrenset til disse prøvene (ikke-ondartet og tilfeller) husing intakte virale genomer basert på (i) intakt E2-genet som er bestemt DNA nivå ved PCR av hele E2-genet [18] og (ii) Taqman-analyse for estimering av E2 og E6 gen kopiantall (episomal, når E2 /E6 ratio≥1 og blandet eller samtidig, når 0 E2 /E6-forhold mindre enn 1 ) [20].
femten sett av overlappende primere ble brukt for re-sekvensering av HPV16-genomet. Av disse ble primersekvensene og PCR-forhold for elleve sett tidligere beskrevet fra vårt laboratorium [21]. I tillegg til disse ble fire sett med overlappende primere anvendt som spenner over hele regionen av E1-genet. Detaljene i primer-sekvenser og PCR-betingelser for E1-genet er beskrevet i tabell S1. Re-sekvensering av HPV16 intakte genomer ble utført som beskrevet tidligere [21] i en ABI Prism ™ 3100 automatisert sekvense ved hjelp av fargestoffterminator kjemi. DNA-sekvensene ble analysert ved hjelp av PolyPhred pakken (https://droog.mbt.washington.edu/PolyPhred.html) og HPV16R sekvens ble benyttet som referanse i de justeringer [25]. Identifisering av sjeldne varianter og eliminering av sjansene for sekvense feil ble gjort i henhold til tidligere rapport fra vår gruppe [21].
Identifikasjon av biologisk relevante synonymt variasjoner innen koding regioner av HPV16 genom
synonyme variasjoner innenfor ORF for HPV16 ble bestemt fra sekvensdataanalyse. Hyppigheten av bruken av kodoner og aminosyrer på grunn av synonyme variasjoner ble identifisert basert på programmet «Graphical kodonbruk Analyzer (gCua) finnes på https://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html og endelig humanisert kodoner innenfor HPV16 ORF ble identifisert.
Identifikasjon av biologisk relevante variasjoner i ikke-kodende regioner av HPV16-genomet (kort ikke-kodende region NCR2 mellom E5 og L2)
nukleotidvariasjoner i de store ikke-kodende område av HPV16, dvs. LCR ble analysert og rapportert tidligere [18]. I den foreliggende kommunikasjon, vår fokusert på den korte ikke-kodende region, NCR2, mellom E5 og L2 regioner av HPV16 i lys av en mulig involvering av denne regionen i reguleringen av ekspresjonen L2 [26]. Det har nylig blitt identifisert som verts mirnas er i stand til å støte mot virale livssyklus, Virustropisme og patogenesen av virussykdommer [27]. Derfor bruker RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/) programvare, identifiserte vi miRNA bindingsseter innenfor den NCR2 av HPV16-isolater og tap av slike bindingsseter, eventuelt under påvirkning av enkelt nukleotidvariasjoner. Vi ytterligere bekreftet tap av slik binding, syssels miRBase [28].
RNA isolering og cDNA forberedelse
Totalt RNA, fra livmor vevsprøver ble isolert, renset og behandlet med DNase hjelp Qiagen RNeasy sensoren ved å følge produsentens protokoll. Ett mikrogram av total RNA fra hver prøve ble reverstranskribert ved bruk av primeren (dT) 17-P3, dvs. en oligo (dT) 17-primeren er koplet til en linkersekvens (5’GACTCGAGTCGACATCGA TTTTTTTTTTTTTTTTT 3 «) [29] i en 20 ul reaksjonsblanding. I korte trekk, ble hver RNA-prøve blandet med 400 ng av oligo- (dT) -P3-primer og inkubert ved 70 ° C i 10 minutter. Blandingen (10 pl) ble raskt avkjølt på is, og deretter blandet med like stort volum av en blanding av 2X revers transkriptase-buffer, 8 mM dNTP (med DTT), 20 U RNase inhibitor og 50 U MultiScribe ™ revers transkriptase (Høy kapasitet cDNA revers transkripsjon kit, Applied Biosystems) og revers transkribert ved 42 ° C i 60 minutter etterfulgt av inaktivering ved 70 ° C i 10 minutter. Revers transkripsjon reaksjon, med mRNA og alle reagenser men ingen revers transkriptase, ble utført for prøvene som negative kontroller.
Kvantitativ PCR basert analyse av L2 mRNA uttrykk
L2 mRNA-ekspresjon ble bestemt av kvantitativ PCR (QRT-PCR) på ABI 7900 HT PCR-plattformen, etter relativ kvantifisering med ACTB uttrykk. For denne analysen ble 100 ng cDNA som brukes i en 10 pl reaksjonsblanding med
Strøm
SYBR® grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) og 25 ng av både fremover (L2 (3) F: 5 «TAT GGA AGT ATG GGT GTATTT T 3 «) og revers primere (L2 (1) R: 5» ATC TGG GGG AAT GGA AGG T 3 «). ACTB ekspresjon ble også kvantifisert ved sanntids-PCR i et reaksjonsvolum på 10 ul, inkludert 100 ng av cDNA og 25 ng av fremover (ACTB RTF: 5 «ATCCGCCGCCCGTCCACAC 3») og revers primere (ACTB RTR: 5 «TGCCGTGCTCGATGGGGTACT 3»). ACTB uttrykk tjente som intern kontroll for å sikre integriteten av den totale RNA prøven. Dissosiasjonskurve analyse ble utført, for å utelukke forekomst av ikke-spesifikk amplifikasjon og primer-dimer-dannelse. PCR-kontrollene var NTC (non-mal kontroll) samt separate porsjoner fra revers transkripsjon reaksjoner med (i) alle reagenser unntatt mRNA, (ii) mRNA og alle reagenser men ingen revers transkriptase, og (iii) HPV-negative celle mRNA
immunoblotanalyse av L2 uttrykk
Vevsprøver (10 mg ca.) ble homogenisert i 100 mL iskald protein lysis buffer (30 mM Tris HCl,. pH = 7,5, 1 mM MgCl
2, 1 mM EGTA, 0,67% β-merkaptoetanol, 0,5% cHAPS, 10% glycerol og 0,5% Triton X100) inneholdende protease inhibitor cocktail (Roche). Etter inkubering over natten ved 4 ° C med risting, og påfølgende sentrifugering ved 12.000 rpm ved 4 ° C i 20 minutter, supernatanten ble oppsamlet og beregnet ved Bradford-analyse (Biorad Hercules, CA) ifølge produsentens protokoll. Tretti mikrogram av alle proteinprøver ble kjørt på 12,5% SDS-PAGE i duplikat, og deretter overført til PVDF-membraner. Etter blokkering ikke-spesifikk, ble membranen behandlet med 3:5000 fortynning av muse L2 primært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, sc-65709; dannet mot aminosyrene 40-150 av HPV16 L2) over natten ved 4 ° C. Etter vasking, ble membranen igjen behandlet med anti-muse-sekundært antistoff (1:5000 fortynning, geite-anti-muse-IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) ved 37 ° C i 2 timer og 30 minutter. L2-protein-ekspresjon ble påvist ved chemiluminiscence baserte analysen, etter vasking av membranen. Expression of ACTB protein ble bestemt som internkontroll. Mus monoklonalt ACTB primære antistoff (2:5000 fortynning, Abcam, ab6276) og anti-muse-sekundært antistoff (1:5000 fortynning, geite-anti-muse-IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, sc-2005) ble anvendt for ACTB protein ekspresjon analyser . Densitometrisk analyse av hvert band av L2 og ACTB ble utført ved hjelp av IMAGE J programvare (https://rsb.info.nih.gov/ij/docs/index.html). L2 protein uttrykk var representert i form av relativ tetthet av hvert band av L2 normalisert med tilsvarende ACTB proteinbåndet (område L2 protein band /område ACTB protein band).
Relativ kvantifisering av modne miRNAs av TaqMan miRNA real-time PCR
TAQMAN Mirna Analyser for Mir-548a-5p og MIR-548d-5p ble foretatt, syssels cDNA fremstilt fra total RNA prøver, ved hjelp av spesifikke miRNA primere fra TAQMAN Mirna analyser og reagenser fra TaqMan® Mirna Reverse Transcription Kit (ABI; Cat # 4366596). De 15 ul revers transkripsjon reaksjoner bestod av 10 ng total-RNA, 5 U MultiScribe revers transkriptase, 0,5 mM av hver dNTP, 1 x revers transkripsjonsbuffer, 4 U RNase-inhibitor, og nuklease-fri vann. Dette ble utført ved 16 ° C i 30 minutter og ved 42 ° C i 30 minutter og avsluttet ved 85 ° C i 5 minutter. For real-time PCR av TaqMan miRNA Analyser, brukte vi 0,5 mL 20 × TaqMan Mirna analysen Primer, 1,33 mL ufortynnet cDNA, 5 pl 2 × TaqMan Universal PCR Master Mix og 3,17 mL nukleasefritt vann. Den sanntids-PCR-programmet inngår innledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og annealing ved 60 ° C i 1 minutt. PCR-kontrollene var NTC (non-mal kontroll). Hver analyse ble utført minst to ganger, med tre replikater per prøve i hver analyse, på mikroampere optiske 96-brønners plater ved anvendelse av en 7900 HT PCR System (ABI). Relativ uttrykk for miRNAs ble beregnet ved hjelp RNU6b (TaqMan miRNA kontroll analyse) som endogen kontroll, og kalibrert til kontrollprøvene.
Statistiske analyser
Foreningen av de ulike nucleotide endringer i viral genom, med CaCx patogenesen, ble bestemt ved hjelp av chi-kvadrat test som passer. For dette har vi sammenlignet mellom sakene og ikke-maligne gruppen etter justering for størrelsen på de respektive ORF. Falske funnrate på 0,05 ble oppnådd til rette for flere tester ved bruk av Benjamini og Hochberg metode [30] sikret forskjell i andelen humanisert kodoner og SNPs i NCR2 mellom CaCx saker og ikke-maligne prøver, og mellom AA og E varianter var bestemmes også av chi-kvadrat test. L2-mRNA-ekspresjon og densitometri basert analyse av L2-protein ekspresjon data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Kolmogorov-Smirnov test ble utført for å finne ut om test variabler som uttrykk for L2 mRNA og protein, fulgt normal fordeling. To utvalgs t-test ble brukt til å identifisere sammenslutning av sykdom fenotype med variabler som fulgte normalfordeling. En p-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Lineær regresjonsanalyse ble utført for å bestemme sammenslutning av E2 kopiantall med L2 mRNA uttrykk. Boksplott var konstruert for å observere forskjellen i fordelingen av mirnas uttrykk mellom ulike kategorier av livmorhalsprøver. Kolmogorov-Smirnov test identifisert mirnas uttrykk som en variabel ikke følger normalfordeling. Derfor ble ikke-parametrisk test (Mann-Whitney U-test) utført for å studere assosiasjon av mirnas uttrykk med sykdommen fenotype. Alle statistiske analyser ble gjort ved hjelp av programvarepakker SPSS (versjon 16.0 for Windows) og R (www.r-project.org)
Resultater
Nukleotidstørrelser variasjoner innenfor E1 ORF:. Type og frekvens
de nukleotid variasjoner innenfor ORF av HPV16 genom, med unntak av E1, har blitt rapportert tidligere fra vårt laboratorium [21]. Single nucleotide variasjoner ble registrert 20 stillinger innen E1 ORF (tabell 1). Av de single nucleotide variasjoner, 19 var bi-allel endringer sperring en, som var tri-allel. Hyppigheten av variasjoner varierte mellom 0,01 og 0,45, og på grunnlag av mindre allel frekvenser (MAFs) ble klassifisert som polymorfismer (MAF≥0.05) og lavfrekvente variasjoner (MAF 0,05). Av de 20 variasjoner innenfor ORF, det var 9 (45%) ikke-synonyme variasjoner og 11 (55%) synonymt variasjoner fordelt over E1 genet.
Ikke-synonyme aminosyre endringer på tvers av alle ORF av HPV16 genom
Tidligere registrerte vi 110 ikke-synonyme variasjoner fordelt over ORF av HPV16, med unntak E1 [21]. Slike variasjoner forble uforandret, selv etter økning av prøvestørrelsen til 70 saker og 25 ikke-maligne prøver. Således hele genomet sekvensanalyse av HPV16 intakte virale genomer viste totalt 119 ikke-synonyme variasjoner. Prosentandelen av slike variasjoner innenfor E1 var ikke signifikant forskjellig mellom tilfeller (0,08%) og ikke-maligne prøver (0,11%). Flere test rettelser ble gjort, etter blant de ikke-synonyme variasjoner innenfor E1 ORF sammen med de av de andre ORF. En slik analyse re-bekreftet at andelen ikke-synonyme variasjoner i L2 ORF var betydelig høyere i tilfeller sammenlignet med HPV16 positiv non-maligne gruppen (tabell 2).
synonymt aminosyre endringer og humanisert kodoner tvers av de ulike ORF av HPV16 genom
totalt 124 synonymt variasjoner ble registrert fordelt på de kodende regioner av HPV16 genomer fra intakte isolater. Prosentandelen av synonyme variasjonene var betydelig høyere i de tilfeller sammenlignet med ikke-maligne prøver for E6 (saker = 0,104%, ikke-maligne prøvene = 0,026%, p = 0,014), E5 (saker = 0,296%, ikke-maligne prøvene = 0,064 %, p = 0,001) og L2 (tilfeller = 0,22%, ikke-maligne prøvene = 0,121%, p = 0,0002) ORF (Tabell 3). Videre analyser ble utført ved hjelp av gCua verktøyet (https://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html), for å identifisere humanisert kodon innenfor E5, E6 og L2 ORF under påvirkning av synonymt variasjoner.
Det var 25 humanisert kodon i L2 og 2 slike kodoner i både E5 og E6 (tabell S2). Det ble observert at alle de 25 (100%) humaniserte kodoner identifisert innenfor L2 ORF av prøvene som ble analysert, ble næret ved CaCx tilfeller, mens 8 av 25 (32%) ble næret av HPV16-positive ikke-maligne prøver. Således frekvensen av humaniserte kodoner i L2 ORF var signifikant høyere (p = 3.87105E-07) i CaCx tilfeller sammenlignet med HPV16-positive ikke-maligne prøver. Ingen signifikante forskjeller ble funnet i frekvensene av humanisert kodoner i E5 og E6 ORF, mellom CaCx saker og HPV16 positive ikke-maligne prøver (Tabell 4).
Vi klassifiseres videre HPV16 intakte isolater inn E og AA varianter etter en klassifisering ordning som rapportert tidligere fra vårt laboratorium [21]. Etter inkludering av ytterligere prøver i denne studien vi ikke klarte å spille AA varianter blant de ikke-maligne prøver, mens blant de E2 intakt CaCx tilfeller andelen av AA og E varianter var 18,6% (13/70) og 81,4% (57 /70), respektivt. Vi har derfor gjort et forsøk på å sammenligne AA og E varianter i form av humanisert kodoner i L2 ORF blant CaCx tilfeller bare. Vår analyse viste at alle AA-varianter (13/13 100%) næret humaniserte kodoner i L2-region, mens bare noen få E varianter (13/57, 22,8%) hadde slike kodoner og denne forskjellen var statistisk signifikant (p = 2.02E-7) . Antallet humaniserte kodoner var også tydelig forskjellig mellom de to variantene. Karakteristisk hver AA variant næret 4-6 humanisert kodoner i kontrast til hverandre E variant som næret ingen eller maksimalt 2 humanisert kodoner.
Differensial uttrykk for L2 mRNA blant CaCx tilfeller skjuler episomal (ren eller samtidig) og integrerte HPV16 genomer
i vårt tidligere studium, bekreftet at det er intakt for E2-genet ved å analysere tilstedeværelse av det virale transkriptet (E7-E1∧E4) som produserer repressoren E2, ved APOT (amplifisering av papillomavirus onkogene transkriptet) -koblet-kvantitativ-RT-PCR av E7 og E4 (nestet til E2-genet) gener [31]. Basert på slike analyser, ble prøvene klassifisert som ren episomal eller samtidig (episomal og integrert) med intakte E2 gener, og integrert med forstyrret E2 gener. Studien [31] avslørte også at disse to typer av kreft avvek i uttrykket av E7 og E2 mRNA. Vi bestemte derfor L2 mRNA uttrykk av kvantitativ real time PCR på 23 episomal /samtidige HPV16 positive CaCx tilfeller, og sammenlignet dataene med at av 11 integrerte CaCx tilfeller. Ingen L2 ekspresjon ble registrert hos de integrerte tilfeller, som i motsetning til tydelig L2-mRNA-ekspresjon i episomal /samtidige CaCx tilfeller (figur 1), som var helt lik den som er registrert i tilfelle av E2-ekspresjon i vårt tidligere studium [31]. Alle av de analyserte prøvene, fremstilt ekspresjon av ACTB mRNA-transkripter som intern kontroll. Videre analyser ikke klarte å avsløre signifikant (p = 0,224, t-test) forskjeller i L2 mRNA uttrykk mellom AA [mean (L2 C
T /ACTB C
T) ± sd = 0,834 ± 0,127] og E [bety (L2 C
T /ACTB C
T) ± sd = 0,904 ± 0,128] varianter (figur 2). Forholdet, L2 C
T /ACTB C
T, ble også funnet å være signifikant korrelert med E2 kopiantall (p = 0,004, R
2 = 0,336) innenfor episomal CaCx tilfeller (figur 3 ), begrunner uttrykk for L2 fra episomale virale genomer.
(A) Amplification plott basert på kvantitativ real time PCR av HPV16 L2 uttrykk. L2 er transkribert i E2 intakt /episomal (episomal eller samtidig), men i E2 forstyrret /integrerte tilfeller. (B) Dissosiering kurve som viser den første-deriverte smeltekurve for reaksjonen karakterisere ekspresjonen av L2 (Tm på 80,5 ° C). (C) Amplification plottet basert på kvantitativ real time PCR av ACTB uttrykk. ACTB uttrykkes av både episomal og integrert HPV16 positive saker. (D) Dissosiering kurve som viser den første-deriverte smeltekurve for reaksjonen karakterisere ekspresjonen av ACTB (Tm på 81,0 ° C).
Relativ L2 mRNA-ekspresjon er representert ved midlere L2 C
T /ACTB C
T.
Differensial uttrykk for L2 protein blant CaCx tilfeller skjuler episomal (ren eller samtidig) og integrert HPV16 genomer
Vi bestemt L2 protein uttrykk av immunoblot analyse, på en undergruppe av 12 CaCx tilfeller (integrert eller E2 forstyrret CaCx tilfeller = 4, Asian American episomale eller E2 intakt CaCx tilfeller = 3 og europeisk episomal eller E2 intakt CaCx tilfeller = 5) fra settet som ble brukt for L2 mRNA uttrykk analyse. L2 uttrykk ble registrert blant de episomal CaCx tilfeller, AA og E variant isolerer, mens slike uttrykk ikke kunne identifiseres blant de integrerte CaCx tilfellene (figur 4). Alle CaCx prøvene, uavhengig av episomal eller integrert, portrettert uttrykk for ACTB protein (endogen kontroll). Statusen for humaniserte kodoner innenfor AA og E variant isolater av prøver som avslører L2-protein ekspresjon er vist i tabell 5. L2-protein-ekspresjon ble kvantifisert ved densitometrisk analyse av Immunoblotanalyse resultater ved IMAGE J programvare (http: //rsb.info.nih. gov /ij /docs /index.html) og ingen signifikant forskjell (p = 0,562, t-test) ble spilt inn mellom AA [mean (område L2 protein band /område ACTB protein band) ± sd = 2,66 ± 1,85] og E varianter [gjennomsnitts (område L2 protein band /område ACTB proteinbånd) ± sD = 1,95 ± 0,61] som beskrevet i Figur 5.
Øvre panel avbilder L2 uttrykk. Lanes 1 og 2: HPV16 positive E2 forstyrret /integrert CaCx case prøver (D1 og D2); Kolonnene 3, 5 og 7: HPV16-positive E2 intakt /episomal (episomale eller samtidig) Europeiske varianter (EV1, EV2, EV3, henholdsvis); Lanes 4, 6 og 8: HPV16 positiv E2 intakt /episomal (episomal eller samtidig) asiatiske amerikanske variantene (AAV3, AAV2, AAV1, henholdsvis). Nedre panel viser ACTB uttrykk blant alle de analyserte prøvene. Eksempel på detaljer er vist i tabell 5.
miRNA bindingsseter på kort non kodende region (NCR2) og tap av slike bindingssteder på grunn av tilstedeværelsen av SNPs i NCR2 av CaCx tilfeller
En kort ikke-kodende region (NCR2) ofte finnes mellom E5 og L2 åpne leserammer av HPV. NCR2 er karakterisert ved en svak promoter-aktivitet som er tett regulert av keratinocytt-differensieringen og brukes kun for transkripter som koder for mindre kapsidprotein L2 av HPV16 [26]. En annen studie rapporterte 13 transkripsjoner av HPV16 i cervical epithelial cellelinje W12 (husing episomale HPV16 genomer), hvorav, ble 6 transkripsjoner funnet å omfatte NCR2 og L2 [32]. I lys av det faktum at CaCx tilfeller husing episomal HPV16 genomer også uttrykte L2-genet, har vi fokusert på en forklaring på de faktorer som kan være forbundet med L2-ekspresjon i slike CaCx tilfeller. Ved å bruke RegRNA (www.regrna.mbc.nctu.edu.tw/) programvare, identifiserte vi bindingssteder i NCR2 (nt 4139-4234) av HPV16 intakte isolater, tilsvarende 14 humane mirnas (HSA-MIR-3148, HSA -miR-3174, HSA-MIR-3613-3p, HSA-MIR-3916, HSA-MIR-495, HSA-MIR-548a-5p, HSA-MIR-548b-5p, HSA-MIR-548c-5p, HSA -miR-548d-5p, HSA-MIR-548h-5p, HSA-MIR-548i-5p, HSA-MIR-548j-5p, HSA-MIR-548w-5p, HSA-MIR-548y-5p) (figur 6 ). Slike miRNA bindingsseter ble valgt på basis av minimum fri energi (MFE≤7) og hybridisering score (≥140) (tabell S3) i henhold til standarden som normalt brukes for dannelsen av miRNA: mRNA hybrid. Våre resequenced data viste forekomsten av en SNP (T4228C) (figur S1) i NCR2 av E variant intakt isolerer bare, noe som kan føre til tap av 9 miRNA bindingssteder i de tilsvarende transkripsjoner (HSA-MIR-548a-5p, HSA -miR-548b-5p, HSA-MIR-548c-5p, HSA-MIR-548d-5p, HSA-MIR-548h-5p, HSA-MIR-548i-5p, HSA-MIR-548j-5p, HSA-MIR -548w-5p, HSA-MIR-548y-5p) (figur 6), som alle tilhørte den HSA-MIR-548 familie av miRNAs. Interessant nok andel av E2 intakt CaCx tilfeller (54/70, 77%) som bærer SNP’er i miRNA bindingssetene innenfor NCR2 var signifikant høyere (p = 0,007) sammenlignet med den ikke-maligne prøver (12/25, 48%) . Innenfor E2 intakt CaCx tilfeller ble det også observert at ingen av AA variantene (0/13, 0%) hadde en SNP i miRNA bindingssteder i NCR2. Således var ikke noe tap av miRNA bindingsseter i NCR2 observert i AA-varianter.
(A) viser NCR2 (nukleotidposisjoner 4139-4236) som befinner seg innenfor 5 «UTR fra L2-genet, med en enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) i posisjon 4228 (T til C). (B) RegRNA programvare basert identifisering av fjorten miRNA bindingssteder innenfor NCR2 med tap av bindingssteder som tilsvarer ni mirnas (
*) av HSA-MIR-548family grunn av SNP (T4228C).
Forrige studie fra vårt laboratorium [21] viste forekomst av gjentatte variasjoner innenfor NCR2.
