Abstract
Aberrant aktivering av β-catenin /Tcf-4 signalering har vært innblandet i menneskekreftutvikling, inkludert tykktarmskreft. I denne studien sammenlignet vi effektene TCF-4 knockdown med β-catenin knockdown på celleproliferasjon, apoptose, og kjemosensitiviteten i SW480 og HCT116 tykktarmskreftceller ved hjelp av adenoviral vektor-formidlet kort hårnål RNA (shRNA). Våre resultater viser at, sammenlignet med p-catenin knockdown, Tcf-4 knockdown mer effektivt hemmet kolonidannelsen, apoptose, og øker 5-FU og oksaliplatin-mediert cytotoksisitet i kolon kreftceller. Vi videre undersøkt hvilke mekanismer som er involvert i de ulike efficacies observert med β-catenin og TCF-fire knockdown i tykktarm kreft celler. FOXO4 er medlem av underfamilien av pattedyr FOXO gaffelhodetranskripsjonsfaktorer og spiller en viktig rolle i å kontrollere celleproliferasjon, apoptose, og DNA-reparasjon. Våre data viser at proteinnivået FOXO4 ikke endret etter behandling med både β-catenin og TCF-4 shRNA. Imidlertid ble β-catenin shRNA funnet å øke opphopning av fosforylert FOXO4 S193 og redusere uttrykket av FOXO målgener p27Kip1 og MnSOD, mens Tcf-4 shRNA viste motsatt effekt. Derfor, sammenlignet med p-catenin knockdown, viser Tcf-4 knockdown bedre effekt for hemming av proliferasjon og indusering av apoptose av kolorektale cancerceller, som kan være relatert til økt FOXO4 transkripsjonen aktivitet. Disse resultatene tyder på at Tcf-4 er et attraktivt potensial terapeutisk mål for kolorektal kreft terapi
Citation. Xie J, Xiang D-B, Wang H, Zhao C, Chen J, Xiong F et al. (2012) Hemming av Tcf-4 induserer apoptose og kjemosensitiviteten av tykktarmskreft celler. PLoS ONE 7 (9): e45617. doi: 10,1371 /journal.pone.0045617
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 03.04.2012; Godkjent: 23 august 2012; Publisert: 24.09.2012
Copyright: © Xie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (nr 30700978). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den kanoniske Wnt signalveien spiller en sentral rolle i mange cellulære prosesser, fra embryonal utvikling til voksen vev homeostase [1]. Aktiviteten av denne signalveien bestemmes av mengden av β-catenin som er tilstede i cytoplasmaet. I fravær av Wnt signalisering, er cytoplasmatisk β-catenin som normalt holdes på et lavt nivå gjennom kontinuerlig ubiquitin-proteasom-mediert nedbrytning av β-catenin, noe som er regulert av en ødeleggelse kompleks sammensatt av adenomatøs polypose coli (APC), glykogen syntase kinase- 3β (GSK-3β), Axin /Conductin, kasein kinase 1α (CK1α), og andre proteiner som formidler slike biokjemiske reaksjoner. Binding av wnt proteiner til celleoverflate-reseptor-komplekset Fz /LRP letter fosforyleringen av den cytoplasmiske hale av LDL-reseptor-relatert protein (LRP) den cytoplasmiske hale av GSK-3β [2]. Dette utløser interaksjonen av Fz /LRP kompleks med Dishevelled (Dsh) og Axin, noe som fører til inaktivering av ødeleggelse kompleks, noe som resulterer i akkumulering av ikke-fosforylert β-catenin i cytoplasma. Akkumulert β-catenin deretter translocates inn i kjernen og binder seg til Tcf /LSF transkripsjonsfaktorer for å regulere nedstrøms målgener, for eksempel c-myc og cyclin D1 [3] -. [5]
Aberrant Wnt /β -catenin signalering har blitt rapportert å bidra til forskjellige humane sykdommer, inkludert kolorektal cancer (CRC) [6], [7]. APC genet eller GSK-3β fosforylering stedet innen ekson 3 av
β-catenin
genet (
CTNNB1
) er mutert i mange kreftceller, inkludert CRC, noe som resulterer i den aktiverte transkripsjonen aktivitet av β-catenin /Tcf signale [8]. Videre er nukleær translokasjon av β-catenin i CRC signifikant assosiert med tumorprogresjon og dårlig overlevelse [9], [10]. Derfor kontroll av β-catenin og /eller kontroll av sin nedstrøms mål genuttrykk representerer et ideelt mål for kreftbehandling og chemoprevention [11], [12], [13] .Van de Wetering
et al
. rapporterte at knockdown av β-catenin av små interfererende RNA (sirnas) eller knockdown av TCF-4 av dominant negativ TCF-4 (dnTCF) effektivt inhiberte aktiviteten av TCF-reporter TOPFlash og indusert cellesyklus-stans og vekstarrest i Ls174T tykktarm kreftceller [14], [15]. Men Tang
et al.
Rapporterte at knockdown av TCF-4 av sirnas økt cellevekst i DLD-1 tykktarmskreftceller [16]. Disse uoverensstemmelsene tyder på at ulike cellelinjer kan reagere forskjellig på TCF-fire knockdown.
FOXO4 er ett medlem av underfamilien av pattedyr FOXO gaffelhodetranskripsjonsfaktorer [17] som er viktige i en rekke prosesser, inkludert celleformering , differensiering, apoptose, DNA-reparasjon, og beskyttelse mot stress [18]. Det er en AKT nedstrøms mål og blir fosforylert ved tre høyt konserverte serin og treoninrester (Thr-28, Ser-193 og Ser-258) ved PKB /AKT-aktivering. Nyere studier har vist at β-catenin binder seg til FOXO transkripsjonsfaktor, som spiller en tumor suppressor rolle i en rekke krefttyper. β-catenin binder seg til FOXO og forsterker transkripsjonen aktivitet [19]. Videre cGMP-avhengig proteinkinase (PKG) inhiberer TCF-signalisering i tykktarmskreftceller ved å blokkere β-catenin ekspresjon og aktivering FOXO4 [20]. Derfor synes β-catenin til å tjene et dobbelt virkning ved å balansere positiv (gjennom Tcf-4) og negative (gjennom FOXO4) regulering av celleproliferasjon og apoptose.
I denne studien, vi hypotese at nedstrømstranskripsjonsfaktor TCF-4 er en mer lovende terapeutisk mål enn β-catenin for behandling av CRC. Vårt mål var å sammenligne effekten av Tcf-fire knockdown og β-catenin knockdown på celleproliferasjon, apoptose, og kjemosensitivitet i SW480 (mutant
APC
, vill-type
CTNNB1
) og HCT116 (mutant
CTNNB1
, vill-type
APC
) tykktarmskreft cellelinjer som bruker kort hårnål RNA (shRNA). Vi viser at sammenlignet med p-catenin knockdown, Tcf-fire knockdown hemmer betydelig celleproliferasjon, induserer celle apoptose, og forbedrer kjemosensitivitet av tykktarmskreftceller gjennom oppregulering av FOXO4 transkripsjonen aktivitet.
Materialer og metoder
Cell Culture and Reagents
SW480 og HCT116-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og holdt i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U /ml penicillin og streptomycin under standard dyrkningsbetingelser. Oksaliplatin, ble 5-fluorouracil (5-FU), og metyl tiazolyl tetrazolium (MTT) kjøpt fra Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). Plasmidet pDC316-EGFP-U6 ble gitt av Vector Gene Technology Company Limited (VGTC, Beijing, Kina) og plasmidet pBHGloxΔE1, ble 3Cre levert av Microbix Biosystems, Inc. (Microbix, Toronto, Canada).
rekombinante adenovirus vektorer
på bakgrunn av cDNA sekvenser (
β-catenin
GenBank tiltredelse no.
NM_001098209,
Tcf-4
GenBank tiltredelse no. NM_030756), en spesifikk par av oligonukleotider med en kort hårnål og dens negative kontrollsekvensen ble utformet og syntetisert, og deretter settes inn i en liten pendel plasmid pDC316-EGFP-U6 på BamH i og Hind III restriksjonsenzymseter. Oligonukleotider ble utformet med følgende primere [21]:
Videre β-catenin shRNA primer
«- GATCCCGTGGGTGGTATAGAGGCTCTTCAAGAGAGAGCCTCTATACCACCCACTTTTTGGAAA-3′, reverse β-catenin shRNA primer. 5»-AGCTTTTCCAAAAAGTGGGTGGTATAGAGGCTCTCTCTTGAAGAGCCTCTATACCACCCACGG-3 «;
Videre Tcf-4 shRNA primer
5′-GATCCCCGGAGCGACAGCTTCATATGTTCAAGAGACATATGAAGCTGTCGCTCCTTTTTGGAAA-3′, reverse Tcf-4 shRNA primer:
5′-AGCTTTTCCAAAAAGGAGCGACAGCTTCATATGTCTCTTGAACATATGAAGCTGTCGCTCCGGG-3;
Kontroll shRNA. forover
5′-GATCCCCCAGTAACTGAATAGCTACCTTCAAGAGAGGTAGCTATTCAGTTACTGTTTTTGGAAA-3 «, motsatt retning. 5»-AGCTTTTCCAAAAACAGTAACTGAATAGCTACCTCTCTTGAAGGTAGCTATTCAGTTACTGGGG-3 «. Kontrollen shRNA ikke har homologi med alle relevante humane gener. Alle konstruksjoner ble verifisert ved DNA-sekvensering. De resulterende transporttjenester plasmider ble co-transfektert med adenovirus rednings plasmid pBHGloxΔE1, 3Cre inn i 293-celler til å erverve rekombinant adenovirus. Rekombinant adenovirus effektivitet ble påvist ved å undersøke den cytopatiske effekt og EGFP ekspresjon i cellene. Adenovirus-titere ble målt etter amplifikasjon og rensing ved anvendelse av TCID50-analyser.
kolonidannelse Assay
SW480-celler ble infisert med rekombinant adenovirus i 90 minutter, og etter 24 timer ble de podet med 300 celler /brønn på 6-brønners plater og fikk feste seg i 24 timer. Etter inkubasjonen ble mediet skiftet, og platene ble inkubert i ytterligere 10 dager under de samme dyrkningsbetingelser. Kolonier ble fiksert og farget med 0,1% krystallfiolett i 100% etanol og deretter tellet. Kloner av minst 50 celler ble regnet som en koloni.
cytotoksisitetsassayer
SW480 celler ble infisert med rekombinante adenovirus for 90 minutter, og etter 24 timer, ble de belagt i 96-brønn plater ved 4000 celler /brønn. Etter 24 timers kultur ble cellene behandlet med de angitte konsentrasjoner av 5-FU eller oksaliplatin i 72 timer. Deretter ble 20 ul MTT (5 g /l) tilsatt til hver brønn og inkubert i ytterligere 4 timer. De kulturmedier ble deretter kastet, 0,15 ml dimetylsulfoksyd (DMSO) ble tilsatt, og platene ble inkubert i ytterligere 10 minutter med vibrasjon. Absorbansen ble målt ved 490 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser (modell 550, Bio-Rad, USA).
Apoptose-analysen
SW480-celler ble sådd ut i seks brønns plater ved en densitet på 0,5 x 10
6 celler /brønn. Tjuefire timer etter plating ble cellene ved 70% konfluens infisert med adenovirus i 90 minutter og deretter vasket for å fjerne adenovirus. Etter ytterligere 24 timers kultur, ble den apoptotiske indeksen bestemt ved strømningscytometri ved bruk av Annexin V-FITC-kit som tidligere beskrevet [22].
Western Blot analyse
Cellene ble høstet og totalt antall proteiner ble ekstrahert med RIPA-buffer inneholdende proteaseinhibitorer. Western blot ble gjennomført som tidligere beskrevet [22]. Kort beskrevet ble like protein alikvoter (50 ug) i hver prøve oppløses ved 10 eller 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og proteinene ble overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Etter blokkering med 5% ikke-fett tørrmelk, ble membranene inkubert med antistoffer mot p-catenin (1:5,000), Tcf-4 (1:1,000), c-myc (1:2000), cyklin D1 (1: 2000), FOXO4 (1:1000), FOXO4 S193 (1:500), p27Kip1 (1:2000), MnSOD (1:2000), Caspase-3 (1:500), og β-aktin (1:3000) . Membranene ble deretter inkubert med et pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (1:2000) (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinene ble påvist med en forbedret kjemiluminescens påvisningssystem (Pierce), og lys-emisjonen ble fanget på Kodak røntgenfilm.
Transfeksjon og reportergen Assay
For målinger av β-catenin /TCF-4 transkripsjonen aktivitet, et par av luciferase-rapportør plasmider (TOPflash /FOPflash; Upstate Biotechnology) ble anvendt. PRL-TK luciferasereportergenet plasmid (Promega) ble ko-transfektert til å normalisere for transfeksjonseffektivitet. Transient transfeksjon ble utført ved hjelp Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble infisert med de rekombinante adenovirus i 90 minutter, og etter 24 timer, ble deretter ko-transfektert med TOPflash luciferase reporter (eller mutant kontroll FOP flash-vektor) og PRL-TK. Etter ytterligere 24 timers inkubering ble cellene høstet for luciferase-aktivitetsmåling ved hjelp av dobbel-luciferase reporter analysesystem (Promega). Tre gjentatte eksperimenter ble utført.
Statistical Analysis
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standard avvik (S.D.). Den statistiske signifikans av forskjeller ble bestemt ved enveis analyse av varians (ANOVA) ved hjelp av SPSS v12.0 programvare (SPSS, Chicago, Illinois, USA). En verdi på
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
1. Knockdown TCF-4 eller β-catenin av Adenovirus-mediert transduksjon av shRNA
For å knockdown uttrykket av Tcf-4 eller β-catenin, ble adenovirus vektorer generert for å uttrykke en shRNA targeting Tcf-4 eller β- catenin. Western blot-analyse avslørte en reduksjon doseavhengig i Tcf-4 eller β-catenin proteinekspresjon ved 48 timer etter infeksjon med de respektive adenovirale vektorer i SW480 og HCT116-celler, mens ingen forandring i protein-ekspresjon ble observert etter infeksjon med adenovirus inneholdende omkastede shRNA (fig. 1).
SW480 og HCT116-celler behandlet med forskjellige multiplisitet av infeksjon (MOI) på adenovirus som bærer shRNA. Prøver ble samlet ved 48 timer etter infeksjon. Western blot-analyse av cellelysater for proteinet ekspresjon av β-catenin (a) og TCF-4 (b).
2. TCF-4 Knockdown undertrykker Wnt signale
SW480 og HCT116 cellelinjer har konstitutivt aktiv β-catenin /TCF-4 transkripsjonen aktivitet. Derfor celler ble transient transfektert med en TCF reporter plasmid, TOPflash, som består av tre TCF bindingssteder oppstrøms for en minimal tk promoter og luciferase åpne leseramme, eller kontroll plasmid, FOPflash, som er identisk med TOPflash med unntagelse av at det inneholder mutant inaktive TCF bindingssteder. Figur 2a viser at både β-catenin shRNA og TCF-4 shRNA markert undertrykket endogen β-catenin /Tcf-4 transkripsjonen aktivitet sammenlignet med kontrollen shRNA i begge SW480 og HCT116-cellelinjer.
SW480 og HCT116-celler var behandlet med adenovirus (50 MOI) bærer shRNA. a, ved 24 timer etter infeksjon ble cellene kotransfektert med rapportørgener husing Tcf-4-bindingsseter (TOPflash) eller en mutant Tcf-bindingssetet (FOPflash), respektivt, sammen med PRL-TK. Luciferase-aktiviteten ble bestemt 24 timer etter transfeksjon, normalisert mot verdier for den tilsvarende PRL-TK-aktivitet. Verdier representerer betyr ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,01 versus kontroll shRNA. b, Ved 48 timer etter infeksjon ble cellene høstet og protein uttrykk ble bestemt ved western blot.
Cyclin D1 Hotell og
c-myc
er kjent β-catenin /Tcf-4 mål gener, og derfor har vi også undersøkt protein uttrykk for cyclin D1 og c-myc av western blot. Figur 2b viser at β-catenin shRNA eller Tcf-4 shRNA behandling resulterte i en markant nedgang i cyclin D1 og c-myc protein i både SW480 og HCT116 cellene.
3. TCF-fire knockdown Forbedrer FOXO4 aktivitet
For å analysere proteinnivået og aktivering av FOXO4 protein, ble SW480 og HCT116-celler dyrket i 48 timer etter infeksjon med adenovirus, og proteinnivået ble vurdert av western blot. Proteininnholdet av FOXO4 ble ikke vesentlig endret etter behandling med β-catenin shRNA eller Tcf-4 shRNA (fig. 3). Imidlertid er protein nivået av fosforylert FOXO4 S193 ble markert øket etter behandling med β-catenin shRNA, og ble redusert etter behandling gis TCF-4 shRNA (fig. 3). Uttrykket nivåer av FOXO målgener p27Kip1 og MnSOD ble merkbart redusert etter behandling med β-catenin shRNA og økte etter behandling gis TCF-4 shRNA (fig. 3).
SW480 og HCT116-celler behandlet med adenovirus ( 50 MOI) bærer shRNA. Prøver ble samlet ved 48 timer etter infeksjon. Proteininnholdet av FOXO4, fosforylert FOXO4 S193, p27Kip1, og MnSOD ble bestemt av western blot.
4. TCF-fire knockdown hemmer celleproliferasjon og induserer Cell apoptose i kolorektal kreft celler
Vi undersøkte neste effekten av TCF-fire knockdown på celleproliferasjon og apoptose i SW480 og HCT116-celler. Celleformering ble bestemt ved anvendelse av en kolonidannelsesbestemmelsen. Som vist i figur 4a, Tcf-4 knockdown induserte en betydelig sterkere inhibering av celleproliferasjon sammenlignet med p-catenin knockdown i både SW480 og HCT116-celler (p 0,05, s 0,01, henholdsvis). For å undersøke hvorvidt Tcf-4 shRNA-mediert vekstinhibering er assosiert med apoptose, behandlede og ubehandlede celler ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Som vist i figur 4b, både β-catenin shRNA og TCF-4 shRNA induserte en signifikant økning i antallet av apoptotiske celler sammenlignet med ubehandlede celler og kontroll shRNA behandlede gruppene (p 0,01), og TCF-4 shRNA induserte et større antall av apoptotiske celler enn p-catenin shRNA (p 0,01). Apoptosiske enzymet kaspase-3 aktiveres ved et konvergenspunktet mellom de indre og ytre apoptoseinduksjon trasé [23]. Derfor, undersøkte vi caspase-3-spalting som en markør for apoptose. I samsvar med flowcytometri funn, Tcf-4 shRNA induserte en høyere økning i caspase-3 cleavage forhold til p-catenin shRNA (fig. 4c).
Celler ble behandlet med adenovirus (50 MOI) bærer shRNA for 24 timer. en, celle proliferasjon ble bestemt ved anvendelse av en kolonidannelsesbestemmelsen. b, ble celle apoptose bestemt ved anvendelse av Annexin V-FITC-farging. c, Ekspresjonen av proapoptotiske enzym caspase-3 ble bestemt ved western blot. Hvert datapunkt representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre eller flere uavhengige bestemmelser. *
P
0,01 versus kontroll shRNA;
#
P
0,05 versus β-catenin shRNA;
##
P
. 0,01 versus β-catenin shRNA
5. TCF-fire knockdown kjemosensitiviteten i kolorektal kreft celler
SW480 og HCT116-celler ble forbehandlet med de rekombinante adenovirus som bærer respektive shRNA og ble deretter behandlet med 5-FU eller oksaliplatin ved forskjellige konsentrasjoner i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av et MTT-assay. Som vist i figur 5, β-catenin shRNA behandlingen økte 5-FU og oksaliplatin-mediert cytotoksisitet. I tillegg Tcf-4 shRNA behandling resulterte i en mer betydelig økning av cytotoksisitet i forhold til p-catenin shRNA behandling på hver konsentrasjon poenget med 5-FU og oxaliplatin (p 0,01).
Celler ble infisert med adenovirus (50 MOI) bærer shRNA; 48 timer etter infeksjon, ble cellene behandlet med 5-FU eller oksaliplatin i forskjellige konsentrasjoner i 72 timer. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av et MTT-assay. Søylediagrammer representerer gjennomsnittsverdiene av tre bestemmelser ± sd
Diskusjoner
Tykktarmskreft (CRC) er en av de mest vanlige voksne ondartede svulster som oppstår i verden i form av både sykelighet og dødelighet . Til tross for forbedringer i medisinsk behandling, utfallet av behandling for lokalavansert eller metastatisk sykdom er fortsatt skuffende, med 5-års overlevelse lavere enn 10% hos pasienter med metastaser. Avvikende WNT sti signalering er en tidlig progresjon hendelse i 90% av CRC. Det skjer gjennom mutasjoner i hovedsak av
APC plakater (opptil 80%) og sjeldnere av
β-catenin plakater (rundt 10%) eller AXIN2 [24]. Mutasjoner i
APC /β-catenin
gener, noe som resulterer i unormal aktivering av β-catenin /Tcf-4-reaksjonsveien, er vanlig i CRC, hvilket antyder at målrettet inhibering av denne bane kan være en potensiell terapeutisk tilnærming å kontrollere CRC. Vi og andre har tidligere rapportert at naturlige forbindelser og ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) hemmer Wnt /β-catenin signalveien [22], [25], [26], [27], [28]. Men det er ikke noe selektiv hemmer for denne veien tilgjengelig som et terapeutisk middel. Nyere studier har vist at shRNA-mediert genet Slå av β-catenin inhiberer signifikant celleproliferasjon og induserer celle apoptose i humane tarmkreftceller [29], [30], [31].
I den foreliggende undersøkelse, vi spesielt fokusert på å sammenligne efficacies av β-catenin knockdown og TCF-fire knockdown i tykktarm kreft celler, og undersøkte mulige molekylære mekanismene som er ansvarlig for disse effektene. Vi har vist at Tcf-4 knockdown induserer en betydelig sterkere hemming av celleproliferasjon, induksjon av apoptose, og forbedring av kjemosensitiviteten i tykktarmskreftceller i forhold til p-catenin knockdown.
Aktivert β-catenin /Tcf-4 signalisering ved akkumulering av β-catenin i kjernen har blitt implisert i human karsinogenese, inkludert CRC. Denne opphopning kan skyldes mutasjon av enten tumorsuppressorgenet
APC
eller
β-catenin
selv. Minst 60% av sporadiske CRC tilfeller inneholde en APC-mutasjonen, og nesten halvparten av dem viser unormalt i begge APC lene [32], [33], [34]. I denne studien har vi gjennomført en detaljert mekanistisk studie for å evaluere effekten av hemming av β-catenin /Tcf-4 signalering i menneskelig CRC hjelp av menneskelig CRC SW480 cellelinje, som havner mutant APC og villtype β-catenin, og den HCT116-cellelinjen, som havner mutant β-catenin og vill-type APC. Vi først bygget adenovirus vektorer som bærer human β-catenin eller Tcf-4 shRNA for å knockdown uttrykk av β-catenin eller Tcf-4. Western blot-analyse avslørte en reduksjon doseavhengig i Tcf-4 eller β-catenin proteinekspresjon i SW480 og HCT116-celler ved 48 timer etter infeksjon med de respektive adenovirusvektorer. I tillegg er både β-catenin shRNA og TCF-4 shRNA markert undertrykket β-catenin /Tcf-4 transkripsjonen aktivitet, så vel som ekspresjon av to kjente målgener, Cyclin D1 og c-Myc, i SW480 og HCT116-celler. Disse dataene indikerer at både β-catenin knockdown og TCF-fire knockdown undertrykke β-catenin /Tcf-fire aktivitet
in vitro
.
Samordning mellom celleproliferasjon og apoptose spiller en svært viktig rolle i kreftutvikling og utvikling av tykktarmskreft. Den β-catenin /Tcf-fire veien er en viktig signalveien som tips balansen av celleproliferasjon og apoptose i kreftceller. I vår studie, β-catenin knockdown hemmet celleproliferasjon og indusert celle apoptose i både SW480 og HCT116-celler. Sammenlignet med β-catenin knockdown, Tcf-4 knockdown induserte en betydelig større hemning av celleproliferasjon og induksjon av apoptose. Videre fant vi at Tcf-fire knockdown betydelig forbedret kjemosensitivitet av både SW480 og HCT116 cellene til 5-FU og oxaliplatin.
Vi videre undersøkt hvilke mekanismer som er involvert i differensial efficacies av β-catenin knockdown og Tcf- 4 knockdown i SW480 og HCT116-celler. Våre data viser at proteinnivået FOXO4 ikke endret etter behandling med både β-catenin og TCF-4 shRNA. Imidlertid ble β-catenin shRNA funnet å øke akkumuleringen av fosforylert FOXO4 S193 og redusere ekspresjonen av målgener FOXO p27Kip1 og MnSOD, som er i overensstemmelse med en tidligere rapport som viser at β-catenin-spesifikk siRNA inhiberte TCF rapportøraktivitet og FOXO- avhengig signalisering i LS174 tykktarmskreftceller [19]. I kontrast, Tcf-4 shRNA viste det motsatte regulerende rolle p-catenin på FOXO4. Disse funnene antyder at β-catenin shRNA-indusert nedregulering av FOXO4-avhengig signalisering er uavhengig på Tcf-4.
FOXO faktorer spiller en stor rolle i å kontrollere celle-proliferasjon, apoptose, og oksidativt stress [17]. [18]. Deres funksjoner er regulert av flere signalveier, inkludert AKT. I fravær av AKT-aktivering, er FOXO4 lokalisert i kjernen, hvor den fungerer som en transkripsjonsfaktor [35]. Ved AKT aktivering, blir FOXO4 fosforylert på tre høyt konserverte serin og treoninrester (Ser-193, Thr-28, og Ser-258) etterfulgt av inaktivering og kjerne utelukkelse [36]. Essers et al. [19] viste at det var funksjonell interaksjon mellom β-catenin og FOXO i oksidativt stress signalering, og β-catenin-spesifikk shRNA redusert TCF og FOXO transkripsjonen aktivitet i LS174T kolon kreftceller som uttrykker en mutant form av β-catenin. Akkumulerende bevis tyder på at FOXO faktorer virker som tumor-suppressorer i en rekke krefttyper. Tang et al. [37] har også funnet at FOXO4 hemmet ekspresjon av HIF-1α og VEGF i kreftceller. Videre er en fersk studie viste at overekspresjon av vill type FOXO4 ført til en økning i doxorubicin-mediert cytotoksisitet i HCT116 tykktarm kreft celler, som ble ytterligere forverret av overekspresjon av en FOXO4 mutant lokalisert utelukkende i kjernen [38].
Derfor hypoteser vi at oppregulering av FOXO4 aktivitet er ansvarlig for større effekt TCF-4 shRNA effekter i tykktarm kreft celler sammenlignet med p-catenin shRNA. På den ene siden kan Tcf-4 og FOXO4 konkurrere for β-catenin [19]. Når Tcf signale hemmes, binder β-catenin direkte til FOXO4 og forbedrer FOXO4 transkripsjonen aktivitet. På den annen side kan Tcf4 knockdown nedregulere enkelte signalveier, for eksempel Akt. En fersk rapport viser at en betydelig reduksjon av akt2 nivåer og fosforylering av Akt ble detektert etter knockdown TCF-4 ved anvendelse av Tcf-4 siRNA in glioma-celler [39]. Derfor, inaktivering av Akt ved Tcf-4 shRNA resulterer i defosforylering av FOXO4, som dermed aktiverer FOXO-avhengig signalisering.
Som konklusjon, har vi vist at målrettede inhibering av β-catenin /Tcf-4-signalisering inhiberer celle spredning, induserer apoptose, og kjemosensitiviteten av tykktarmskreftceller. I tillegg, sammenlignet med p-catenin knockdown, Tcf-4 knockdown viste større effekt for hemming av CRC cellevekst og indusering av apoptose, som kan være relatert til en økning i FOXO4 transkripsjonen aktivitet. Disse resultater antyder at Tcf-4 kan være et attraktivt terapeutisk mål for CRC terapi. Fremtidige studier er nødvendig for å bekrefte disse funnene og fastslå nytten av målretting Tcf-4.
