Abstract
En spytt prolinrikt peptid fra 1932 Da viste en doseavhengig antagonistisk effekt på cytosoliske Ca
2+ mobilisering indusert av progesteron i en tunge plateepitel karsinom cellelinje. Struktur-aktivitetsstudier viste at aktiviteten av peptidet befinner seg i den C-terminale område, karakterisert ved et prolin strekning flankert av basiske rester. Videre er mangel på aktivitet av retro Inverso peptidanalog antydet involvering av stereospesifikke gjenkjennelse. Massespektrometri-baserte hagle analyse, kombinert med Western blotting tester og biokjemiske data innhentet med progesteron reseptor Membrane Komponent 1 (PGRMC1) hemmer AG205, viste sterke bevis for at p1932 utfører sin modulerende handling gjennom et samspill med progesteron reseptor PGRMC1, som hovedsakelig uttrykt i denne cellelinje og, klart, spiller en rolle i progesteron-indusert Ca
2+ respons. Dermed våre resultater peker på p1932 som en modulator av transduksjon signalveien mediert av dette proteinet, og gitt et veletablert involvering av PGRMC1 i tumorigenesis, markere en mulig terapeutisk potensial på p1932 for behandling av kreft i munnhulen.
Citation: Palmerini CA, Mazzoni M, Radicioni G, Marzano V, Granieri L, Iavarone F et al. (2016) antagonistisk effekt av en spytt Proline-Rich Peptide på cytosoliske Ca
2+ Mobilisering indusert av progesteron i Oral Squamous kreftceller. PLoS ONE 11 (1): e0147925. doi: 10,1371 /journal.pone.0147925
Redaktør: Alessandro Datti, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, CANADA
mottatt: 27 april 2015; Godkjent: 11 januar 2016; Publisert: 27 januar 2016
Copyright: © 2016 Palmerini et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papiret. Filene vedrørende utarbeidet massespektrometri resultatene i manuskriptet er bevart i våre instrumenter innspillinger
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Nando Peretti Foundation, katolske universitetet i Roma, Cagliari University, MIUR og Regione Sardegna i henhold til sine programmer for vitenskapelig diffusjon. Arbeidet ble også støttet av FaReBio dQ 2012 CNR prosjekt. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Spytt er en blandet væske, som utskilles av de store og små spyttkjertler som befinner seg i munnhulen [1], og den utøver en rekke beskyttende og fordøyelsesfunksjoner [2]. Disse funksjonene er forbundet med spytt dynamisk komposisjon [3, 4] og av denne grunn, har betydelige anstrengelser blitt viet til definisjonen av spytt proteome [5] med mer enn 2500 forskjellige proteiner allerede er identifisert [6]. Disse kan deles inn i proteiner utskilt fra spyttkjertler, som inkluderer 400-500 komponenter som tilsvarer ca. 90% av hele spytt proteome vekt, og proteiner som stammer fra andre kilder (mer enn 2000) som utgjør mindre enn 10%.
proteiner og peptider som stammer fra spyttkjertel sekresjon inkluderer slimstoffer, a-amylaser, histatins, statherin, PB peptid, S-cystatins, lipaser, lipid transporter (lipokalin), og proline-rike proteiner (Prps), fordelt på syrlig (aPRPs), grunnleggende (bPRPs) og glykosylert enkel (gPRPs) [4]. Tilordningen av bestemte funksjoner til de ulike komponentene og familier er krevende, sannsynligvis fordi hver familie utøver flere og integrerte funksjoner, og fordi spytt proteiner er tilfeldig spredt i løsning [7-11].
bPRPs, uttrykket produktet av fire multi alleliske loci navngitte PRB1-4, er en meget heterogen familie av peptider på grunn av omfattende polymorfismer, alternativ spleising og post-translasjonelle modifikasjoner. Etter sekresjon, blir bPRPs delvis spaltes til mindre peptider som varierer fra 8 til 25 aminosyrerester med forskjellige eksogene proteaser [12]. Disse peptidene har særegne primære sekvenser som ofte overlapper hverandre som gir opphav til et bredt sett av lignende molekyler, i noen tilfeller bare avviker fra hverandre med en rest.
En av disse peptider (1932 Da, p1932) ble patentert for sin sterk antiviral aktivitet [PCT /IB2012 /050415] og ble nylig funnet å bli internalisert i orale slimhinneceller [13]. Flere eksperimenter utført for å evaluere biologiske virkninger av peptidet dokumentert dens innflytelse på kalsiumhomeostase inne celler. Modulering av cytosoliske Ca
2 + konsentrasjon ([Ca
2 +]
c) er en viktig begivenhet som forekommer i en celle siden Ca
2+ konsentrasjon medierer mange biologiske hendelser, for eksempel celleproliferasjon , differensiering, metabolisme, muskelkontraksjon, apoptose og immunrespons [14], så vel som exocytose av synaptiske vesikler i frigivelsen av nevrotransmittere [15].
kalsium homeostase i pattedyrceller er et komplekst fenomen, og resultatene fra likevekt mellom endoplasmatiske retikulum kalsium butikker og ion utveksling med den ekstracellulære medium. Progesteron, gjennom genomisk og ikke-genomiske effekter, spiller en viktig rolle i utviklingen, vekst og vedlikehold av kvinnelige reproduktive vev. I tillegg kan hormonet påvirke fysiologien av hjernen og nervesystemet, basert på dens funksjon som en neurosteroid påvirker celleoverlevelse og vekst [16, 17]. Modulering av kalsium homeostase fremmes av progesteron er generelt regulert gjennom ikke-genomiske mekanismer som involverer ulike typer av reseptorer av progesteron [18, 19]. Interessant nok, bør det bemerkes at hormonet er til stede i spytt i en fri form [20].
Her beskriver vi at p1932 har en antagonistisk effekt på cytosolisk Ca
2+ mobilisering fremkalt av progesteron i en human squamous cell carcinoma tungecellelinje (PE /CA-PJ15). Videre gir vi et sterkt bevis på at det modulerende rolle p1932 aktiveres via PGRMC1-reseptoren, som vist ved sammenlignende protein ekspresjonsstudier og biokjemiske studier utført i nærvær av AG-205, en spesifikk inhibitor av PGRMC1 anvendt alene og i kombinasjon med p1932 . Disse resultatene, markere nye prospekter i løpet av de funksjonelle konsekvensene av spytt prolin-rike peptider i kreftcellesystemer som utsettes for bestemte kjønnshormoner.
Materialer og Metoder
Kjemi
fosfatbuffer saltvann (PBS) og Trypsin-EDTA er produkter av EuroClone (Padova, Italia). Føtalt kalveserum (FCS), antibiotika (penicillin og streptomycin), L-glutamin, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM), Fura 2-am (Fura 2-acetoksy-metyl-ester), dimetylsulfoksyd (DMSO), KCl, MgCl
2, glukose, HEPES, NaCl, CaCl
2, EGTA (etylen glicol-bis (2-amino-etyl-eter) -N, N, N «, N»-tetra -eddiksyre), progesteron (P4), deoksykolsyre, Nonidet P-40 (NP-40), EDTA (2 – ({2 [bis (karboksymetyl) amino] etyl} (karboksymetyl) amino) eddiksyre), Tween- 20 og AG-205, ble kjøpt fra Sigma (Milan, Italia).
peptider syntese
P1932, RI-p1932 og fragmenter F (MER 1-8), C (MER 1- 17des Pro), E (MER 1-11), B (MER 1-17) og D (MER 12-20) ble montert på en Applied Biosystems Peptide Synthesizer 433A (Foster City, CA, USA) på et forhåndslastet prolin-2 -chlorotrityl harpiks (Novabiochem, Läufelfingen, CH) etter Fmoc- (Na-9-fluorenylmetyloksykarbonyl) protokoll for trinnvis fast-fase-peptidsyntese [21]. Fmoc-aminosyrer var fra Novabiochem
Alle koblinger ble utført med 5-gangers overskudd av aktivert aminosyre i nærvær av 10 ekvivalenter N-etyldiisopropyl amin, ved bruk av N -. [(Dimetylamino) -1-H- 1, 2, 3-triazole- [4, 5-β] pyridin-1-ylmetylen] -N-methylmethanaminium heksafluorfosfat-N-oksyd (HATU, PE Biosystems, Inc., Warrington, Storbritannia) som aktiverende middel for karboksygruppen. Ved enden av peptidkjeden montering, ble peptidet spaltet fra harpiksen ved behandling med en blanding av 80% trifluoreddiksyre, 5% vann, 5% fenol, 5% tioanisol, 2,5% ethandithiol og 2,5% triisopropylsilan i 3 timer (rommet temperatur), ved samtidig sidekjede avbeskyttelse. Etter filtrering av harpiksen, ble peptidet presipitert i kaldt tert-butylmetyleter. Etter sentrifugering og vasking med tert-butylmetyleter peptidet ble suspendert i 5% vandig eddiksyre og lyofilisert. Analytisk og semipreparativ reversert fase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) ble utført på et tri Rotar-VI HPLC-system utstyrt med en MD-910 multikanaldetektor for analyseformål eller med en Uvidec-100-VI variabel UV-detektor for preparative formål (alle fra JASCO, Tokyo, Japan). Analytisk RP-HPLC ble utført på en Jupiter 5 um C18, 300 Å kolonne (150 x 4,6 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Semipreparativ RP-HPLC ble utført en Jupiter 10 um C18 300 Å (250 x 21.2 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Lineære gradienter av acetonitril i vandig 0,1% TFA (v /v) ble benyttet for å eluere bundet peptid. ble utført MALDI-TOF massespektrometri analyse på en Autoflex arbeidsstasjon (Bruker Daltonics, Bremen, DE) som bekrefter den teoretiske massen av peptid.
Menneske PE /CA-PJ15 cellelinje
PE /CA-PJ15 celler (ECACC, 96121230, Porton Down, UK) [22] ble dyrket (37 ° C, 5% CO
2) i IMDM medium inneholdende 2 mM glutamin og penicillin /streptomycin (100 U /ml hver ), supplert med 10% inaktiv FCS. Cellene ble dyrket hver fjerde dag før til å bli fullt ut sammenflytende.
Fastsettelse av cytosoliske konsentrasjon av Ca
2 +
FURA-2 AM (2 mL av en 2 mM løsning i DMSO) ble tilsatt til 1 ml PE /cA-PJ15 suspensjoner (ca. 10 x 10
6 celler) oppnådd etter 0,05% trypsin behandling og inkubert i 60 minutter ved 37 ° C, i mørket. Cellene ble deretter høstet ved sentrifugering ved 800 gx 10 min og til slutt suspendert i HBSS-buffer pH 7,4 (140 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1 mM MgCl
2, 1 mM CaCl
2, 5 mM glukose, 25 mM Hepes, justert til pH 7,4) til en endelig cellekonsentrasjon på 1 x 10
6 /ml.
en alikvot av denne suspensjonen (1 ml) ble deretter sentrifugert ved 800g x 5 min, hvoretter cellene ble høstet og suspendert i 3 ml av kalsium-fri HBSS pH 7,4 (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl
2, 5 mM glukose, 25 mM HEPES, 0,1 mM EGTA) før fluorimetriske målinger. Fluorescens ble målt med et Perkin-Elmer LS 50 B spectrophotofluorimeter utstyrt med en dobbelt eksitasjon system (f.eks. 360 og 380 nm, Em. 510 nm). Slit bredder ble satt til 1,5 nm for eksitasjon og 3 nm for utslipp. Cytosolic kalsiumkonsentrasjoner ([Ca
2 +] c ble beregnet som rapportert [23].
proteomikk analyse av progesteron reseptorer i PJ15 celler
Protein ekstrakter ble oppnådd ved cellelyse med 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5% deoksykolsyre, 0,1% SDS, 1% NP-40, 1 mM EDTA pH 8 supplert med proteasehemmere (RIPA-buffer). Proteinene ble separert på SDS-polyakrylamidgel og, etter kolloidalt Coomassie brilliant blå flekker, ble gelbåndene av interesse skåret, avfarget med 25 mM NH
4HCO
3 /ACN 1: 1 (v /v), dehydrert med 100% ACN, redusert med 10 mM DTT i 25 mM NH
4HCO
3 og alkylert med 55 mM IAA i 25 mM NH
4HCO
3. Etter fullstendig dehydratation, en oppløsning på 0,02 ug /ul trypsin i 25 mM NH
4HCO
3 ble tilsatt, og proteiner ble spaltet ved 37 ° C over natten. reaksjonen ble stanset ved tilsetning av TFA ved sluttkonsentrasjon på 0,1%. supernatantene som inneholdt tryptiske peptider ble oppsamlet sammen med peptid-fragmenter utvunnet fra gelen med 100% ACN /0.1% TFA i vann 3: 2 (v /v). Tryptiske peptider ble analysert ved væskekromatografi-elektrospray ionisering-tandem massespektrometri (LC-ESI-MS /MS) på en Ultimate 3000 Micro HPLC-apparat (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) utstyrt med en FLM-3000-Flow ordnet modul direkte koblet til en LTQ Orbitrap XL hybrid FT massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Revers-fase kromatografi ble utført på en Jupiter C18, 5 um, 300 A, 150 x 1,0 mm kolonne (Phenomenex, Torrance, CA, USA) og en 95 min kjøring (gradient 1,6 til 44% acetonitril i vann med 0,1% maursyre over 60 min) ved en strømningshastighet på 80 uL /min. Massespektrometriske målinger ble utført på positive ion-modus med en kapillær temperatur på 250 ° C, en kappe gass-strøm på 40 vilkårlige unities, en kilde spenning på 3,6 kV og en kapillær spenning på 48 V. Massespektra ble samlet opp i FT-IT dataavhengig skannemodus (MS skanne med 60 000 av vedtak i Orbitrap og MS /MS skanne på de tre mest intense toppene i ionefelle). Protein identifikasjoner ble oppnådd med den innebygde ion regnskap algoritme (Sequest HT) av programvaren Proteome Discoverer (versjon 1.4, Thermo) og søker en menneskelig database (UniProtKB /Swiss-Prot Protein Kunnskaps, slipper 2013_09 av 18-Sep-13 inneholder 540958 sekvens oppføringer, taksonomiske restriksjoner: Homo sapiens, 20271 sekvens oppføringer). Søkeparameterne var 10 ppm toleranse for forløperionene og 0,8 Da for produktioner, en savnet cleavage, carbamydomethylation av cystein som fast modifikasjon, oksidasjon av metionin som variabel modifikasjon og falsk positiv rate under 5% beregnet på en lokkedue database-søk.
progestin reseptoren western blotting
Proteinkonsentrasjonen konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP av cellelysat ble bestemt ved Bio-Rad proteinanalyse (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Plasmamembraner ble fremstilt som beskrevet tidligere [24] med mindre modifikasjoner. Celler ble homogenisert i iskald homogeniseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA) inneholdende 1% protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich) av Dounce homogenisator (30 slag). Homogenatet ble sentrifugert i 10 minutter ved 2000 g og 4 ° C, etterfulgt av sentrifugering av supernatanten ved 100.000 g i 1 time ved 4 ° C for å pelletere plasmamembraner, som ble resuspendert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0 , 1 mM EDTA, 1% SDS, 1 mM DTT, og protease-inhibitor cocktail). Proteinet Kvantifisering ble utført ved bruk av en 2-D Quant Kit proteinanalysesett (GE Healthcare, Uppsala, Sverige). Proteiner ble lastet og separert på SDS-polyakrylamidgeler, og overført på nitrocellulosemembraner. Blottene ble blokkert i en blokkeringsløsning (PBS, 0,1% Tween-20, 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk) og inkubert over natten ved 4 ° C med de følgende mus monoklonale primære antistoffer: anti-PGRMC1 (klon C-3 , Santa Cruz, CA, USA), anti-NPR (klone 2C11F11, Santa Cruz), anti-mPRα (klone H-76, Santa Cruz) og anti-β-Actin (Clone AC-15, Sigma). Membranene ble vasket grundig og etter inkubasjon med pepperrot peroksidase (HRP) -merket geite-anti-mus eller anti-kanin-antistoff (Santa Cruz) utviklet med ECL pluss kjemiluminescens påvisningssystem (GE Healthcare, UK).
Statistisk analyserer
Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n) og signifikante nivåer mellom grupper ble bedømt ved ANOVA og post-hoc Scheffé test. P-verdier under 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Diskusjon
antagonistisk effekt av p1932 peptid på P4 effekt
Den patenterte peptid p1932 (NH
Resultater og
2
1GPPPQGGNK
10PQGPPPPGKPQ-PCT /IB2012 /050415) er et fragment som stammer fra den proteolytiske behandlingen av prolin-rike proteiner PRB1-L (Uniprot /Swiss-Prot, P0428), PRB-2 (P02812), PRB1- M (Q86YA1) og PRB2 (Q7M4Q5) [4]. Sekvensen av p1932 ble gjentatt fire ganger i PRP1-L og PRB2, og tre ganger i PRB1-M, og bringer dens gjennomsnittlige konsentrasjon i humant spytt omkring 5-10 um. Likevel, som for mange andre spytt peptider, den presise rolle p1932 i oral fysiologi og patologi er foreløpig ukjent. I en nyere artikkel har vi beskrevet muligheten av p1932 å bli internalisert i cellene i munnslimhinnen i et tidsforløp av noen få minutter, videre vi demonstrert mangelen på cytotoksisitet selv ved konsentrasjoner som er langt over de som finnes i spytt for dette peptid [13] .
i dette arbeidet viser vi for første gang den doseavhengige effekt av p1932 på moduleringen av cytosolisk kalsium frigivelse markedsført av progesteron i PE /CA-PJ15 cellelinje.
Disse celler, som kan betraktes som en modell for menneskelig munnhulekarsinomer cellen [25], ble med vilje valgt å undersøke mulige konsekvenser av p1932 i nærvær av progesteron reseptorer tidligere forbundet med prognostisk betydning over hodet-hals-kreft [26].
virkningen av P4 på PE /CA-PJ15-celler ble undersøkt ved anvendelse av hormonet under to forskjellige konsentrasjoner (5 og 10 uM) for å undersøke mulige doserelaterte effekter. Progesteron (P4) behandling av cellene ble utført i fravær av ekstracellulært kalsium som tidligere ble fjernet med 0,1 mM EGTA 0,1 mM. Etter noen sekunder når P4 behandling, en økning på [Ca
2 +]
c kunne observeres ved begge konsentrasjoner (fig 1). En slik rask økning antyder en hurtig ikke-genomiske virkning av P4 [27], som kan bli mediert ved forskjellige klasser av progesteronreseptorer, som for eksempel de klassiske atomprogesteronreseptoren (NPR) i sin monomere form (NPR-A), den Progesteron receptor membrankomponenter 1 (PGRMC1), og membranen Progesterone receptor MPR [28].
figuren illustrerer resultatet av et typisk eksperiment. Cellene ble suspendert i HBSS-buffer uten kalsium. Etter 250 sekunder kalsium ble tilsatt for å nå en konsentrasjon på 1 mM. Forsøket ble gjentatt 10 ganger, og en tilsvarende oppførsel ble alltid observert. Innfelt: Maksimal økning i [Ca
2 +] c, angitt som Δ [Ca
2 +] c etter tilsetning av økende mengder av progesteron. Resultatene vist tilsvarer gjennomsnitt ± SEM av 10 eksperimenter. ANOVA. Effekter på grunn av progesteron i fravær av kalsium: p 0,0001, og i nærvær av 1 mM kalsium: ikke signifikant (som ikke er vist i den innfelte). Post-hoc: Scheffé test på p nivå 0,05. Stjernene vist statistisk signifikans.
[Ca
2 +]
c økningen var avhengig av progesteron konsentrasjon, og i det innfelte av Figur 1 effektene av P4 på [Ca
2 +]
c rapporteres som Δ [Ca
2 +]
c (nM). Statistisk analyse bekreftet virkningen av økende doser av progesteron på [Ca
2 +]
c i calsiumfrie betingelser (p 0,0001). Når 1 mM Ca
2+ ble tilsatt i mediet, en ytterligere økning i [Ca
2 +]
c ble observert (figur 1), både i fravær og i nærvær av progesteron, overfor fra 42 ± 3 nM (gjennomsnitt av 10 bestemmelser ± SEM). Dette resultatet indikerer at [Ca
2 +]
c endringer ved P4 stimulans er i hovedsak avhengig utgivelsen av Ca
2 + fra intracellulære lagre, i overensstemmelse med tidligere funn [29]. I denne forbindelse, observert lineær sammenheng mellom [Ca
2 +]
c økning og P4 dose, er sannsynligvis en indikasjon på en direkte innvirkning, og dermed utelukker uspesifikke effekter av P4 på cellemembranene som til syvende og sist ville føre til intracellulære kalsium øker [30]. I de følgende forsøk p1932-peptidet ble anvendt ved en lavere konsentrasjon (1700 nM) i forhold til det som finnes i spytt (5-10 uM), tar i betraktning at i fysiologiske betingelser, ikke alle spytt fraksjon av p1932 peptid er i kontakt med slimhinneceller samtidig.
Spytt peptid p1932 alene (1700 nm) hadde ingen effekt på [Ca
2 +]
c i PE /CA-PJ15 celler, enten i fravær eller i nærvær av Ca
2+ i mediet. Men når det legges 2 minutter før P4 behandling i kalsium-frie forhold, p1932 helt slukket effekten av progesteron effekter (både 5 og 10 mikrometer konsentrasjoner) (figur 2, innfelt). I tillegg observerte vi en doseavhengig effekt når den p1932 spytt peptidet ble testet ved forskjellige konsentrasjoner i 17-1700 nM område (Fig 3). Spesielt er det ved progesteron-medierte hemmende effekter (5-10 um) ble effektivt lineær opp til den høyeste konsentrasjon (1700 nM) av peptidet anvendt.
Figuren illustrerer resultatet av et typisk eksperiment. Cellene ble suspendert i HBSS-buffer uten kalsium. Peptide (1700 nM) ble lagt til to minutt før progesteron (10 mm). Etter 250 s kalsium ble tilsatt for å nå en konsentrasjon på 1 mM. Innfelt: Maksimal økning i [Ca
2 +]
c, angitt som Δ [Ca
2 +]
c etter tilsetning av økende mengder av progesteron. Resultatene vist tilsvarer gjennomsnitt ± SEM av 10 eksperimenter ANOVA. Effekter på grunn av progesteron i fravær av kalsium: p 0,0001 og i nærvær av 1 mM kalsium: ikke signifikant (ikke vist i innfelt).
Post-hoc
: Scheffé test på p nivå 0,05. Stjernene vist statistisk signifikans.
Etter 120 sekunder etter tilsetning av peptidet (17-1700 nM), progesteron (10 pM [sorte firkanter], eller 5 uM [hvite firkanter]) ble også fordelt . Data (rapportert som Δ [Ca
2 +] c) rapportere middel ± SEM av 10 eksperimenter ANOVA. Effekter av progesteron: p 0,001 og av peptid konsentrasjon: p. 0,001
For å etablere minimale strukturelle krav for å uttrykke den antagonistiske effekt, syntetisert vi ulike fragmenter av p1932, og utført eksperimenter på 1700 nM for å undersøke forholdet mellom fragmentsekvenser og biologisk aktivitet. Fragmenter C (MER 1-17 des Pro), E (MER 1-11), og F (MER 1-8) viste en betydelig lavere antagonist-aktivitet sammenlignet med det intakte peptidet (figur 4). Omvendt, fragment B (MER 1-17), og fragment D (MER 12-20), resulterte så aktiv som p1932 peptid. Interessant, MER 1-17 des Pro-fragment, som mangler en prolin-rest, ikke hadde noen inhibitorisk effekt som indikerer en høy grad av spesifisitet med den antatte molekylære mål av p1932 [31]. Til slutt, i form retro Inverso (R.I.) av p1932 når testet over 17-1700 nM område av konsentrasjoner, viste ingen antagonistisk effekt (data ikke vist), noe som tyder på involvering av en stereo-spesifikk mekanisme for gjenkjennelse. Disse resultatene markere foreningen av den C-terminale delen av peptid, som inneholder 12-GPPPPGKPQ-20 prolinrikt sekvens, med full hemmende effekt på [Ca
2 +]
c økning.
Etter tilsetning av enten peptid eller dets fragmenter ved forskjellige konsentrasjoner (17-1700 nm), ble 5 uM progesteron også tilsatt til kalsium-fritt vevskulturmedium. Data (rapportert som Δ [Ca
2 +] c), rapporterer gjennomsnitt ± SEM av 10 forsøk. ANOVA: Effekter av peptid: p 0.001 og konsentrasjon: p 0,001. Post-hoc: (scheffée p = 0,05). Homogene peptid undergrupper: 1. A (p1932), B (MER 1-17) og D (MER 12-20); 2. C (MER 1-17 des Pro), E (MER 1-11) og F (MER 1-8).
Analyse av progesteron reseptorer
proteomikk analyser av PJ15-celler ble utført for å demonstrere nærværet av de tre klasser av mulige progesteron-reseptorer er beskrevet i litteraturen: NPR, PGRMC1, og mPRα. Etter celle-lysering, ble proteinene separert ved SDS-PAGE, hvoretter og proteinene med massene i 21, 40 og 100 kDa områder ble analysert ved LC-ESI-MS /MS. Under disse forholdene, identifiserte vi bare PGRMC1 (tabell 1) (21 kDa) i forsøk in duplo. PGRMC1, mPRα og NPR ekspresjon ble også vurdert ved Western blotting-analyse, noe som bekreftet at PGRMC1 er hoved progesteron-reseptoren uttrykt i PE /CA PJ15 celler. Western blot avslørte også mPRα, selv om i mindre grad i forhold til PGRMC1 (figur 5), noe som bekrefter tidligere ko-immunoutfellingsstudier vurderinger som tyder på at det sannsynligvis, PGRMC1 og mPRα er funksjonelt koblet [32]. Derimot er NPR reseptoren ble ikke identifisert, i overensstemmelse med dataene på Lukits og coll. oppnådd med den samme cellelinje (tabell 1 og figur 5) [26]
Oppført er følgende protein parametere:. alfanumerisk unike proteinsekvens identifikator (Tiltredelse), protein identifikasjonstegn med en navnekonvensjon (Entry navn) , Gene navn og protein navn (Beskrivelse) levert av UniProtKB protein kunnskaps; den beregnede molekylvekt av proteinet i kilo-Dalton-enheter (MW), teoretisk beregnet isoelektrisk punkt (pI cal.), og proteinet antall aminosyrer (# AAS); protein identifikasjon er SEQUEST HT Score; andel av protein sekvens dekket av identifiserte peptider (COV); antall peptider som er unike for proteinet (# Unikt Peptider); antall av de identifiserte peptider som samsvarer til proteinet (# Peptider); totalt antall identifiserte peptidsekvenser (peptid-spektrum sams) (# PSMS) oppnådd ved to forskjellige forsøk (forsøk 1 og Exp 2). I tabellen er oppført PGRMC1 peptider følgende parametre: den identifiserte amino syre peptid Sequence; Lad state of the forløperion; den teoretiske protonert monoisotopic peptid masse, i dalton (MH +); masse-til-ladning-forhold (m /z) av den forløper-ion, i dalton; forskjellen mellom den teoretiske massen av peptidet og den eksperimentelle masse av forløperen ion i deler per million (ΔM); retensjonstid av forløperen ion, i minutter (R.T.); den SEQUEST HT krysskorrelasjons score for alle kandidat peptider spørres fra databasen (Xcorr); antall Ubesvarte splittelser.
PGRMC1, NPR og mPRα proteiner nivåer ble avslørt med spesifikke antistoffer i PE /CA PJ15 cellulære ekstrakter hentet lysere cellene med RIPA buffer. Blot anti mPRα ble utført også på membranpreparat. Proteiner utdrag fra HepG2 og MCF7 celler ble analysert som positive kontroller (PGRMC1: 21,67 kDa, https://www.uniprot.org/uniprot/O00264, NPR: 82,29 kDa isoform A, 98,98 kDa isoformen B, http: //www. uniprot.org/uniprot/P06401; mPRα: 39,72 kDa, https://www.uniprot.org/uniprot/Q86WK9). Lik protein lasting (50 mikrogram) ble bekreftet av β-Actin uttrykk.
På grunn av den høye uttrykk for PGRMC1 i PE /CA PJ15 celler, ønsket vi å finne ut sin rolle i [Ca
2 +] c økes etter at progesteron stimulus ved hjelp av den spesifikke inhibitor AG-205 alene og i kombinasjon med p1932. AG-205 er kjent for å binde til heme-bindingssetet av dette proteinet således å modifisere sine spektroskopiske egenskaper og funksjoner [33]. Den PGRMC1 inhibitor AG 205 (0,01-1,0 pM) eller p1932 peptid (0,01-1,0 mm), ble innført i inkubasjonsmediet 50 sekunder før progesteron (5 eller 10 uM). I nærvær av AG-205 eller p1932 peptid effekten av P4 (5-10 uM) på Δ [Ca
2 +] c var statistisk hemmet på en doseavhengig måte, således etterligne virkningen av p1932 (figur 6a) . Deretter ble AG-205 (0,01-1,0 pM) og p1932 peptid (0,01-1,0 pM) tilsatt samtidig i de mellom 50 sekunder før progesteron. Kombinasjonen av de to midlene ved de samme doser, førte til en hemmende effekt høyere på progesteron aktivitet, enn det som ble observert for den enkelte AG-205 eller p1932 peptid alene, noe som indikerer en additiv virkning av de to molekyler (figur 6b).
forsøkene ble utført på PE /CA PJ15 merket med FURA-2 AM. Etter 50 sekunder i inkubasjonsmediet, P4 (5 um, figur 6A; 10 pM, figur 6B) ble tilsatt, og økningen i cytosolisk kalsium som S [Ca
2+] c målt. Den PGRMC1 inhibitor AG 205 (0,01-1,0 mm) og /eller p1932 peptid (0,01-1,0 mm), ble tilsatt i de mellom 50 sekunder før 5 eller 10 uM progesteron. I nærvær av AG205 eller p1932 peptid, er effekten av P4 (5-10 uM) på Δ [Ca
2 +] c var statistisk hemmet på en doseavhengig måte. Når AG 205 (0,01-1,0 pM) og p1932 peptid (0,01-1,0 pM) ble tilsatt i kombinasjon, var den observerte inhiberende virkning er høyere enn i prøver behandlet med enten middel alene. Hver data tilsvarer gjennomsnittet ± SEM av seks uavhengige målinger.
PGRMC1 reseptoren inneholder en N-terminale transmembrane domene (72-135 aa) og en cyt b5-eller heme /steroidbindende domene [ ,,,0],34]; lignende funksjoner er delt med sin homolog PGRMC2. Begge proteiner blir uttrykt i forskjellige humane vev, inkludert hjerte, lever og placenta [35], og er overuttrykt i mange kreftcelletyper [36-38]. PGRMC1 binder P4 med moderat affinitet og formidler P4 anti-mitotisk og anti-apoptotiske handling. Det er lokalisert til plasmamembranen, cytoplasma og nukleære membraner, noe som forklarer dens potensielle engasjement i hurtige ikke-genomiske progesteron signaler. Nylig, PGRMC1 ble funnet å være strengt korrelert til Sigma-2-reseptorer [39], til tross for eksistensen av noen kontroversielle resultater [40].
MPR (MW 40 kDa) ble først isolert i sjøørret [41] og er representert i det minste av fem undergrupper dvs. α, β, γ, δ og ε strengt knyttet til progestin og adiponectin-Q-reseptor (PAQR) familie [42]. Deres effektiv tilstedeværelse og naturen som progestin reseptorer har blitt etablert etter år med debatt [43]. Disse reseptorene har høy affinitet for P4 (Kd 5 nM) og kan formidle raske svar som blir direkte koblet til G-proteiner [32, 44]. Begge PGRMC1 og mPRα reseptorer er i stand til å raskt svare på en P4 stimulus, og følgelig bestemme en økning på [Ca
2 +]
c fra endoplasmatiske butikker [45, 46]. Tatt i betraktning hvor disse proteinene samspillet [30], er det mulig at de representerer de molekylære mål av p1932.
De strukturelle trekk ved p1932 sterkt dette peptid som en potensiell Interactor av Proline-Rich Recognition Domains (PRDs) , og spesielt av de SH3 domener [46, 47]. For å oppnå en binding mellom en prolin-rik sekvens og en SH3 domene, må en -PxxP- kjerne være tilstede i liganden sekvensen. Videre er en grunnleggende rest flankerer -PxxP- kjerne er viktig å definere samspillet spesifisitet bestemme to typer kanoniske konsensussekvenser: klasse I -PxxPxx (R /K) og klasse II – (R /K) xPxxP- [48 ]. Tilstedeværelsen av tre -PxxP- konsensus kjerner, i tillegg til tilstedeværelsen av en klasse-II-motiv i den C-terminale region av p1932 (NH
2-
1GPPPQGGNKP
10QGPPPPGKPQ), hvori befinner seg den hemmende aktivitet, sterkt støtte vår hypotese om at p1932 kan målrette SH3 domener. NPR er kjent for å samhandle med c-SRC kinase er SH3 domene gjennom sin prolin-rike regionen [49], men mangelen på denne reseptoren i PJ15 celler, som resultat av proteomikk og western-blot analyser, regler ut denne mekanismen. PGRMC1 reseptoren blir i stedet høyt uttrykt i denne cellelinje, noe som tyder det er selve reseptoren reagerer på P4-stimuli i PJ15 celler. Den transmembrane regionen PGRMC1 besitter en antatt SH3 mål konsensussekvenser for Crk /GRB2 /Abl og Src kinaser mens heme bindende domene inneholder konsensus sekvens for LCK /abl-P typen tyrosin kinaser og for ERK1 [47], som også spådd av
