Abstract
Økende genetiske og molekylærbiologiske bevis tyder på at forstyrrelser i balansen mellom utskilt frizzled-Related Protein-1 ( SFRP1) og β-catenin spiller en viktig rolle i initiering og utvikling av flere krefttyper. Hensikten med denne studien var å undersøke om uttrykket av SFRP1 og β-catenin er assosiert med kliniske-patologiske trekk ved pasienter med prostatakreft (PCA), og å vurdere deres potensielle roller som prediktive og prognostiske biomarkører. I denne studien ble totalt 61 pasienter med PCa og 10 pasienter med benign prostatahyperplasi inkludert, og vi viste at uttrykket av SFRP1 og β-catenin ble korrelert med Gleason score, overlevelse og respons for endokrin behandling av PCa. Overlevelse av PCA pasienter med lav SFRP1 uttrykk (P = 0,016) eller høy β-catenin uttrykk (P = 0.004) var betydelig dårligere. En negativ korrelasjon (r = -0,275, p = 0,032) mellom SFRP1 og β-catenin ble observert av Chi-kvadrat test. Multivariat analyse antydet at SFRP1 (hazard ratio, 0,429, 95% konfidensintervall, 0.227-0.812; P = 0,009) kan tjene som et selvstendig prediktiv og prognostisk faktor for PCa. Vi viste også at protein og mRNA-nivåer av SFRP1 i androgen-avhengige cellelinje PCa LNCaP var betydelig høyere enn de i androgen-uavhengig PCA cellelinjer DU145 og PC3. Imidlertid er proteinnivået β-catenin i LNCaP-celler var signifikant lavere enn det i DU145 og PC3-celler, og ble ikke observert noen signifikant forskjell fra β-catenin mRNA nivå i LNCaP, DU145 og PC3-celler. Bisulfite sekvensering av PCR-analyse viste signifikant lavere metylering nivå av
SFRP1
promoter i LNCaP celler enn at i DU145 og PC3 celler. Samlet utgjør disse funnene tyder på at SFRP1, som uttrykk omvendt korrelerer med at av β-catenin, er en gunstig forutsigbar og prognostisk biomarkør
Citation. Zheng L, Sun D, Vifte W, Zhang Z, Li Q Jiang T (2015) Diagnostisk verdi av SFRP1 som en gunstig Logisk og prognostisk Biomarker i pasienter med prostatakreft. PLoS ONE 10 (2): e0118276. doi: 10,1371 /journal.pone.0118276
Academic Redaktør: Craig N. Robson, Nord Institute for Cancer Research, STORBRITANNIA
mottatt: 02.08.2014; Godkjent: 12 januar 2015; Publisert: 26 februar 2015
Copyright: © 2015 Zheng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd (21272032 til TJ) fra National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov.cn/publish /portal1 /). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er en vanlig ondartet svulst i urinveiene, som er den sjette største årsaken til kreft dødsfall hos menn [1-3], seriøst påvirker pasientens livskvalitet. Familie historie av sykdommen, etnisitet og høy alder er anerkjent som de viktigste faktorene som driver PCA mens detaljert patogenesen av denne sykdommen er fortsatt usikker [4]. For tiden er radikal kirurgisk reseksjon, stråling og endokrin terapi anvendes som behandlinger av PCa [5-8]. Imidlertid er denne sykdommen vanligvis er dødelig for de fleste pasienter diagnostisert i fremskredne stadier. Derfor er det ganske viktig å identifisere verdifulle prediktive og prognostiske biomarkører for tidlig diagnose, og for å avklare patogenesen av PCa.
Wnt proteiner skilles cysteinrike glykosylert og lipid modifiserte proteiner, som spiller nøkkelroller i flere cellulære prosesser, herunder celledifferensiering, spredning, migrasjon, synaptisk aktivitet og embryoutvikling [9-14]. Disse proteinene utøve sine fysiologiske funksjoner gjennom Wnt signalveien. Wnt proteiner som binder til de syv transmembran (7-TM) reseptorene i frizzled familien, og deretter aktivere en kompleks signal kaskade, og til slutt føre til aktivering av nedstrøms målgener, for eksempel
c-myc, c-Jun, fibronektin Hotell og
cyclin D1 product: [15,16]. β-catenin er en viktig del av Wnt signalveien, som endret lokalisering har blitt anerkjent som en markør av Wnt signalveien aktivering [16]. I fravær av Wnt ligand, er cytoplasmatisk β-catenin nedbrutt av den β-catenin ødeleggelse kompleks sammensatt av stillas Axin protein, kasein kinase 1 (CK1), adenomatøs polypose coli (APC) og glykogen syntase kinase 3 (GSK3) gjennom ubiquitin -proteasome veien. Imidlertid, i nærvær av Wnt ligand bindes Wnt ligand til dets reseptor, noe som resulterer i inhibering av β-catenin ødeleggelse kompleks. Deretter ble de ufosforylerte p-catenin molekyler akkumuleres i cytoplasma, hvorav en del går inn i kjernen og utøve sin funksjon som en ko-aktivator av LEF /TCF transkripsjonsfaktorer, og til slutt føre til aktivering av Wnt målgener uttrykk [9]. Foreløpig tyder økende bevis for at dereguleringen av Wnt signalveien er nært forbundet med PCa tumorigenesis hos voksne [17-20].
Utskilt frizzled relaterte protein-1 (SFRP1), også kjent som SARP-2, ble først isolert fra humane osteoblastceller, som tilhører det utskilte glykoproteinet SFRP familien. Det havner to forskjellige strukturelle domener, nemlig netrin domene og CRD domene. CRD domenet er homolog til de frizzled reseptorer [16,21]. Studier viser at SFRP1 er en antagonist av Wnt signalveien, og kan binde seg til wnt proteiner via sin CRD domene i en konkurransedyktig måte med den transmembrane frizzled-reseptoren, som fører til hemming av det Wnt signalveien [22-25]. SFRP1 er nødvendig for prostata utvikling, og utøver sin rolle som et stromal-til-epitelial parakrin modulator av epitelial vekst, forgrening morfogenese, og epitelial genekspresjon [26]. Det er også anerkjent som en kandidat formidler av stromal-til-epitelial signalering ved PCA [27]. Inaktivering av SFRP1 har blitt rapportert på grunn av høy metylering av
SFRP1
genpromoteren i en rekke forskjellige maligniteter, inkludert PCa [28-35]. Dessuten hemmer SFRP1 den transkripsjonelle aktivitet av androgenreseptoren (AR) og spredning av androgen-avhengige LNCaP-celler [36]. Hensikten med denne studien var å undersøke hvilken rolle SFRP1 og β-catenin uttrykk i menneskelig PCa patogenesen.
I denne rapporten, vi viste at det var en negativ sammenheng mellom SFRP1 og β-catenin i menneskelige PCA vev ved å evaluere kliniske-patologiske funksjoner. Multivariat analyse viste at SFRP1 kan fungere som en selvstendig prediktiv og prognostisk faktor for PCa. Protein- og mRNA-nivåer av SFRP1 i androgen-avhengige cellelinje PCa LNCaP var betydelig høyere enn de i androgen-uavhengig PCA cellelinjer DU145 og PC3. Imidlertid er proteinnivået β-catenin i LNCaP-celler var signifikant lavere enn det i DU145 og PC3-celler, og ble ikke observert noen signifikant forskjell fra β-catenin mRNA nivå i LNCaP, DU145 og PC3-celler. Vi viste også at metylering nivået av
SFRP1
arrangøren var betydelig lavere i LNCaP celler enn at i DU145 og PC3 celler. Til sammen våre data antydet at SFRP1 er sannsynlig å være en gunstig prediktiv og prognostisk biomarkør.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien omfatter mennesker deltakere ble godkjent av den etiske komité av Dalian Medical University. Skriftlig samtykke ble innhentet fra alle de menneskelige deltakere. All forskning ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
Cell Kultur og Experiment Reagenser
Menneskelig PCA cellelinjer LNCaP, DU145 og PC3 ble hentet fra cellen bredden av Shanghai grenen av Chinese Academy of Sciences. LNCaP-celler ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, USA), 100 pg /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. DU145-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, USA), 100 pg /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. PC3-celler ble dyrket i DMEM /F12 supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, USA), 100 pg /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Alle celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2.
Kanin monoklonalt anti-SFRP1 (ab126613) og mus monoklonalt anti-β-catenin (ab22656) ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, UK). Mus monoklonalt anti-β-aktin (C4) (sc-47778), geite-anti-mus IgG og geite-anti-kanin-IgG ble oppnådd fra Santa Cruz Biotech (CA, USA). Proteasehemmer Blandingen ble kjøpt fra Roche Applied Science (Basel, Sveits). 5Aza ble oppnådd fra Sigma (Santa Clara, USA). SMARTpool sirnas (Kontroll og β-catenin) med fire individuelle siRNA rettet mot et enkelt gen ble oppnådd fra Thermo (USA).
PCA vevsprøver for immunhistokjemisk analyse
I alt 71 prøver ble innhentet fra First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Liaoning, Kina 2002-2008, inkludert 61 prøver fra pasienter som ble patologisk eller cytologisk verifisert adenokarsinom i prostata og 10 benign prostatahyperplasi prøver. Alle PCA prøver var fra pasienter med alder som spenner 44-84 (gjennomsnittsalder på 72 år). Tumor karakterer ble registrert som Gleason score 7 (34 eksemplarer), og Gleason score≤7 (27 eksemplarer). Ifølge tumor metastaser (TNM) system utviklet av det amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC), alle pasienter deltok i denne undersøkelsen var i T
3 /T
4 /N
X-1 M
0 scenen. Benign prostatahyperplasi prøver ble innhentet fra pasienter for behandling av ikke-tumorsykdommer, med alder som spenner 48-81 (gjennomsnittsalder på 71,8 år). Alle pasientene ble fulgt opp til desember 2013. Overlevelsestiden varierte fra 3 til 60 måneder, med en median tid på 38 måneder. I løpet av denne perioden, 38 pasienter døde på grunn av kreft tilbakefall
Vurderingskriterier av respons for endokrin behandling. (1) Effektiv endokrin behandling. Etter endokrin behandling (medisiner eller kirurgisk kastrasjon), PSA nivå går tilbake til det normale og 2 ng /ml innen tre år. Ingen nye metastatiske lesjoner vises i bein gjennom CT, MR eller ECT skanning; (2) Ineffektiv endokrin behandling. Etter endokrin behandling, betyr PSA-nivå ikke redusere, eller forbigående avtar og deretter øker. Sykdoms forverrer, og nye metastatiske lesjoner vises i bein i to år.
Immunhistokjemisk analyse
Alle prøvene ble analysert ved immunhistokjemi. Prøvene skåret ut ved operasjon ble fiksert i 10% bufret formalin i 24 timer, og deretter ble de fikserte vev innstøpt i parafin. Fire mikrometer deler av de suksessive parafininnstøpte prøver ble kuttet for immunhistokjemisk analyse ved hjelp av en Histostain-Plus-sett (Invitrogen, Camarilo, CA). Alle delene ble deparaffinized med xylen og rehydrert med gradert etanol løsning. H
2o
2 (3%) ble benyttet for å slukke de endogene peroksidaser av prøvene, og deretter ble seksjonene inkubert i blokkeringsserum i 10 minutter ved 37 ° C. Seksjonene ble deretter farget med citratbuffer (pH 6,0) inneholdende enten anti-SFRP1 eller anti-β-catenin ved en fortynning på 1: 100 over natten ved 4 ° C. Snittene ble deretter inkubert med biotinylert geit-anti-kanin-immunoglobulin ved en fortynning på 1: 200 i 10 minutter ved romtemperatur, og deretter inkubert med avidin-biotin peroksidase-komplekset i 10 minutter ved romtemperatur. Til slutt ble seksjonene inkubert med DAB (diaminobenzidin) anvendt som kromogen.
SFRP1-positiv farging tilfeller oppviste klare brungule granuler i cytoplasmaet. β-catenin-positiv farging tilfeller stilt klare brune gule granulat i cytomembrane og kjerne. Scoring av fargingen ble gjort i henhold til følgende kriterier: (1) poeng basert på fargeintensitet. 0, ingen cellefarging; 1, celler med blek gul; 2, celler med blek brun; 3, celler med brun. (2) Scoring basert på prosentandelen av positive celler. Prøvene ble observert under høyt makt forstørrelse (400 ×). 10 tilfeldige felt ble valgt, og 100 celler per felt ble talt opp. 0, 25% cellefarging; 1, 25% -50% cellefarging; 2, 51% ca 75% cellefarging; 3, 75% cellefarging. Til sammen (1) + (2) . 3 ble gjenkjent som positive prøver, mens (1) + (2) ≤3 ble anerkjent som negative prøver
Western Blot analysen
LNCaP, DU145 og PC3-celler behandlet med eller uten 5Aza (DNA-metylering inhibitor) ble høstet og lysert i en kald buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoksykolat, og proteasehemmer blanding). Etter sentrifugering ved 12 000 rpm i 10 min ved 4 ° C, ble prøver av supernatanten underkastet SDS-PAGE. Deretter ble proteinbånd på gelen overført til poly- vinylidenfluorid (PVDF) membran (Millipore), og probet med angitte primært antistoff over natten ved 4 ° C. Deretter ble PVDF-membranen inkubert med de passende sekundære antistoff i 4 timer ved romtemperatur. Resultatene ble analysert ved hjelp av kjemiluminescens deteksjon. Data ble kvantifisert ved å skanne de aktuelle band av interesse og plottet som relativ tetthet av gråtoner. Forsøket ble kopiert tre ganger.
Kvantitativ RT-PCR-analyse
Total RNA fra hver cellelinje (LNCaP, DU145 og PC3) ble ekstrahert ved hjelp RNAiso Plus reagens (Takara, Dalian, Kina) i henhold til produsentens anvisninger. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av en omvendt transkripsjon kit (Takara, Dalian, Kina). Real-time PCR ble utført med LightCycler Real-Time PCR System (Roche Diagnostics, Basel, Sveits). De følgende primere utformet ved Primer Premier 5,0 ble anvendt: 5′-CCCGAGATGCTTAAGTGTGACAA-3 «(sense) og 5′-ACTCGCTGGCACAGAGATGTTC-3» (antisense) for
SFRP1
; 5′-AGAAAAGCGGCTGTTAG-3 «(sense) og 5′-ATACAGGACTTGGGAGGT-3» (antisense) for
β-catenin
; 5′-CAGGTCATCACTATCGGCAA-3 «(sense) og 5′-CAAAGAAAGGGTGTAAAACGC-3» (antisense) for
β-aktin
. Prøvene som inneholdt cDNA, det passende par av primere og maksima SYBR grønn qPCR Master Mix (Thermo) ble underkastet følgende reaksjon: innledende denatureringstrinn på 95 ° C i 10 min; og 40 sykluser av 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 15 s, og 72 ° C i 20 sek. De 2
– △△ CT metoden ble brukt for dataanalyse. De mRNA nivåer av
SFRP1 Hotell og
β-catenin
ble normalisert til
β-aktin
, som serveres som endogen kontroll.
Bisulfite sekvense PCR-analyse (BSP)
DNA fra hver cellelinje (LNCaP, DU145 og PC3) ble hentet ved hjelp av en DNA rensing kit (Tiangen, Beijing, Kina) i henhold til produsentens anbefalinger. Den isolerte DNA ble behandlet med natriumbisulfitt bruker CpGenome Fast DNA Modification Kit (Millipore) i henhold til produsentens anbefalinger. DNA behandlet med natriumbisulfitt ble amplifisert ved en GeneAmp 9600 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De følgende primere utformet ved Primer Premier 5,0 ble anvendt: 5′-GGTTAAGGTAGGAGTATTATTTGAGGT-3 «(sense) og 5′-AACCTAAATCATACTTACAAACCCAT-3» (antisense) for CpG island 1 av
SFRP1
promoter; 5′-TTGTTTTTTAAGGGGTGTTGAGT-3 «(fornuft) og 5′-TACCACAAACTTCCAAAAACCTC-3» (anti) for CpG island 2 av
SFRP1
promoter. De følgende reaksjonsbetingelser ble utført: 10 sykluser med 95 ° C i 5 minutter, 95 ° C i 30 s, 60 ° C-50 ° C i 45 s (som begynner ved 60 ° C for den første syklus, men med temperaturen avtagende etter 1 ° C for hver påfølgende syklus), og 72 ° C i 45 s; 33 sykluser med 95 ° C i 30 s, 50 ° C i 45 s, og 72 ° C i 45 s; og 60 ° C i 30 min. PCR-produktene ble renset ved hjelp av en DNA rensing kit (Tiangen, Beijing, Kina), og ble klonet i PMD-19T vektor (Takara, 6013). Etter transformasjon ble 10 positive kloner av hverandre BSP prøve valgt for sekvensering ved hjelp av en 3730xl DNA analysator (Applied Biosystems).
Statistical Analysis
En Chi-square (
χ
2) test ble brukt til å klargjøre sammenhengen mellom SFRP1 og β-catenin uttrykk og klinisk-patologiske trekk i PCA vev fra 71 pasienter. Pasient overlevelse ble analysert av Kaplan-Meier metoden. Spearman rank korrelasjon ble utført for å evaluere forholdet mellom SFRP1 og β-catenin uttrykk. Data ble uttrykt som betyr ± SDS. Forskjeller mellom gjennomsnittsverdiene ble analysert ved ANOVA etterfulgt av flere forhold Student-Neuman-Keuls tester og bi-variant forhold analyser. Statistisk signifikans ble ansett på
P
. 0,05 nivå
Resultater
Den uttrykk for SFRP1 og β-catenin er assosiert med klinisk-patologiske trekk ved menneskelig PCa
Aberrant ekspresjon av SFRP1 og β-catenin spiller en viktig rolle i utviklingen av en rekke krefttyper, så som galleveiene kreft, mucoepidermoid karsinom, binyrebark tumorer og kreft i livmorhalsen [16,37-39]. Imidlertid har rollen som SFRP1 og β-catenin ved PCA ikke klarlagt. For å undersøke sine roller i PCA vi undersøkt om uttrykket av SFRP1 og β-catenin korrelert med kliniske-patologiske trekk blant de 61 PCA prøver med
χ
2 test. Ble ikke observert statistisk signifikante forskjeller i Gleason score, overlevelse og respons for endokrin behandling ved de to proteinene, mens ingen statistisk signifikant forskjell ble observert i alder, metastase før operasjonen og PSA-nivå (tabell 1). Samlet utgjør disse resultatene antydet at uttrykket SFRP1 og β-catenin korrelert med Gleason score, overlevelse og respons for endokrin behandling av PCA pasienter, mens ikke korrelerer med alder, metastase før operasjonen og PSA-nivå.
effekten av SFRP1 uttrykk på overlevelse i PCA pasienter
for ytterligere å bestemme forholdet mellom SFRP1 /β-catenin uttrykk og total overlevelse i PCA ble overlevelseskurver trukket av Kaplan-Meier metode. Resultatene viste at SFRP1-negative pasienter viste en signifikant dårligere total overlevelsesrate enn SFRP1-positive pasienter (P = 0,016, Fig. 1a). I motsetning til dette, β-catenin-positive pasienter viste en signifikant dårligere total overlevelse enn p-catenin-negative pasienter (P = 0,004, fig. 1B). Disse resultatene antydet at negative SFRP1 uttrykk og positiv β-catenin uttrykk alvorlig påvirket den totale overlevelsen av pasienter med PCa.
A, Forholdet SFRP1 uttrykk med total overlevelse hos pasienter med PCa (P = 0,016). B, Forholdet mellom β-catenin uttrykk med total overlevelse hos pasienter med PCa (P = 0,004).
For å vurdere bidraget av klinisk-patologiske funksjoner som potensielle prediktive og prognostiske biomarkører, analyserte vi 6 klinisk-patologiske variablene i de 61 PCA pasienter ved multivariat analyse. Som vist i tabell 2, kun SFRP1 ekspresjon var statistisk signifikant faktor (P = 0,009), og kan bli identifisert som en uavhengig prediktiv og prognostisk indikator for å angi at SFRP1 uttrykk kan tjene som den beste prediktiv og prognostisk biomarkør av overlevelse i PCa blandt disse variablene.
den uttrykk for SFRP1 og β-catenin er negativt korrelert ved PCA
for å bestemme sammenhengen mellom SFRP1 /β-catenin uttrykk og forekomst av PCA protein uttrykk av SFRP1 og β-catenin i benign prostatahyperplasi og prostata tumorprøver ble sammenlignet ved immunhistokjemi (fig. 2). Totalt 71 vevsprøver (10 benign prostatahyperplasi hyperpslasia og 61 prostatakreft) ble analysert. I henhold til vurdering kriterier, 8 (80%) av de 10 benign prostatahyperplasi prøver ble klassifisert som positive for SFRP1 ekspresjon og 2 (20%) ble klassifisert som negative, mens det i tumorprøver, SFRP1 ekspresjon betydelig redusert med 36 (59% ) positive og 25 (41%) negativ. I motsetning til dette, i benign prostatahyperplasi prøvene, ble 9 (90%) klassifisert som negative for β-catenin ekspresjon og 1 (10%) ble klassifisert som positivt uttrykk, mens β-catenin ekspresjon betydelig øket med 29 (47,5%) positive og 32 (52,5%) negative i tumorprøver (tabell 3). For å bevise spesifisiteten av β-catenin antistoff, ble siRNA knockdown eksperiment utført ved hjelp av PC3 celler. Den endogene β-catenin uttrykk ble redusert med 86% i PC3 celler transfektert med siβ-catenin basseng sammenlignet med PC3 celler transfektert med siControl (S1 fig). Resultatene indikerte at SFRP1 uttrykket ble redusert, mens β-catenin uttrykk ble økt ved PCA.
A, Representative resultater viser immunhistokjemisk farging av SFRP1 og β-catenin i en del av menneske benign prostatahyperplasi vev. I venstre panel, piler viser at lokalisering av SFRP1 jevnt fordelt i cytoplasma. I panelet til høyre, piler viser at lokalisering av β-catenin var hovedsakelig cellemembranen. B, Den immunhistokjemisk farging av SFRP1 og β-catenin i en seksjon av humane prostata kreftvev (SFRP1 negativ og β-catenin positiv). I panelet til høyre, piler viser at β-catenin hovedsakelig lokalisert i både cytoplasma og cellekjernen. C, Den immunhistokjemisk farging av SFRP1 og β-catenin i en seksjon av humane prostata kreftvev (SFRP1 positiv og β-catenin negativ). I venstre panel, piler viser at lokalisering av SFRP1 var hovedsakelig i cytoplasma.
For å undersøke forholdet mellom SFRP1 og β-catenin i PCA vev, protein nivåer av SFRP1 og β-catenin i prostata tumorprøver ble analysert ved chi-kvadrat tester. Ifølge våre vurdering kriterier, ble 36 prøver identifisert som SFRP1-positive uttrykk, og 25 ble identifisert som SFRP1-negative uttrykk i de 61 PCA prøvene. 23 (63,9%) av SFRP1-positive prøvene viste negativ β-catenin ekspresjon, mens bare 9 prøver (36%) viste negativ β-catenin ekspresjon i SFRP1-negative prøver (Tabell 4). Resultatene viste at det var en negativ sammenheng mellom SFRP1 og β-catenin ved PCA (r = -0,275, p = 0,032).
For å bestemme endringen av SFRP1 og β-catenin uttrykk i ytterligere PCA forskjellige cellelinjer, protein og mRNA-nivåer av SFRP1 og β-catenin i LNCaP, DU145 og PC3-celler behandlet med eller uten 5Aza ble undersøkt. Blant dem er LNCaP en androgen-avhengig human prostatacancercellelinje, mens DU145 og PC3 er androgen-uavhengige humane prostatacancercellelinjer, som er mer svært maligne enn LNCaP-celler. Med ondartet grad økt gradvis, protein og mRNA nivåer av SFRP1 i PCA celler behandlet uten 5Aza betydelig redusert, mens både protein og mRNA nivåer av SFRP1 var oppregulert i PCA celler behandlet med 5Aza (figur 3A . 3B) . Imidlertid er proteinnivået β-catenin signifikant økning i PCA-celler behandlet uten 5Aza, og er nedregulert i PCA-celler behandlet med 5Aza (Fig. 3C). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell fra β-catenin mRNA nivå i LNCaP, DU145 og PC3-celler (Fig. 3D). Samlet utgjør disse resultatene bekreftet at det var en invers korrelasjon mellom SFRP1 og β-catenin uttrykk i PCA cellelinjer, som er konsistent med data innhentet fra tumor vevsprøver.
a, LNCaP, DU145 og PC3 celler behandlet med eller uten 5Aza ble oppsamlet og deretter underkastet Western blot-analyse med anti-SFRP1 antistoff. B, LNCaP, DU145 og PC3-celler behandlet med eller uten 5Aza ble oppsamlet og deretter underkastet kvantitativ RT-PCR-analyse.
SFRP1
mRNA nivå av LNCaP-celler ble satt til 1. C, LNCaP, DU145 og PC3-celler behandlet med eller uten 5Aza ble oppsamlet og deretter underkastet Western blot-analyse med anti-β-catenin antistoff. D, LNCaP, DU145 og PC3-celler behandlet med eller uten 5Aza ble oppsamlet og deretter underkastet kvantitativ RT-PCR-analyse.
β-catenin
mRNA nivå av LNCaP-celler ble satt til 1. Alle forsøk ble gjentatt minst tre ganger. Data som vises i grafene er gjennomsnitt ± sikkerhetsdatablad av tre forsøk. *,
P
0,05. ns, ikke signifikant. Full-lengde blot på fig. 3A er presentert i S2 Fig.
Endringene av
SFRP-en
genet metylering i PCA cellelinjer
metylering av
SFRP1
genpromoteren er blitt rapportert å føre til nedregulering av SFRP1 protein og mRNA-nivåer, og å spille viktige roller i initiering og utvikling av svulster. Gitt at protein og mRNA-nivåer av SFRP1 betydelig redusert med økende grad av malignitet, og 5Aza, en DNA-metylering inhibitor, oppregulert både protein og mRNA nivåer av SFRP1 i PCA cellelinjer, vi spekulert i at SFRP1 lyddemping var sannsynlig å bli indusert av
SFRP1
genet metylering. For å undersøke denne muligheten, metylering av
SFRP1
genet promoter i LNCaP, DU145 og PC3 celler behandlet med eller uten 5Aza ble undersøkt av BSP analysen. Metylering oppstår vanligvis i CpG-rike promoter regioner, heter CpG øy med øya size 100, GC% 50, Obs /Exp 0,6. Bioinformatikk analyse viste at 2 CpG øyer kan bli metylert i
SFRP1
genet promoter (fig. 4A, blå-farget regioner). BSP analysen viste at begge CpG øyer i
SFRP-en
promoter ble metylert i LNCaP, DU145 og PC3 celler. Metyleringen forekomst av CpG øyer 1 og 2 i LNCaP-celler behandlet uten 5Aza var henholdsvis 32,5% og 2,7%, mens begge de metylering prisene falt til 9,3% og 1,1% etter 5Aza behandling (Fig. 4B). I DU145 cellene, metylering priser av CpG øyer 1 og 2 er redusert fra 36,7% og 85,6% til 12,6% og 47,9%, henholdsvis etter 5Aza behandling (fig. 4C). I PC3 celler, både av metylering prisene gått ned fra 85% og 71% til 38,3% og 44,1% etter 5Aza behandling (fig. 4D). Disse resultatene stemmer overens med dataene oppnådd fra Western blot-analyse (figur 3A sample-. 3B), noe som tyder på at nedregulering av protein og mRNA-nivåer av SFRP1 ble indusert ved
SFRP1
gen metylering med økende grad av malignitet av PCA cellelinjer
a, skjema over SFRP-en promoter region (blå-farget regioner: CpG øyer).. CpG island 1 var fra 1454 bp til 1613 bp. CpG island to var fra 1831 bp til 2257 bp. B-D, metylering av CpG island 1 (venstre panel) og CpG island 2 (høyre panel) i LNCaP, DU145 og PC3 cellene henholdsvis behandles med eller uten 5Aza. Hver sirkel representerer en metylert (svart) eller unmethylated (hvit) CpG dinucleotide. Hver rad representerer en annen klone.
Diskusjoner
PCa er den vanligste diagnosen non-hudkreft hos menn med økt forekomst hvert år [40-42]. De patologiske trekk ved PCa er uhyre kompleks [43]. Svulster hos mange pasienter med PCa er i en lat form, som ikke har noen virkning på overlevelsen av pasienter og er ofte holdes under overvåking i stedet for øyeblikkelig behandling, mens en liten andel av tumorer hører til raskt fremover ondartede svulster, noe som alvorlig true liv av pasienter [44,45]. I tillegg, på grunn av fysiologiske og anatomiske trekk ved PCa, er det vanskelig å observere åpen tidlige symptomer hos pasienter, som fører til et stort antall pasienter diagnostisert på et avansert stadium [46]. Derfor er det viktig å forbedre tidlig diagnose for PCa gjennom å identifisere forutsigende og prognostiske biomarkører. I denne studien viste vi at Wnt antagonist SFRP1 var en gunstig prediktiv og prognostisk biomarkør og dens ekspresjon ble inverst korrelert med β-catenin ekspresjon.
Wnt signalveien spiller en viktig rolle i en rekke cellulære prosesser, såsom celledifferensiering, spredning, og migrasjon, og dens deregulering korrelerer med flere sykdommer, inkludert kreft [47]. Wnt /β-catenin signalveien er unormalt aktivert i et bredt spekter av humane ondartede sykdommer [48-54]. Denne avvikende aktivering bidrar til tumorigenesis med opp-regulerer uttrykket av ulike nedstrøms målgener, for eksempel
MDR-1, Livin, cyclin D1 Hotell og
c-myc product: [15,55]. β-catenin er en sentral komponent av Wnt signalveien, og det endret lokalisering er anerkjent som en markør for sti aktivering. Dataene fra immunhistokjemisk farging viste at β-catenin lokalisering i humane benign prostatahyperplasi prøver ble hovedsakelig lokalisert til cellemembran med lav protein ekspresjonsnivåer (panel 2A høyre.); imidlertid, i humane PCA prøver, β-catenin hovedsakelig lokalisert i cytoplasma og cellekjernen med høyere protein uttrykk mengde sammenlignet med den i benign prostatahyperplasi prøver (panel Fig. 2B til høyre). Det har blitt rapportert at β-catenin interagerer med AR og forbedrer androgen-stimulert transkripsjonen aktivitet av AR, noe som tyder på at rollen til β-catenin i prostata karsinogenese ikke kan være begrenset til transkripsjonen aktivering av TCF /LEF [56]. I denne studien viste vi at β-catenin ekspresjon var positiv i 47,5% av PCA-prøvene, mens bare 10% (1/10) positiv ekspresjon ble observert i benign prostatahyperplasi prøver (tabell 2). Den positive uttrykk for β-catenin ved PCA ble også signifikant korrelert med Gleason score, overlevelse og respons for endokrin behandling (tabell 1). Vi viste at PCA pasienter med positiv β-catenin uttrykk hatt en vesentlig dårligere total overlevelsesrate (Fig. 1B). Videre er ekspresjon av β-catenin signifikant oppregulert med økende grad av malignitet (Fig. 3C). Disse resultatene tyder på at ekspresjon av β-catenin er nært knyttet til dårligere prognose, og det avvikende aktivering av Wnt signalveien bidrar til utvikling av PCa.
SFRP1 utøver sin funksjon i det Wnt signalveien som en velkjent antagonist av frizzled reseptoren, og har blitt foreslått å være en tumor suppressor på flere humane krefttyper [57,58]. Dataene fra immunhistokjemisk farging viste at lokaliseringen av SFRP1 jevnt fordelt i cytoplasma (fig. 2A venstre panel), i samsvar med dets ekspresjon i flere andre vev [34,59]. Imidlertid er SFRP1 lokalisering hovedsakelig cytoplasma perinukleær i galleveier og blære kreft [16,60]. Forskjellen i fordelingen av SFRP1 kan skyldes vev-spesifikk ekspresjon.
