Abstract
leverkreft (HCC) er den nest vanligste årsaken til kreftdødelighet i verden. De fleste tilfeller av HCC er forbundet med cirrhose i forbindelse med kronisk hepatitt B-virus eller hepatitt C virus infeksjoner. Hypermethylation av promoter regioner er hoved epigenetisk mekanisme genet Slå og har vært involvert i HCC utvikling. Målet med denne studien var å finne ut om avvik metylering av
RASSF1A Hotell og
DOK1
genet arrangører er assosiert med progresjon av leversykdom hos brasilianske pasienter. Metylering nivåene ble målt ved pyrosekvensering i 41 (20 HCC, 9 cirrhose, og 12 ikke-cirrhose) prøver levervev. Mean priser av metylering i
RASSF1A Hotell og
DOK1
var 16,2% og 12,0% i ikke-cirrhose, 26,1% og 19,6% i cirrhose, og 59,1% og 56,0% i HCC vev, henholdsvis viser en gradvis økning i henhold til progresjon av sykdommen, med betydelig høyere nivåer i tumorvev. I tillegg hypermethylation av
RASSF1A Hotell og
DOK1
ble funnet i de aller fleste (88%) av de HCC tilfeller. Interessant,
DOK1
metylering nivåer i HCC prøvene var signifikant høyere i gruppen av yngre ( 40 år) pasienter, og høyere i moderat differensiert enn i dårlig differensierte tumorer (
p
0,05). Våre resultater forsterke hypotesen om at hypermethylation av
RASSF1A Hotell og
DOK1
bidrar til hepatocarcinogenesis og er knyttet til clinicopathological egenskaper.
RASSF1A Hotell og
DOK1
promoter hypermethylation kan være en verdifull biomarkør for tidlig diagnose av HCC og en potensiell molekylære mål for epigenetisk basert terapi
Citation. Araújo OC, Rosa AS, Fernandes A, Niel C, Villela-Nogueira CA, Pannain V, et al. (2016)
RASSF1A Hotell og
DOK1
Arrangøren metylering Levels i leverkreft, cirrhose og ikke-levercirrhose, og korrelasjon med leverkreft i brasilianske pasienter. PLoS ONE 11 (4): e0153796. doi: 10,1371 /journal.pone.0153796
Redaktør: Isabelle A. Chemin, CrCl-INSERM, FRANCE
mottatt: 11 februar 2016; Godkjent: 04.04.2016; Publisert: 14 april 2016
Copyright: © 2016 Araújo et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (https://cnpq.br/), gi nummer 444071 /2014-8, til NMA, og Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (https://www.faperj.br/), gi nummer E-26 /111,528 /2013, til NMA. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Leverkreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødelighet, med anslagsvis 700.000 dødsfall hvert år over hele verden [1]. Leverkreft (HCC) er langt den vanligste typen primær leverkreft og en av de få kreft med godt definerte viktige risikofaktorer. Omtrent 80% av alle HCC tilfeller er forbundet med kronisk hepatitt B-virus (HBV) eller hepatitt C-virus (HCV) infeksjoner [2], selv om kronisk alkoholisme og alkoholisk steatohepatitis (NASH) er også viktige årsaker [3, 4]. Disse risikofaktorene indusere kronisk leverskade som ofte fører til skrumplever, som er til stede på 80-90% av pasienter med HCC [4, 5]. Siden HCC Prognosen avhenger av stadium ved diagnose, lavere overlevelse har blitt observert blant pasienter ved avansert stadium [6], fremhever viktigheten av å identifisere biomarkører for leverkreft påvisning tidlig og terapeutiske intervensjoner.
molekylære mekanismene bak hepatocarcinogenesis fortsatt uklare. I likhet med andre tumorer, utvikling og progresjon av HCC skyldes en flertrinnsprosess som består av opphopning av genetiske og epigenetiske endringer i regulatoriske gener, noe som fører til aktivering av forskjellige onkogener og inaktivering av tumorsuppressorgener. Hypermethylation av promotor CpG-øyer er et epigenetisk mekanisme av genet Slå involvert i et bredt spekter av humane kreftformer, inkludert HCC [7, 8]. Avvikende DNA metylering er også vist i premaligne tilstander som dysplastiske knuter eller levercirrhose [9-11], noe som tyder på at det er en tidlig hendelse i hepatocarcinogenesis og en verdifull markør for risikovurdering. Ras krets domene familie 1A (
RASSF1A
) og nedstrøms av tyrosinkinaser 1 (
DOK1
) er tumorsuppressorgener ofte dempet gjennom epigenetisk mekanisme i en rekke humane maligniteter [12, 13] . Avvikende metylering av disse genene er blitt foreslått å spille en viktig rolle i den maligne transformasjon av hepatocytter [10, 14]. Spesielt hypermethylation av disse genene i HCC har blitt rapportert å vise geografiske variasjoner, noe som tyder på at etnisitet kan påvirke DNA metylering nivåer [10].
brasilianske folket er et resultat av en intens blanding mellom europeiske kolonistene eller innvandrere, afrikansk slaver, og innfødte indianerne. I Brasil ble nesten 9000 dødsfall tilskrives HCC i 2013 [15], og kronisk HCV-infeksjon er den viktigste risikofaktoren, og står for mer enn 50% av tilfellene [16]. Så vidt vi vet, har ingen rapport er publisert så langt på de epigenetiske faktorer knyttet til HCC i Brasil.
I denne studien har vi utført en kvantitativ DNA metylering analyse av pyrosekvensering i brasilianske pasienter ved HCC, cirrhose, og ikke -cirrhotic etapper, og vurdert forholdet mellom metylering nivåer og clinicopathological egenskaper, med sikte på å undersøke relevansen av hypermethylation av
RASSF1A Hotell og
DOK1
som en molekylær markør for HCC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
studien protokollen ble godkjent av forskningsetiske komité for Clementino Fraga Filho universitetssykehus (godkjenningsnummer 139/10) og utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen deklarasjonen~~POS=HEADCOMP. På grunn av den retrospektive natur studien, konkluderte etikkomiteen at ingen skriftlig informert samtykke var nødvendig fra pasientene.
Pasienter og vevsprøver
Arkiverte formalinfiksert parafin-embedded vevsblokker var fås ved Avdeling for patologi av Clementino Fraga Filho universitetssykehus, Rio de Janeiro, Brasil. Leverprøver fra 20 pasienter med HCC, fire med cirrhose uten HCC, og 12 med kronisk hepatitt (non-cirrhose) ble analysert (tabell 1). I tillegg ble det omgivende vev cirrhose analysert for fem HCC pasienter (totalt = 41 prøver). Histologisk analyse viste egenskaper som er kompatible med kronisk hepatitt (betennelse med eller uten fibrose) i alle ikke-cirrhose leveren vev. HCC og prøvene cirrhose vev ble oppnådd fra lever eksplantasjoner eller kirurgisk reseksjon, mens vev fra pasienter med kronisk hepatitt ble oppnådd ved perkutan leverbiopsi. Alle HCC pasienter inkludert i denne studien hadde cirrhose lever.
Demografiske og clinicopathological data ble hentet fra pasientjournaler for å evaluere foreningen av alder, kjønn, histologi, og HBV og HCV infeksjoner med DNA metylering . Det virale status av pasientene ble etablert som følger: HBV-infeksjon, HBsAg positivt; HCV-infeksjon, anti-HCV og HCV-RNA positiv; ingen virus, HBsAg, anti-HCV og HCV-RNA negative.
Gjennomsnittsalderen til pasientene var 57 (spredning i alderen 19-78) år, med 47% av dem i alderen ≥ 60 år. Tjueseks (72%) av pasientene var menn. HCV-infeksjon var den viktigste etiologisk faktor på leversykdom (56% av tilfellene), etterfulgt av HBV (19%). Fjorten (70%) HCC pasienter hadde en moderat differensiert tumor, og ti (50%) hadde en svulst størrelse . 5 cm (tabell 1)
DNA og natriumbisulfitt konvertering
fem seksjoner på 10 um ble skåret fra hver blokk, deparaffinized i 1 ml absolutt xylen, og rehydratisert i 1 ml 96% etanol. Genomisk DNA ekstraksjon ble utført ved hjelp av QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA), i henhold til produsentens protokoll. Omtrent 500 ng av genomisk DNA ble utsatt for bisulfite modifikasjon behandling for å konvertere alle unmethylated cytosines til thymines. Dette ble utført ved hjelp av EZ DNA Metylering-Lightning Kit (Zymo Research, Irvine, CA). Den modifiserte DNA ble lagret ved -20 ° C for videre analyse.
DNA metylering analyse av pyrosekvensering
DNA metylering nivåer av
RASSF1A Hotell og
DOK1
promoter-regioner ble målt ved hjelp av den meget følsomme pyrosekvensering teknologi (PyroMark Q96 ID, Qiagen) ved flere CpG-områder. Bisulfitt-behandlede DNA ble PCR-amplifisert i et volum på 50 ul reaksjon som inneholdt 1U av platina Taq DNA-polymerase, High Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 0,2 uM av hver oligonukleotid-primer [10], under de følgende betingelser: 94 ° C i 30 sekunder; 35 sykluser ved 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, og 68 ° C i 1 minutt, etterfulgt av en avsluttende forlengelsestrinn ved 68 ° C i 7 min. Ti mikroliter av PCR-produktet ble analysert på agarosegel ved elektroforese. De resterende 40 ul biotinylert PCR-produktet ble fanget på streptavidin-belagte kuler (GE Healthcare, Milwaukee, WI) og pyrosekvensering reaksjonen ble satt opp ved hjelp av PyroMark Gold Q96 kit (Qiagen), i henhold til produsentens instruksjoner. Settet av sekvenseringsprimere er tidligere blitt utviklet [10]. Prosentene av metylering ble målt ved seks og fem CpG områder i
RASSF1A
og
DOK1
arrangører, henholdsvis, og uttrykt som gjennomsnittet for alle CPGs analysert på et gitt gen. For å vurdere DNA hypermethylation frekvenser i HCC og cirrhose prøver, cut-off verdier for
RASSF1A Hotell og
DOK1
ble hentet fra quantile representerer øvre 95% av metylering nivåer i ikke-cirrhose prøver, som tidligere definert, [10]. Derfor ble de frekvenser av DNA hypermethylation representert som prosentandelen av HCC og cirrhose prøver med metylering nivåer over cut-off-verdien for hvert gen.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser ble utført ved anvendelse av SPSS 20,0 programvare (IBM, Armonk, New York). Den Kruskal-Wallis test (eller Mann-Whitney U-test, når dette er hensiktsmessig) ble anvendt for å sammenligne metylering nivåer i HCC, cirrhose, og ikke-cirrhose leverprøver, samt for å teste forbindelser mellom metylering nivåer og clinicopathological egenskaper. Type 1-feil ble justert for multiple sammenligninger. Forskjeller ble ansett som statistisk signifikant for
p
verdier mindre enn 0,05.
Resultater
DNA metylering nivåer i ikke-cirrhose, cirrhose og HCC vevsprøver
pyrosekvensering analyse ble vellykket utført i 41 (20 HCC, 9 cirrhose og 12 ikke-cirrhose) og 31 (17 HCC, 7 cirrhose og 7 ikke-cirrhose) prøver for
RASSF1A Hotell og
DOK1
, respektivt. Resultatene av den kvantitative analyse av DNA-metylering, uttrykt som den gjennomsnittlige prosentandelen av alle CPGs analysert på et gitt gen, er vist i figur 1. Totalt, metylering nivåene var lavere i ikke-cirrhose, moderat i cirrhose, og høyere i HCC vev for begge genene. Mean priser av metylering i
RASSF1A Hotell og
DOK1
var som følger: 16,2% og 12,0% i ikke-cirrhose, 26,1% og 19,6% i cirrhose, og 59,1% og 56,0% i HCC vev, henholdsvis (tabell 2). ble påvist noen statistisk forskjell i metylering nivåer mellom cirrhose og ikke-cirrhose vev (
RASSF1A
,
p
= 0,165;
DOK1
,
p
= 1.000). Imidlertid ble det observert en svært signifikant forskjell av metylering nivåer mellom HCC HCC og ikke-vev for begge gener (tabell 2). Metylering nivåer i cirrhotiske vev fra pasienter uten HCC og tilstøtende cirrhosepasienter vev fra pasienter med HCC ble også sammenlignet. Forskjellene mellom disse to gruppene var ikke statistisk signifikant (
RASSF1A
,
p
= 0,652;
DOK1
,
p
= 0,231). En korrelasjon på
DOK1
metylering nivåer ble observert mellom HCC- og cirrhose paret prøver, med HCC /cirrhose sammenkoblet vev viser samtidig de høyeste eller laveste nivåene av metylering. Men en slik korrelasjon ble ikke observert for
RASSF1A
metylering (data ikke vist).
metylering nivåene ble målt ved hjelp av pyrosekvensering ved forskjellige steder CpG og uttrykt som gjennomsnittlig prosent av alle CPGs analysert ved et gitt gen. Statistisk signifikans for DNA metylering nivå i ikke-cirrhose og cirrhose vev ble beregnet ved sammenligning med HCC prøver.
DNA metylering status og clinicopathological parametere
De assosiasjoner mellom clinicopathological egenskaper (alder , kjønn og histologi) og risikofaktorer (HBV og HCV infeksjoner) på den ene siden, og metylering nivåer i HCC vev på den annen side, er vist i Tabell 3. Totalt
RASSF1A Hotell og
DOK1
utstilt lignende metylering mønstre i henhold til de analyserte parametrene. Vi fant en statistisk signifikant forskjell i
DOK1
metylering nivåer fra en aldersgruppe til en annen (
p
= 0,036), med høyere metylering nivåer i gruppen av yngre ( 40 år) pasienter . I tillegg betydelig høyere nivåer (
p
= 0,005) av
DOK1
metylering ble observert i moderat differentiated- enn i dårlig differensiert HCCs. Selv
RASSF1A Hotell og
DOK1
metylering nivåene var høyere hos kvinner og hos HBV positive tumorer, ingen statistisk forskjell kunne observeres. Også ingen sammenheng ble funnet mellom tumor størrelse og metylering nivåer (Tabell 3).
DNA hypermethylation frekvenser i cirrhose og HCC vev
Analyse av DNA hypermethylation frekvenser avslørte at
RASSF1A Hotell og
DOK1
gener ble hypermethylated i de aller fleste (15/17, 88%) av HCC vev (tabell 4). Dessuten ble den samtidige hypermethylation av begge gener påvist i 14/17 (82%) HCC vev. Imidlertid ble lavere frekvens av hypermethylation observert blant cirrhosepasienter vev (2/7, 29% i
RASSF1A
, 3/7, 43%
DOK1
, og 2/7, 29% både gener ). Med hensyn til viral status, alle HBV positive HCCs viste hypermethylation i
DOK1
. Samtidig hypermethylation av disse genene ble hyppigere observert i HBV (3/4, 75%) og HCV (8/9, 89%) positive tumorer enn HBV og HCV negative (1/2, 50%). På lignende måte ble samtidig hypermethylation detektert i 2/3 (67%) HCV-positive cirrhose vev, men i ingen (0/4) av HCV negative (tabell 4). Frekvenser av hypermethylation var lik mellom cirrhosepasienter vev fra pasienter uten HCC og tilstøtende cirrhosepasienter vev fra pasienter med HCC (data ikke vist).
Diskusjoner
I denne studien har vi analysert kvantitativt metylering profilen til
RASSF1A Hotell og
DOK1
promoter gener i ikke-cirrhose og cirrhose lever uten HCC, samt i HCC og cirrhose paret prøver. Begge gener har tumorsuppressorgener egenskaper og er involvert i flere viktige cellulære prosesser.
RASSF1A
er innblandet i Ras signalveien, som spiller en sentral rolle i cellesykluskontroll, microtubule stabilisering, cellular heft, cellemotilitet, og apoptose [17].
DOK1
er uttrykt i B- og T-celler så vel som i myeloide celler (makrofager og neutrofiler), og er involvert i et bredt spekter av immunoreceptor signalveier [18]. Heri,
RASSF1A Hotell og
DOK1
metylering nivåer viste en gradvis økning i henhold til progresjon av sykdommen, med betydelig høyere nivåer i tumorvev. I tillegg har vi observert svært høy forekomst av
RASSF1A product: (88%) og
DOK1 product: (88%) hypermethylation i HCC prøver, med en samtidig hypermethylation på 82%. Tidligere studier ved bruk av forskjellige metoder, så vel som forskjellige sett av CPGs, har også funnet høye (76-100%) frekvenser på
RASSF1A
hypermethylation i HCC [10, 19-21]. På den annen side, noen data er tilgjengelige på metylering profilen til
DOK1
i leverkreft. En studie rapportert forekomst av hypermethylation i majoriteten (62%) av HCC vev [10]. Våre resultater og dermed forsterke hypotesen om en sammenheng mellom epigenetisk stanse av disse viktige cellulære gener og hepatocarcinogenesis. Av notatet, vi fant samtidig
RASSF1A Hotell og
DOK1
hypermethylation i nesten 30% av cirrhose vev analysert. Aberrant metylering ble funnet ikke bare i cirrhose prøver av pasienter med HCC, men også i de uten HCC, noe som tyder på at økningen av metylering nivåer i en undergruppe av pasienter med cirrhose vev på grunn av tilstedeværelsen av noen tumorceller er usannsynlig. Disse funnene er i tråd med forestillingen om at avvikende metylering i ikke-transform hepatocytter kan gå forut for sin onkogene transformasjon og fremme utviklingen av leverkreft.
Den potensielle påvirkning av etnisitet i DNA metylering har ikke blitt grundig undersøkt. Imidlertid har tidligere rapporter beskrevet signifikante forskjeller i global genomisk DNA metylering i henhold til etnisitet [22, 23]. Det har blitt foreslått at noen genetiske polymorfismer, slik som de av folat enzymer, kan bidra til den etniske forskjeller i DNA-metylering [24]. Lambert et al. [10] har vist en sammenheng mellom metylering nivåer i flere gener og geografisk område, med HCCs stille
RASSF1A Hotell og
DOK1
metylering nivåer lavere i Thailand enn i Frankrike. Vår studie støttet seg på et sett av CPGs analysert tidligere, og målt DNA metylering nivåer av kvantitativ pyrosekvensering metodikk [10]. Interessant, vi observerte høyere
RASSF1A Hotell og
DOK1
metylering nivåer i brasilianske HCC prøvene sammenlignet med de fra Thailand (2,7 og 3,1 ganger) og Frankrike (1,9 og 1,8 ganger), henholdsvis. Disse resultatene underbygge forestillingen om at genetiske og /eller miljømessige faktorer kan bidra til de etniske /geografiske forskjeller i DNA metylering blant HCC tilfeller.
Flere studier har undersøkt mulige sammenhenger mellom risikofaktorer (HBV og HCV-infeksjoner) eller klinisk funksjoner (alder, kjønn, og histologi) og DNA metylering i HCC [9, 10, 19-21, 25]. Arrangøren-forbundet CpG island metylering har vært regnet som en av de mest fremtredende molekylære endringer som kan observeres i aldring [26]. Verdt å merke seg, har en tidligere studie vist at alle pasienter over 40 år hadde
RASSF1A
promoter metylert i ikke-neoplastiske cellene i leveren [27]. Men vi observerte høyere nivåer av
RASSF1A Hotell og
DOK1
metylering i HCC vev av den yngre gruppen ( 40 år), med en statistisk signifikant forskjell mellom
DOK1
metylering og alder (
p
= 0,036). Heri alle HCC pasienter under 40 år ble kronisk infisert med HBV, og man kan anta at disse pasientene ble smittet for lenge siden, sannsynligvis gjennom vertikal overføring. Flere studier har vist at HBV-X-protein (HBX) øker de totale DNA-metyltransferase (DNMT) aktivitet ved oppregulering av DNMTs, fremme hypermethylation av spesifikke tumorsuppressorgener [28]. Derfor kan viral status for de yngste pasientene har bidratt til høyere metylering nivåer observert i vår studie. Likevel har tidligere studier også funnet høyere nivåer av
RASSF1A Hotell og
DOK1
metylering i HCC prøver i de yngre aldersgruppene, men forskjellene var ikke statistisk signifikant [9, 10]. I tillegg betydelig høyere nivåer av
DOK1
metylering hos cirrhotiske vev i aldersgruppen 40 år, har tidligere blitt rapportert [10]. Til slutt fant vi at nivåene av
RASSF1A Hotell og
DOK1
metylering var høyere i moderat differentiated- enn i dårlig differensiert HCCs, med en betydelig forskjell i
DOK1 plakater (
p
= 0,005). Ingen av HCC pasienter inkludert i vår studie hadde vel differensierte svulster, slik at en bedre sammenligning mellom DNA metylering og tumor grad av differensiering ikke kunne oppnås. I et tidligere arbeid,
RASSF1A
metylering var nesten lik uavhengig av HCC differensiering [9], mens det er ingen rapporter om
DOK1
metylering og HCC grad av differensiering til dags dato.
i konklusjonen, er dette den første rapporten om de epigenetiske faktorer knyttet til HCC i Brasil. Våre resultater bekrefter at hypermethylation av
RASSF1A Hotell og
DOK1
bidrar til hepatocarcinogenesis og er en tidlig hendelse i kreftutvikling, trolig knyttet til kliniske egenskaper samt viktige risikofaktorer. Derfor
RASSF1A Hotell og
DOK1
avvik metylering kan være en verdifull biomarkør for tidlig diagnose av HCC og et attraktivt molekylære mål for epigenetisk basert terapi. Ikke-invasive metoder, slik som de måler hypermethylation av sirkulerende cellefritt DNA i serum /plasma, bør oppmuntres.
