Abstract
Kontroll av radioresistance og metastatisk potensial av overlevende kreftceller er viktig for å forbedre kreft utrydding av stråleterapi. Den distale-mindre homeobox2 (
DLX2
) genet koder for et homeobox transkripsjon faktor involvert i morphogenesis og dens deregulering ble funnet i menneskelige solide svulster og hematologisk kreftsykdom. Her undersøkte vi hvilken rolle DLX2 i forbindelse med stråling-indusert epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og stamcellelignende egenskaper og regulering av Smad2 /3 signale i bestrålt A549 og MDA-MB-231 humane kreftcellelinjer. I bestrålt A549 og MDA-MB-231 celler, ble EMT indusert som demonstrert av EMT markør uttrykk, fosforylering av Smad2 /3, og trekkfugl og invasiv evne. Også bestrålt A549 og MDA-MB-231 celler viste økt kreftstamceller (cscs) markør. Interessant, DLX2 ble overexpressed ved bestråling. Derfor undersøkte vi hvilken rolle DLX2 i stråleindusert EMT og radioresistance. Overekspresjon av DLX2 alene indusert EMT, migrasjon og invasjon, og CSC markør uttrykk. Den reduserte kolonidannende evne i bestrålte celler ble delvis restaurert av DLX2 overekspresjon. På den annen side, uttømming av DLX2 ved hjelp av Si-RNA opphevet stråleindusert EMT, CSC markør uttrykk, og fosforylering av Smad2 /3 i bestrålt A549 og MDA-MB-231-celler. Også uttømming av DLX2 øket strålingsfølsomhet i begge cellelinjer. Videre knockdown av Smad2 /3, en nøkkel aktivator av TGF-β1 vei, oppheves den strålings-induserte DLX2 ekspresjon, noe som indikerer at strålings-indusert DLX2 ekspresjon er avhengig av Smad2 /3 signalering. Resultatene viste at DLX2 spiller en avgjørende rolle i radioresistance, stråling-indusert EMT og CSC markør uttrykk, og uttrykket av DLX2 er regulert av Smad2 /3 signale i A549 og MDA-MB-231 cellelinjer.
Citation: Choi YJ, Baek GY, Park HR, Jo SK, Jung U (2016) Smad2 /3-regulert Expression of DLX2 er forbundet med stråling-indusert Epitelial-Mesenchymale Overgang og Radioresistance av A549 og MDA-MB-231 Menneskelig Cancer Cell Lines. PLoS ONE 11 (1): e0147343. doi: 10,1371 /journal.pone.0147343
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 8 april 2015; Godkjent: 31 desember 2015; Publisert: 22 januar 2016
Copyright: © 2016 Choi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av Korea regjeringen (MSIP) (No. 2013M2A2A7043663)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Strålebehandling er en av de mest vanlige behandlingsformer for kreft, men en av sine begrensninger er at noen av overlevende kreft cellene kan få radioresistance [1] og metastatisk evne [2] som følge av gjentatt strålebehandling. Tilstedeværelsen av epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og kreft stamceller (cscs) har vært implisert som en antatt årsak til tumor radioresistance hos pasienter [2]. Cscs er en distinkt populasjon av tumorceller med egenskapene til selvfornyelse og regenerering, og er blitt identifisert i forskjellige humane ondartede svulster [3, 4, 5]. Cscs viser typiske kjennetegn ved EMT [6, 7], og EMT er igjen forbundet med radioresistance [8, 9]. Av denne grunn er forskning og utvikling av prediktive biomarkører og målrettet terapeutisk strategi for CSC og EMT er spesielt viktig for prognose evaluering og forbedring i Radiosensitivity strålebehandling [10, 11]. Representative CSC markører Oct4, Sox2, Slug /Snail [12, 13, 14], og de siste rapportene har identifisert særlig CD44 som en CSC-relaterte potensiell biomarkør for stråleterapi i lunge- og brystkreftceller [15, 16, 17].
i EMT prosess av kreftceller, blir uttrykkene for de epiteliale gener som E-cadherin og Vinculin hemmet, mens uttrykkene av mesenchymale gener slik som N-cadherin og vimentin er forbedret [18, 19, 20 ]. Som et resultat av EMT, cellene erverve metastatiske egenskaper, inkludert tap av kontakt-inhibering, uordnede vekstkontroll, og aggressiv invasivitet [18, 21]. EMT er regulert av transkripsjonsfaktorer inkludert Snail, Twist, og ZEB [7, 22, 23, 24]. Matrix metalloproteinaser (MMP) er også viktige formidlere av EMT, som nedbrytes ECM og tillater migrasjon og invasjon av kreftceller til fjerne steder som resulterer i metastase [25].
I en normal tilstand, TGF-beta handlinger som en tumor suppressor men er også kjent å forbedre EMT og for å understøtte angiogenese i sent stadium av tumorigenesis [26]. Nylig har flere rapporter viste at IR fremmer EMT via Smad avhengig TGF-β signalisering i cancercellelinjer [6, 27, 28]. I TGF-β vei, TGF-beta-reseptorer gjenkjenne ligander og utløse fosforylering av reseptor-forbundet Smad proteiner (Smad2 /3) som forbinder med Smad4. Smad2 /3/4-komplekser akkumuleres i kjernen og delta i reguleringen av målgener uttrykk [29].
Vertebrate distal-mindre homeobox2 (DLX2) fungerer som en homeo-box transkripsjonsfaktor og har viktige roller i embryoutvikling, craniofacial utvikling, vev homeostase. Ifølge de siste rapportene, ble deregulering av DLX2 funnet i menneskelige solide svulster og hematologisk kreftsykdom [30, 31, 32], og DLX2 er spekulert å være involvert i tumorprogresjon via regulering av metabolsk stress-indusert nekrose [33]. Videre DLX2 i seg selv er et målgen av Smad avhengig TGF-β signalering og virker som en negativ feedback-faktor av TGF-β signalering [34]. Disse studiene har gjort oss til å fokusere på den potensielle rolle DLX2 i tilegnelsen av CSC og EMT egenskaper via Smad avhengig TGF-β signale IR-behandlede kreftceller.
I denne studien har vi undersøkt hvilken rolle av DLX2 i forbindelse med stamcellelignende egenskaper og epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og regulering av Smad2 /3 signale i bestrålte A549 humane lungekreftceller og MDA-MB-231 humane brystkreftceller. Vi rapporterer her at IR indusert uttrykk for DLX2 gjennom aktivering av Smad2 /3, og DLX2 fremmet migrasjon og invasjon, og radioresistance i A549 og MDA-MB-231 cellelinjer.
Materialer og Metoder
Antistoffer
Antistoffer mot DLX2, Smad2 /3, CD44, β-catenin, N-cadherin og E-cadherin ble kjøpt fra Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). Anti-sneglen, anti-vimentin og anti-Vinculin antistoffer ble kjøpt fra cellesignalisering Technologies (Danvers, MA, USA). En anti-pSmad2 /3 antistoff ble kjøpt fra Kerafast, Inc. (Boston, MA, USA). Anti-β-actin antistoff ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA).
Cell kultur og Bestråling
A549 (human ikke-liten kreftcellelinje celle lunge) og MDA-MB-231 (human brystkreft cellelinje) ble kjøpt fra koreanske cellelinje Bank (Seoul, Korea). Celler ble opprettholdt i RPMI1640 supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone, Utah, USA), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. Celler ble frigjort fra kulturskålen ved bruk av 0,25% trypsin og fortynnet til 1,5 x 10
5 celle /ml. Celler ble bestrålt med
137Cs gammastråler ved hjelp av en Gammacell 40 Exactor (MDS Nordion, Ontario, Canada) ved KAERI og deretter re-belagt i kultur retter eller kamre.
Byggingen av DLX2 overekspresjon vektor og transfeksjon
Et innlegg av menneskelig DLX2 ble forsterket fra pCMV-sports6 /DLX2 (Korea menneskelige genbank, Seoul, Korea) ved PCR ved hjelp av følgende primere:
EcoRI product: (forward): 5 «-CGGAATTC ATGACTGGAGTCTTTGAC-3» og
Xho
I (revers): 5′-CTCTGAGT TTAGAAAATCGTCCCCG-3 «. DLX2 innskuddene ble klonet inn i vektoren pcDNA3-myc som tillater ekspresjon av c-myc-merket protein i pattedyrceller. pcDNA3-myc /DLX2 eller pcDNA3-myc ble deretter levert til celler (4 mikrogram /2,5 × 10
5 celler) ved hjelp HilyMax (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, ML, USA) transfeksjon reagens i henhold til produsentens anvisninger. Etter inkubasjon i 24 timer, ble cellene frittliggende og bestrålt.
Small-interfering RNA (siRNA) transfeksjon
Si-RNA målretting DLX2 og Smad2 /3 ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi ( Santa Cruz, CA, USA). For transfeksjon ble cellene belagt og vokst til 70-90% samløpet. Target si-RNA eller negativ kontroll si-Ct ble deretter levert til celler (SI-DLX2: 50 mikrometer /2,5 × 10
5 celler; si-Smad2 /3: 100 mikrometer /2,5 × 10
5 celler) bruker HilyMax transfeksjon reagens i henhold til produsentens anvisninger. Etter inkubasjon i 24 timer, ble cellene frittliggende og bestrålt.
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR
Etter 24 timers bestråling, total RNA ekstrakter (1 × 10
6 celler ) ble isolert ved Trizol Reagens (Ambion, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Revers transkripsjon ble utført for cDNA syntese ved hjelp TOPscript RT DryMIX inneholder revers transkriptase, RT buffer, dNTP blanding, Oligo dT (Enzynomics, Seoul, Korea). Kvantitativ real-time PCR ble utført av en StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, USA) med SYBR Grønn reagens (Enzynomics, Seoul, Korea). -Primere ble utformet ved bruk av primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) og sekvensene er presentert i tabell 1. Totalt reaksjonsvolum på PCR-blanding ble 20 pl, og reaksjons betingelsene~~POS=HEADCOMP var 15 min for innledende denaturering ved 95 ° C og 40 sykluser på 10 sek ved 95 ° C, 15 sek ved 60 ° C og 20 sek ved 72 ° C. Den komparative C
t-metoden ble anvendt, og relative mRNA-ekspresjonsnivået ble beregnet basert på normalisering p-aktin. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger, uavhengig av hverandre.
klonogene assay
frigjorte celler ble utsatt for forskjellige doser av bestråling og inkubert i 7 dager (A549) og 10 dager (MDA-MB -231) ved 37 ° C. Mediet for alle kulturer ble fornyet hver 3. dag. Koloniene ble fiksert med 60% metanol og farget med 0,5% krystallfiolett. Kolonier som inneholder 50 celler eller mer ble regnet som klonogene celler. De rapporterte overlevelse brøk verdier er gjennomsnittet av seks replikater fra tre uavhengige eksperimenter.
Cell migrasjon analysen
For å måle deres migrasjon, bestrålt A549 og MDA-MB-231 celler ble sådd i et transwell (Corning Incorporated, New York, USA) ved en tetthet på 2,5 x 10
4 celler /brønn i 200 ul serumfritt medium og inkuberes i 7 timer (A549) eller 3 h (MDA-MB-231) ved 37 ° C. Etter inkubasjonen ble mediet fjernet. Celler ble fiksert ved inkubering med 100% metanol og farget med 0,5% krystallfiolett i 15 min. Membranen ble kuttet bort fra hvert kammer og migrerte celler på den nedre overflate av filteret ble tellet pr filter i tilfeldig mikroskopiske innlevert på en 200-gangers forstørrelse (Leica, Heidelberg, Tyskland). De rapporterte verdier er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter.
Cell invasjon analysen
Muligheten av bestrålt A549 og MDA-MB-231 celler til å passere gjennom Matrigel-belagte filtre ble målt i en Boyden kammer invasjon analysen. Matrigel ble påført på toppen et polykarbonatfilter (porestørrelse, 8 um). Celle invasjon analyser ble utført ved anvendelse av en matrigel invasjon analysesett (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble cellene sådd ut i det øvre kammer ved en tetthet på 2,5-5 x 10
4 celler /brønn i 500 ul serumfritt medium og inkubert i 48 timer (A549), 24 timer (MDA-MB-231 ) ved 37 ° C. Celler som invaderte den nedre overflate av hver membran ble fiksert med 100% metanol og farget med 0,5% krystallfiolett i 15 min. Membranen ble kuttet bort fra hvert kammer og invaderte celler på den nedre overflate av filteret ble tellet pr filter i tilfeldig mikroskopiske innlevert på en 100-gangers forstørrelse (Leica, Heidelberg, Tyskland). De rapporterte verdier er gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter.
Western blot-analyse
Etter 24 timers bestråling, og den totale cellelysatene (2 x 10
6-celler) ble fremstilt under anvendelse av RIPA-lysebuffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) som inneholder 10 mM phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF), 10 mM natriumfluorid (NAF), 1 mM natriumortovanadat (Na
3VO
4) og en komplett proteasehemmer cocktail (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, USA) og proteininnholdet ble målt ved anvendelse av BCA-proteinanalyse-reagens (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), med bovint serumalbumin som standard. Like mengder protein ble oppløst ved 10% SDS-PAGE og overført på en polyvinylidendifluorid-membran (Amersham Hybond, Freiburg, Tyskland). Membranen ble deretter vasket med Tris-bufret saltvann (10 mM tris og 150 mM NaCl) som inneholdt 0,1% Tween 20 (TBST), og blokkert med TBST som inneholdt 5% fettfri tørrmelkpulver. Membranen ble inkubert over natt med primært antistoff og blottet ble utsatt for pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff og utviklet ved hjelp av ECL Western-blot påvisningsreagenser (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA).
Immunofluorescence (IF) farging
for å analysere den intracellulære lokalisering av F-aktin og markørproteiner, A549 og MDA-MB-231 celler ble seedet i Lab-Tek kammer lysbilde åtte godt glass-slide (Nunc, NY, USA) og transfeksjon med si -Ct eller si-DLX2 i 24 timer og deretter inkubering i 24 timer etter IR. Cellene fiksert i 4% formaldehyd ble farget ved inkubering med primært antistoff (kanin-polyklonalt anti-N-cadherin /vimentin /E-cadherin /Vinculin antistoff, fortynnet 1: 100) over natten ved 4 ° C. De ble deretter skylt med PBS, inkubert med blokkeringsbuffer, og ble behandlet med en Alexa 546-konjugert anti-kanin-antistoff (Molecular Probes, CA, USA) i 3 timer ved romtemperatur. Til slutt ble intracellulær F-aktin farges ved hjelp av Alexa-phalloidin-488 (fortynnet 1: 300, Molecular Probes, CA, USA) i 1 time. Kjernen av cellen ble farget med TO-PRO-3 (Molecular Probes, Eugene, USA). Fargede celler ble montert og avbildes ved hjelp av en laser konfokal scanning mikroskop (Leica, Heidelberg, Tyskland).
Bestemmelse av TGF-β1 i cellekultursupernatanter
A549 og MDA-MB-231 (5 x 10
5-celler /brønn) celler ble eksponert for IR ved 8Gy, 4Gy og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Nivået av TGF-β1 protein i kultur-supernatanter, ble målt ved anvendelse av en TGF-β1 ELISA-sett (BD Biosciences, San Diego, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Absorbansen ved 450 nm ble målt ved anvendelse av en mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). TGF-β1 proteinnivåer ble bestemt ut fra tre forskjellige forsøk, og er uttrykt som pg /ml.
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført tre ganger. Statistisk signifikante forskjeller ble funnet ved bruk av Student t-test. Statistiske sannsynligheten for P 0,05 ble betraktet som signifikant. Data representerer middelverdier ± S.E.M.. av de tre forsøkene, hver utført i tre eksemplarer.
Resultater
Ioniserende stråling induserer EMT og øker CD44 og DLX2 uttrykk
Vi først analysert stråling følsomhet for menneskelig A549 lungekarsinom og MDA-MB-231 bryst adenokarcinomceller av klonogene analysen. I denne analysen ble celleoverlevelse doseavhengig redusert ved IR (0, 2, 4, 6, 8Gy) i begge cellelinjer, men MDA-MB-231-celler var mer følsomme overfor IR enn A549-celler (figur 1A). De morfologiske forandringer av cellene etter eksponering for IR ble bekreftet i A549 cellene bestrålt ved 8Gy og MDA-MB-231-celler ved 4Gy. Det bestrålte A549 og MDA-MB-231cells viste spindel-formet og langstrakte morfologi, som er typisk for EMT morfologiske fenotyper sammenlignet med kontrollceller (fig 1b).
(A) Frittliggende-celler (1 x 10
5cells /ml) ble utsatt for forskjellige doser av bestråling og inkubert i 7 dager (A549) og 10 dager (MDA-MB-231) ved 37 ° C. Kolonier som inneholder 50 celler eller mer ble regnet som klonogene celler. Den overlevende fraksjon ble beregnet ved å dividere plette effektiviteten av behandlede prøve med pletteringseffektiviteten av kontroll. Plating effektivitet ble beregnet ved å dividere antall kolonier med antall celler belagt. De rapporterte verdier er gjennomsnittet av seks replikater fra tre uavhengige forsøk. (B) IR induserer morfologisk endring i A549 og MDA-MB-231 celler etter 24 timer med eksponering (A549-8Gy, MDA-MB-231-4Gy). Forstørrelsen av bildet er × 100. Ct, kontrollere cellen; IR, bestrålt celler.
Vi neste undersøkte dose-og tidsavhengige endringer i CSC- og EMT-relaterte markør uttrykk. I samsvar med tidligere studier, økt IR uttrykk for TGF-β signale faktor pSmad2 /3, en CSC markør (CD44), EMT positive markører (N-cadherin, vimentin) og transkripsjonsfaktorer som regulerer EMT (Snail, β-catenin ), og redusert ekspresjon av EMT negative markører (E-cadherin, Vinculin) avhengig på IR-dose eller tid i begge cellelinjer (fig 2A og 2B). Interessant, ekspresjonen av DLX2 ble også øket ved IR- i begge cellelinjer. Dose-respons-eksperimenter viste at DLX2 induksjon ble observert ved 8Gy i A549 og 4Gy eller høyere i MDA-MB-231 (figur 2A og S1 figur), og tidsforløpet eksperimenter viste at DLX2 protein nivåer ble dramatisk økt på 24 timer etter bestråling i begge cellelinjer (fig 2B og S2 fig). Også IR utløst oppregulering av mRNA-nivåer av stemness markører (OCT4, SOX2, LIF), transkripsjonsfaktorer (Twist, sneglen), og metastase markører (MMP2, MMP7) i begge cellelinjer ved 24 timer etter bestråling ved en enkelt dose av 8Gy for A549-celler eller 4Gy for MDA-MB-231 celler (figur 2C og 2D).
(A) A549 og MDA-MB-231-celler ble utsatt for IR ved 0-8Gy og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Lysater ble underkastet Western blot-analyse med de merkede antistoffer. To uavhengige eksperimenter oppnådd lignende resultater. (B) A549 og MDA-MB-231 celler ble høstet på 0/3/6/24 timer etter 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231). Lysater ble underkastet Western blot-analyse med de merkede antistoffer. To uavhengige eksperimenter oppnådd lignende resultater. (C), (D) A549 og MDA-MB-231-celler ble utsatt for IR ved 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Deretter ble cellene isolert ved Trizol og utsatt for sanntids-PCR-analyse med de merkede primere. Alle resultater ble oppnådd fra tre uavhengige forsøk (*** P 0,001, ** P 0,01, * p 0,05 versus Ct). Ct, kontrollere cellen; IR, bestrålt celler.
Overuttrykte DLX2 forbedrer EMT og radioresistance
For å undersøke om DLX2 kan oppregulere stråling motstand og metastatisk potensial, A549 og MDA-MB-231 celler ble transient transfektert med pcDNA3-myc vektor uttrykker DLX2 eller pcDNA3-myc kontroll vektor, og vi undersøkte uttrykk for CSC og EMT markører av western blot analyse. Overekspresjon av DLX2 øket ekspresjon av et CSC markør (CD44) og EMT positive markører (N-cadherin, vimentin) og reduserte ekspresjonen av EMT negative markører (E-cadherin, Vinculin) i begge cellelinjer. Bestråling indusert lignende endringer av disse markørene som DLX2 overekspresjon. Men fosforylering av Smad2 /3 ble svakt redusert (A549) eller ikke endret (MDA-MB-231) ved uttrykt DLX2 men økte ved bestråling i begge cellelinjer. Overekspresjon av DLX2 økt uttrykk av Snail i A549, men ikke i MDA-MB-231 celler. Ekspresjonen av β-catenin ble ikke endret ved DLX2 overekspresjon i begge cellelinjer (figur 3A).
(A) Celler ble transfektert med 4 ug pcDNA-myc /DLX2 eller pcDNA-myc og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Etter løsgjøring celle, ble cellene eksponert for IR ved 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Deretter ble cellene lysert, og lysatene ble underkastet Western blot-analyse. To uavhengige eksperimenter oppnådd lignende resultater. (B) Celler ble transfektert med 4 ug pcDNA-myc /DLX2 eller pcDNA-myc og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Etter celle løsgjøring, ble cellene eksponert for IR ved 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 6 timer (A549), 3 h (MDA-MB-231), i transwell ( migrasjon analyse). Fotografiene er representative felt av migrerte celler på membranen. Grafen viser gjennomsnittlig migrert celle nummer fra tre uavhengige eksperimenter ± SE (*** P 0,001 vs. vektorkontrollceller). (C) Cellene ble transfektert med 4 ug pcDNA-myc /DLX2 eller pcDNA-myc og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Etter celle løsgjøring, ble cellene eksponert for IR ved 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 48 timer (A549), 24 timer (MDA-MB-231), i matrigel ( invasjonen assay). Fotografiene er representative felt av invaderte celler på membranen. Grafen viser gjennomsnittlig invadert celle nummer fra tre uavhengige eksperimenter ± SE (*** P 0,001 vs. vektorkontrollcellene)
For å undersøke metastatisk effekt av DLX2 og IR i A549. og MDA-MB-231 celler, migrasjon og invasjon ble utført. DLX2-overexpressed A549 og MDA-MB-231-celler oppviste forbedret migrering evne ved 3 og 4 folder, henholdsvis, sammenlignet med vektor kontroll (figur 3B). Også (, 4Gy for MDA-MB-231 8Gy for A549) økte eksponeringen for IR migrere celle tall med 3,2 folder i begge cellelinjer (figur 3B). Disse resultatene viste at DLX2 overekspresjon og IR betydelig forbedret celle motilitet av A549 og MDA-MB-231-celler. For å undersøke om celle invasjon evne ble tilsvarende forsterket av IR eller DLX2 overekspresjon, A549 og MDA-MB-231 celler ble brukt til invasjonen kamre og antall selvklebende celler ble talt opp. DLX2-overexpressed A549 og MDA-MB-231 celler utstilt forbedret invasiv evne ved 3 og 5.3 folder, henholdsvis (figur 3C). I tillegg er eksponering for IR økt invadere celle tall av A549 og MDA-MB-231 celler ved 2,5 og 3,6 folder, henholdsvis (figur 3C). Disse resultatene viser at overekspresjon av DLX2 eller IR betydelig forbedret trekkfugl og invasiv evne samt uttrykket endringer av CSC og EMT-relaterte gener i A549 og MDA-MB-231 celler.
Vi er fast bestemt neste vidt DLX2 vil gi økt kreftcelle overlevelse etter bestråling. DLX2-overekspresjon A549 og MDA-MB-231 celler ble bestrålt ved henholdsvis 8Gy og 4Gy, og deretter klonogene analysen ble utført. Den overlevende fraksjon av celler transfektert med kontroll-vektoren ble redusert etter bestråling sammenlignet med ikke-bestrålte celler. Men DLX2-overekspresjon celler viste signifikant høyere overlevelse enn vektor transfekterte celler etter bestråling (fig 4a og 4b). I ikke-bestrålte celler, ble kolonidannelse ikke påvirket av DLX2-overekspresjon (figur 4A og 4B). Disse resultatene indikerer at DLX2-overekspresjon i det minste delvis bidrar til radioresistance i A549 og MDA-MB-231-celler.
Celler ble transfektert med 4 ug pcDNA-myc /DLX2 eller pcDNA-myc og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Etter celle løsgjøring, ble cellene eksponert for IR ved 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 7 dager (A549), 10 dager (MDA-MB-231) og celle clonogenicity målte av klonogene assay i A549 (A) og MDA-MB-231 (B). Fotografiene er representative plate av overlevelses celler. Grafen representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± SE (*** P 0,001 vs. IR eksponerte celler).
stanse av DLX2 hemmer IR-indusert EMT og radioresistance
Deretter undersøkte vi om DLX2 lyddemping ville undertrykke metastatisk potensial og radioresistance gitt av IR. A549 og MDA-MB-231cells ble transient transfektert med 50 uM siRNA av DLX2 (Si-DLX2) eller Si-RNA-kontroll (Si-Ct) i 24 timer før bestråling (8Gy for A549, 4Gy for MDA-MB-231) . Deretter analyserte vi uttrykk for CSC og EMT beslektede gener, migrering og invaderende evner, og kolonidannende evne. Stanse av DLX2 av siRNA forhindret EMT som demonstrert av redusert protein nivåer av EMT positive markører (N-cadherin, vimentin) (figur 5A, S3 Fig og S4 Fig) og økt nivå av EMT negative markører (E-cadherin, Vinculin) i bestrålt A549 og MDA-MB-231 celler (figur 5A, S5 fig og S6 fig). Inhibering av DLX2 også hindret induksjon av transkripsjonsfaktorer kritiske for EMT (sneglen og β-catenin), og en CSC markør (CD44) i bestrålt A549 og MDA-MB-231-celler. Interessant, aktivering av TGF-β signale faktor, Smad2 /3, ikke ble påvirket av si-DLX2 i bestrålte celler (figur 5A).
(A) Cellene ble transfektert med 50 mikrometer si-DLX2 eller si- Ct og inkubert ved 37 ° C i 24 timer, ble cellene eksponert for IR ved 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Deretter ble cellene lysert, og lysatene ble underkastet Western blot-analyse. To uavhengige eksperimenter oppnådd lignende resultater. (B) Celler ble transfektert med 50 uM si-DLX2 eller Si-Ct og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Etter celle løsgjøring, ble cellene eksponert for IR ved 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 6 timer (A549), 3 h (MDA-MB-231), i transwell ( migrasjon analyse). Fotografiene er representative felt av migrerte celler på membranen. Grafen viser gjennomsnittlig migrert celle nummer fra tre uavhengige eksperimenter ± SE (*** P 0,001). (C) Cellene ble transfektert med 50 uM si-DLX2 eller Si-Ct og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Etter celle løsgjøring, ble cellene eksponert for IR ved 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 48 timer (A549), 24 timer (MDA-MB-231), i matrigel ( invasjonen assay). Fotografiene er representative felt av invaderte celler på membranen. Grafen viser gjennomsnittlig invadert celle nummer fra tre uavhengige eksperimenter ± SE (*** P 0,001).
For å undersøke anti-metastatisk effekt av si-DLX2 i bestrålte celler, migrasjon og invasjonsanalyser ble utført. DLX2-stanse i MDA-MB-231 celler noe redusert migrasjon evne i forhold til SI-Ct celler. Også i bestrålt A549 og MDA-MB-231 celler, transfeksjon av si-DLX2 redusert trekk celle tall med 1,7 folder i forhold til si-Ct transfeksjon (figur 5B). Disse resultatene viser at stanse av DLX2 ved siRNA signifikant inhiberte celle motilitet av A549 og MDA-MB-231-celler. For å undersøke hvorvidt celle invasjon egenskaper ble på lignende måte redusert med DLX2 stanse, ble bestrålte celler påført på invasjon kammere og antall klebemiddel celler ble tellet. I ikke-bestrålte celler, DLX2-stanse hemmet invasiv evne til A549-celler med 1,4 folder, men ingen signifikant endring ble observert i MDA-MB-231-celler. I bestrålte A549 og MDA-MB-231-celler, transfeksjon av Si-DLX2 redusert invaderende celleantall av A549 og MDA-MB-231-celler med 2,3 og 2,2 folder, respektivt (figur 5C). Resultatene viste at stanse av DLX2 i bestrålt A549 og MDA-MB-231 celler betydelig hemmet uttrykket av gener assosiert med CSC og EMT, og trekkfugl og invasiv evne som ble indusert av IR.
Vi analyserte neste vidt DLX2-stanse påvirker kreft celle overlevelse etter bestråling. A549 og MDA-MB-231-celler transfektert med si-DLX2 eller si-Ct ble bestrålt ved henholdsvis 4Gy og 2Gy, og deretter ble kolonidannelse ble undersøkt. I ikke-bestrålte celler, DLX2 stanse resulterte i en liten reduksjon av overlevende fraksjon i begge cellelinjer. I bestrålte celler, DLX2 lyddemping ledet til en ytterligere reduksjon i celleoverlevelse i betydelig grad (1,5-gangers nedgang for A549 og 1,6-gangers nedgang for MDA-MB-231) (figur 6A og 6B). Disse resultatene indikerte at stanse av DLX2 trykkes IR-indusert EMT potensial og forbedret strålingsfølsomhet.
Cellene ble transfektert med 50 uM si-DLX2 eller Si-Ct og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Etter celle løsgjøring, ble cellene eksponert for IR ved 4Gy (A549) eller 2Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 7 dager (A549), 10 dager (MDA-MB-231) og celle clonogenicity målte av klonogene assay i A549 (A) og MDA-MB-231 (B). Fotografiene er representative plate av overlevelses celler. Grafen representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± SE (*** P 0,001).
IR-indusert DLX2 uttrykk er regulert av Smad2 /3
IR fremmer EMT via Smad-avhengig TGF-β signalisering i cancercellelinjer [6, 27, 28], og DLX2 er et målgen av Smad avhengig TGF-β signalering og negativ tilbakekopling faktor [34]. Derfor undersøkte vi sammenslutning av TGF-β signalering med IR-indusert DLX2 uttrykk. Bestråling av A549-celler (8Gy) og MDA-MB-231cells (4Gy) økte mengden av TGF-β1 utskilt i kulturmediet (figur 7A). Også IR fremmet fosforylering av TGF-β signaleringsfaktor Smad2 /3 (figurene 2A, 2B, 3A, 5A og 7C, S1 og S2 Fig Fig). Men overekspresjon av DLX2 heller litt redusert fosforylering av Smad2 /3 (fig 3A). Fosforyleringen av Smad2 /3 ble ikke påvirket enten ved si-DLX2 i bestrålte A549 og MDA-MB-231 celler (figur 5A). Derfor, ved siden undersøkte vi hvorvidt induksjon av DLX2 ved IR reguleres ved Smad2 /3 signalering. Smad2 /3 lyddemping av siRNA avskaffet IR-indusert DLX2 mRNA uttrykk (Fig 7B) og DLX2 protein uttrykk (Fig 7C og 7D). Disse resultatene indikerer at IR-indusert DLX2 ekspresjon er avhengig av Smad2 /3 signalering.
(A) nivåer av immunoreaktiv TGF-β1 ble kvantifisert fra cellekulturmediet ved hjelp av ELISA, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder (*** P 0,001, ** P 0,01, versus Ct). Ct, kontrollere cellen; IR, bestrålt celler. (B) Celler ble transfektert med 100 uM si-Smad2 /3 eller Si-Ct, inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Deretter ble cellene eksponert for IR ved 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Total RNA ble isolert fra cellene og utsatt for sanntids-PCR-analyse. Grafen representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter ± SE (*** P 0,001). (C) Cellene ble transfektert med 100 uM si-Smad2 /3 eller Si-Ct og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Deretter ble cellene eksponert for IR ved 8Gy (A549) eller 4Gy (MDA-MB-231) og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Deretter ble cellelysatene underkastet Western blot-analyse. Tre uavhengige eksperimenter oppnådd lignende resultater. (D) Proteinnivåene ble kvantifisert ved densitometri. Data er representert som relative verdier til de av Si-Ct etter normalisering med β-aktin (*** P 0,001, ** P 0,01, * P 0,05 versus si-Ct)
Diskusjoner
strålebehandling er en kritisk komponent av kreft ledelse, men noen av overlevende kreftceller få radioresistance [1] og metastatisk evne [2] på gjentatte strålebehandling.
