Abstract
Laktat er skytteltrafikk mellom og inni cellene, spille metabolske og signaliserte roller i friskt vev. Laktat er også en budbringer av endret metabolisme og deltar i patogenesen av betennelse, hypoksi /iskemi, nevrodegenerasjon og kreft. Mange tumorceller viser høy andel av laktatproduksjon i nærvær av oksygen, et fenomen kjent som Warburg-effekten, som har diagnostiske og muligens terapeutiske implikasjoner. I denne artikkelen presenterer vi Laconic, en genetisk kodet Forster Resonance Energy Transfer (FRET) -basert laktat sensor designet på bakteriell transkripsjonsfaktor LldR. Laconic kvantifisert laktat fra 1 uM til 10 mM, og ble ikke påvirket av glukose, pyruvat, acetat, betahydroxybutyrate, glutamat, citrat, α-ketoglutarat, succinat, malat eller oxalacetate ved konsentrasjoner som finnes i pattedyr cytosol. Uttrykt i astrocytter, HEK-celler og T98G gliomceller, sensoren tillates dynamisk estimering av laktatnivåer i enkeltceller. Anvendes i kombinasjon med en blokkering av den monokarboksylatet transportør MCT, sensoren var i stand til å skille hvorvidt en celle er en netto laktat produsent eller en netto laktat forbruker. Bruk av MCT-blokken protokollen viste at basaldosen av laktat produksjon er 3-5 ganger høyere hos T98G glioma celler enn i normale astrocytter. I motsetning til dette, frekvensen av melkesyre i respons til mitokondriell inhibering med natriumazid var 10 ganger lavere enn i glioma i astrocytter, i samsvar med defekt tumor metabolisme. Et forhold mellom frekvensen av laktatproduksjon og hastigheten av azid-indusert melkesyre, som kan estimeres reversibelt og i enkle celler, ble identifisert som en svært følsom parameter i Warburg-effekten, med verdier på 4,1 ± 0,5 for T98G gliomceller og 0,07 ± 0,007 for astrocytter. Oppsummert beskriver denne artikkelen en genetisk kodet sensor for laktat og bruken for å måle laktatkonsentrasjonen, laktat forandring, og Warburg effekten i enkle pattedyrceller
Citation. San Martín A, Ceballo S, Ruminot jeg , Lerchundi R, Frommer WB, Barros LF (2013) En genetisk kodet FRET laktat sensoren og bruke til å oppdage den Warburg effekten i enkeltkreftceller. PLoS ONE 8 (2): e57712. doi: 10,1371 /journal.pone.0057712
Redaktør: Mika Jekabsons, University of Mississippi, USA
mottatt: 24 september 2012; Godkjent: 24 januar 2013; Publisert: 26 februar 2013
Copyright: © 2013 San Martín et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Delvis støttes av Fondecyt tilskuddet 1100936. den Centro de Estudios CientÍficos (CECs) er finansiert av den chilenske regjeringen gjennom Centers of Excellence Basal Finansiering Program for CONICYT og Gobierno Regional de Los Rios. WBF ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health (NIDDK; 1RO1DK079109). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
laktat er et organisk anion som deltar i den mellomliggende metabolismen av eukaryote og prokaryote celler. I pattedyrceller, er laktat produsert fra pyruvat av cytosoliske enzymet laktatdehydrogenase (LDH) og er byttet ut med det interstitiale rom og mellom subcellulære kamrene via monokarboksylat transportører (MCT). Hypoksiske vev og svulster frigjøre store mengder laktat, og det var en gang tenkt at laktat utgivelse var alltid patologisk, men det er nå blitt klart at i tillegg til sin rolle i hypoksi, har laktat viktige funksjoner hos friske oksygen vev. Inter og subcellulære utveksling av laktat, betegnes laktat skyttelbussene, er en integrert del av den normale energiomsetningen av muskler og hjerne [1], [2]. I hjernevev, til tross for normale eller forhøyede oksygen vev nivåer, er nevrale aktiviteten ledsaget av en akutt økning i vev laktat. Om og når nevronene produsere eller forbruke laktat under nevrale aktiviteten er fortsatt en kontroversiell sak [3] – [7], som ville ha stor nytte av laktatmålinger i enkeltceller. I tillegg, laktat støtter myelinisering prosessen [8], kan oppføre seg som et intercellulært signal i neurovaskulær kopling og natrium føle [9], [10], regulerer sin egen produksjon [11] og er nødvendig for langtidshukommelse formasjon [12 ], [1. 3]. Patofysiologiske roller for laktat inkluderer betennelse, sårheling, mikrobiell infeksjon, nevrodegenerasjon og kreft [14] -. [18]
Standard metoder for å måle laktat er basert på enzymatiske reaksjoner som blir avløst av fotometriske eller Amperometriske prosedyrer. Disse fremgangsmåtene er begrenset som de trenger for å forbruke substrat og /eller krever ødeleggelse av prøven; ingen av dem er istand til å påvise intracellulære laktat en ikke-invasiv i sanntid eller med enkeltcelle-oppløsning. Denne artikkelen beskriver en genetisk kodet reporter for laktat, bruk av denne reporter for bestemmelse av laktat transport og metabolsk fluks med forbedret oppløsning i tid og rom, og utforming av en følsom parameter av kreft metabolisme.
Resultater
LldR Flankert av FRET Pair mTFP-Venus Reports [laktat]
gente kodet Förster Resonance Energy Transfer (FRET) nanosensorer har blitt utviklet for å måle de dynamiske endringer i konsentrasjonen av flere molekyler av biologisk interesse med forbedret spatiotemporal oppløsning. FRET sensorer er fusjonsproteiner som består av en ligand-bindende enhet, gjenkjenningselementet, og et fluorescerende par med overlappende emisjonsspektra og eksitasjon, typisk CFP og YFP. Binding av testmolekylet fører til en konformasjonsendring som påvirker den relative distanse og /eller retning mellom de fluorescerende proteiner, forårsaker en økning eller en reduksjon i FRET effektivitet. Den nanosensor som er beskrevet her er basert på LldR, en bakteriell transkripsjonsregulator som består av to moduler, en laktat-bindende /regulatorisk domene og et DNA-bindende domene [19], [20]. For å generere en laktat sensor, valgte vi LldR gener fra
Corynebacterium glutamicum Hotell og fra
Escherichia coli
som potensielle gjenkjennelseselementer. Den tredimensjonale struktur av to laktat bindende proteiner er praktisk talt superimposable (fig. 1A), men de er bare 19,4% identisk, ulik i mange ladede rester som kan endre overflate-ladning skanning og muligens endringen i FRET effektivitet [21] . Som en FRET par vi valgt mTFP [22] og Venus [23], som, sammenlignet med CFP og YFP, er lysere og mindre pH-sensitive. Den generelle arkitektur av sensorene er avbildet i fig. 1B, med mTFP lokalisert ved N-terminus, den LldR flankert av linkere, og Venus lokalisert ved C-terminus. Åtte varianter ble konstruert for hver av de to gener ved hjelp av setespesifikk rekombinasjon. Variantene forskjellige med hensyn til tilstedeværelse av DNA-bindende domene og linker-lengde /sammensetning (sekvenser er tilgjengelige i fig. S1). En sammenlignende analyse viste at i respons til laktat
E. coli Hotell og
C. glutamicum chimeras
endret sin fluorescens ratio i motsatt retning, og at konstruksjonene fra
E. coli
var mer lydhør overfor laktat. Overraskende er det DNA-bindende domene var viktig for FRET endring. Som vist tidligere for glukose nanosensorer [21], laktat sensorer mangler kunstige linkere utført bedre (Fig. 1C). Varianten med den høyeste absolutte forholdet endringen ble valgt for ytterligere karakterisering. Dette nanosensor betegnes Laconic (laktat Optical Nano Indicator fra CECs) inneholder full-lengde LldR fra
E. coli
uten kunstige linkere. Den emisjonsspekteret av Laconic ble karakterisert ved de forventede topper mTFP og Venus fluorescens ved 492 nm og 526 nm, henholdsvis, og en reduksjon i FRET effektivitet ved laktat binding (fig. 2A). Kinetikk LldR for L-laktat er ikke kjent. Figur 2B viser at Laconic detektert laktat over fire størrelsesordener (fra 1 uM til 10 mM), i stedet for de to ordre som gis av en sted følere som for eksempel glukosenanosensorer [24]. Når analysert
in vitro
, er Laconic minst like følsom som den beste kommersielt tilgjengelige enzymbasert kit. responskurver Laktat-dose ble bestemt ved forskjellige pH-verdier (Fig. 2C), som viser en liten effekt ved sure verdier, og en mer markert effekt ved alkaliske verdier. Spesifisitet ble undersøkt ved å utsette føleren til et panel av metabolitter og noen interferens ble påvist for pyruvat og citrat (fig. 2D-I). Pyruvat endret ikke FRET-forhold (fig. 2D), men ved høye konsentrasjoner, pyruvat blokkerte virkningen av lav laktat (fig. 2G). Den fysiologiske konsentrasjon av pyruvat i pattedyrceller er lavere enn 100 um og 10-50 ganger lavere enn den for laktat [1], og derfor endogene pyruvat bør ikke interferere med laktat føler under fysiologiske betingelser. Citrat ved 1 mM øket FRET forholdet mellom 6% (fig. 2D) og reduserte responsen til sensoren for høy laktat (fig. 2 H). Ingen effekter ble observert ved 10 mm eller 100 mikrometer citrate (fig. 2D og 2 H). Cytosolisk citrat er lavere enn 100 uM [25] – [27], og forventes derfor ikke å forstyrre føler laktat i cytosol. Imidlertid kan mitokondrie sensing bli påvirket mitokondrie citrate er 10 ganger høyere. Ekstreme redoks prosenter oppnås med kombinasjoner av NADH og NAD
+ [28], var uten åpenbar effekt på laktat sensing (Fig. 2I).
(A) krystallografiske struktur av LldR fra
Corynebacterium glutamicum product: [19], og 3D-struktur av LldR fra
Escherichia coli
beregnet med LldR fra
C. glutamicum Hotell og FADR fra
E. coli
som maler (M4T Server 3.0 fra Fiser Laboratory https://www.fiserlab.org/servers_table.htm). (B) Generelt utforming: transkripsjonen regulator LldR er klemt mellom fluorescerende proteiner mTFP og Venus, med kunstige peptider skille proteiner (blå og oransje linkere). (C) Effekt av 10 mM laktat på fluorescensen forholdet mellom 8 varianter av laktat føleren basert på LldR fra enten
E. coli
eller
C. glutamicum
. Den mest responsive av konstruksjoner, vist ved pilen, ble brukt i resten av studien.
(A) Utslipp spektra i fravær og nærvær av 10 mM laktat. (B) Forholdet mellom mTFP og Venus fluorescens (eksitasjon ved 430 nm) ble målt ved 0 ° C, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5 og 10 mM laktat. Den kontinuerlige linje svarer til den beste tilpasning av en dobbel rektangulær hyperbel til data, med tilsynelatende dissosiasjonskonstant (K
D) verdier på 8 ± 2 uM og 830 ± 160 uM, og respektive maksimal AR verdier på 8 ± 0,4% og 11 ± 0,4%. (C) Laktat dose-respons-kurver ble målt ved de angitte pH-verdier. Den kontinuerlige linje svarer til den beste tilpasning av en dobbel rektangulær hyperbel til dataene ved pH 0,4. (D) Reaksjon av sensoren til 5 mM laktat, pyruvat, acetat, glutamat, β-hydroksy-butyrat og glukose, 1 mM α-ketoglutarat, succinat, malat eller oxalacetate, eller økende konsentrasjoner av citrat (0,01, 0,1 og 1 mM). I paneler E til I, ble laktat dose-responskurver målt i nærvær av 1 mM acetat, glutamat, β-hydroksy-butyrat eller glukose (E), i 1 mM α-ketoglutarat, succinat, malat eller oxalacetate (F) , på 0,25, 1 mM eller 10 mM pyruvat (G), i 0.01, 0.1 mM eller 1 mM citrat (H), og i 0,2 uM NADH, 100 uM NAD +, eller 0,2 uM NADH pluss 100 uM NAD + (i). De heltrukne linjene tilsvarer best mulig passform for en dobbel rektangulær hyperbel å kontrollere data.
Laconic Rapporter cytosolic Laktat i pattedyrceller
Sensoren vises den forventede cytosolic fordeling med atom utelukkelse når uttrykt i HEK293-celler (fig. 3A). Selv om mesteparten av sensor ble funnet i cytosol, kan muligheten for at en liten brøkdel lokaliserer til kjernen ikke utelukkes. Men det ser ikke ut sannsynlig at sensoren binder til pattedyr DNA, da denne type helix-turn-helix transcriptional regulator er ikke uttrykt i pattedyrceller. Mer direkte binding av LldR til prokariotic DNA som krever 17-nukleotidsekvens AATTGGCCCTACCAATT [20], som er fraværende i pattedyrgenomet i henhold til en eksplosjon analyse. Sekvensen er også fraværende i eukaryote arrangører (EPD, Eukaryote Arrangører Database, ExPASy). Muligheten for sensoren interferens med transkripsjon, som vi ikke favoriserer, kan løses ved å erstatte Ile 23 med serin, nylig rapportert å fjerne det DNA-bindende aktivitet av LldR [29].
(A) HEK293-celler uttrykke Laconic avbildet på 440 eksitasjon /535 utslipp). Scale bar er 20 mikrometer. (B) Fluorescens-forholdet ble målt ved 0,01, 0,1, 1 og 10 mM ekstracellulær laktat i HEK293 celler behandlet med metabolske inhibitorer og permeabiliserte til H
+, som beskrevet i Materialer og Metoder. (C) Tidsforløpet for mTFP og Venus fluorescences ble målt i nærvær av 2 mM glukose /1 mM laktat eller 10 mM pyruvat, som angitt. En celle med lav ekspresjon av sensoren som krever sterk belysning ble valgt for å demonstrere ufølsomhet av fluorescens-forholdet til fotobleking. Fluorescens-forholdet ble konvertert til laktatkonsentrasjon ved å bruke forholdet i pyruvat (null laktat) som beskrevet i teksten.
For kalibrering glykolyse ble blokkert med jodeddiksyre og mitokondrielle metabolisme ble blokkert med rotenon, i fravær av glukose, og cellen ble pH-fastklemt med den proton ionoforen nigericine i en kalium-rik buffer. Med laktat fluks stoppes og ingen pH-gradient ble MCT brukt til å ekvilibrere laktat over plasmamembranen. Den resulterende kalibreringskurve (fig. 3B) var lik i form til det som er observert med renset protein, noe som tyder på at sensoren
in situ
oppfører seg som
in vitro
. Men endringen i mTFP /Venus ratio på alle laktatkonsentrasjonen var omtrent det dobbelte observert
in vitro
. Vi kjenner ikke til at det dynamiske området for sensoren er høyere i celler. Mulige forklaringer inkludere negativ påvirkning fra histidin merkelappen som brukes for
in vitro
rensing og /eller bedre stabilisering av proteinet i den intracellulære miljø. Sensoren kan ikke kalibreres i astrocytter, fordi i disse celler glukosemangel ikke klarte å utarme laktat, som vist ved en robust respons til pyruvat (se nedenfor) og mangel på respons på lave laktatkonsentrasjon (data ikke vist), muligens forklares med vedvarende laktat produksjon fra glykogen og /eller forskjellig MCT affinitet. Selv i HEK-celler, er MCT permeabilitet ikke er lineær og den alvorlige celle skade påført av kalibreringsprosedyren kan ha blitt endret sensoren protein. Av denne grunn ble en mindre invasiv ett-punkts kalibreringsprotokoll utviklet som kan bli anvendt i løpet av forsøkene uten å skade cellene. Å utarme celler av laktat, vi tok fordel av en eiendom av MCT og andre facilitative transportører kalt trans-akselerasjon eller akselerert utveksling [30]. Termodynamisk likevekt for de MCT avhenger av gradientene av laktat og pH-verdi, men er også påvirket av gradienten av en hvilken som helst annen substrat. En tvunget innover pyruvat-gradient ble anvendt for å øke antall innovervendte tom bindingsseter og redusere antall utadvendt tomme bindingsseter, noe som øker laktat efflux og avtagende laktat tilstrømning. Et nytt termodynamisk likevekt kan bare nås når intra: ekstracellulære laktat ratio lik intra: extracelullar pyruvat ratio. Som ekstracellulære laktat ble holdt nær null ved superfusjons av en laktat-fri oppløsning, er intracellulær laktat spådd å falle, som observert i fig. 3C. Monochloracetate (MCA), en MCT substrat redusert fluorescens-forholdet til et lignende omfang som pyruvat (fig. S2), som indikerer at laktatproduksjon fra pyruvat er ubetydelig sammenlignet med laktat ekstrudering gjennom MCT. Dette kan forklares ved det faktum at kombinasjonen av høy pyruvat og glukose ikke alvorlig tapper NADH [28], [31], noe som begrenser den LDH reaksjonen. Måling med en enzymatisk kit bekreftet at MCA reduserer astrocytic laktat (fig. S2). Med verdien for fluorescensen forhold ved «null» laktat, de kinetiske konstantene bestemmes
in vitro
, og ved å anta en maksimal endring av fluorescens andel på 38% (fra dose-responskurven montert for å HEK celledata) ble fluorescens data omdannet til laktatkonsentrasjoner som vist i fig. 3C. Ytterligere validering av null laktat protokollen ble gitt av den observasjon at etter lengre glukose /laktat deprivasjon i HEK-celler, gjorde pyruvat ikke påvirke den fluorescens-forholdet (data ikke vist), i samsvar med full laktat tømming og en meget lav NADH: NAD
+ forholdet til stede i glukose-belastede celler [28], [31]. Den ovennevnte bevis pluss
in vitro
observasjon at sensoren ikke svare på lav laktat i nærvær av høy pyruvat (Fig. 2G), tyder på at fluorescens-forholdet i nærvær av høy pyruvat er et godt estimat null laktat. Likevel kan selv en liten rest signal innføre en betydelig skjevhet og forsiktighet bør utvises ved bruk av sensoren for å kvantifisere laktat, spesielt i astrocytter.
Ved å kontrollere utveksling av laktat mellom cellene og interstitiell plass, MCT er nodal interessante vev metabolisme. Opptaket av 5 mM laktat ved astrocytter ble inhibert med 65 ± 3% og 62 ± 7% i nærvær av MCT-blokkere phloretin og parachloromercurybenzoate (pCMBS; søylediagrammet i figur S3.). Transformasjon av laktat til pyruvat av LDH vil redusere frekvensen av melkesyre, men fordi pyruvat konsentrasjonene er en størrelsesorden lavere enn de av laktat, bør denne effekten være liten. Vi forventer ikke laktat buffering ved LDH eller ved selve sensoren for å være en viktig faktor fordi intracellulære laktat, typisk i området hundrevis av mikromolar til millimolar, er rikere enn enten [32], [33].
Måling av laktat produksjon og forbruk
flux diagrammet i fig. 4A viser hvordan den intracellulære konsentrasjonen av laktat påvirkes av glycolytic produksjon, mitokondrie forbruk og eksport /import gjennom MCT. Hastigheten av glykolyse ved dens inngangspunkt er beregnet med et FRET glukosesensor ved å blokkere glukosetransportør GLUT mens man overvåker hastigheten ved hvilken heksokinase tømmes det intracellulære lageret av glukose [34], en teknikk som har tjent til å detektere raske endringer i astrocytic glykolyse som reaksjon på signaler neuronale [11], [35], [36]. Ved å følge en lignende prinsipp, ble laktat utveksling undersøkt i HEK293-celler ved å perturbere den stabile tilstand med en MCT-blokkering under måling cytosoliske laktat med Laconic. I nærvær av glukose som eksklusiv drivstoff, phloretin førte til en akkumulering av intracellulært laktat, som indikerer netto laktatproduksjon, men hvis glukose ble erstattet av laktat, var resultatet laktat tømming (fig. 4B), som indikerer netto laktat import. I HEK-celler phloretin inhiberte bare 57 ± 5% av MCT-aktivitet (Fig. S3), og derfor undervurderer den faktiske produksjonshastigheter eller forbruket med ca. 40%. pCMBS var en mer effektiv MCT-blokkering enn phloretin i HEK-celler, med 96 ± 1% inhibering (fig. S3), noe som gir et mer nøyaktig estimat av laktatproduksjon (fig. 4C). I astrocytter, frekvensen av laktatproduksjon beregnes med den kalibreringsprosedyren som er beskrevet i fig. 3C var 2 ± 0,5 uM /s (n = 22 celler i tre forsøk), som faller i riktig størrelsesorden tatt i betraktning at under identiske kultur og eksperimentelle betingelser astrocytter forbrukt glukose ved 2 uM /s [34], og at en del glukose er oksidert til CO
2. Akutt hemming av oksidativ fosforylering (OXPHOS) med azid stimulert laktat produksjon av flere ganger (fig. 4D), passer den observerte stimulering av glukoseforbruk [34]. Kontroll pH-målinger med BCECF viste at azide forårsaket en liten forsuring som i astrocytter nådde 0,1 pH-enheter i løpet av den perioden melkesyre ble bestemt (Fig. S4). Ved 2 min av azid eksponering, hadde de tre celletyper stabilisert ved en pH på 0,2 pH-enheter lavere enn kontrollverdier. Virkningene av floretin og pCMBS for intracellulær pH-verdien var mindre. Tatt i betraktning den beskjedne følsomheten av laktat sensoren til en liten forsuring (fig. 2C), ser pH ikke ut til å være en betydelig faktor i de differensielle effekter av inhibitorer til laktat sensing i astrocytter, HEK293 og T98G celler.
(A) Diagram av laktat metabolisme. Cytosoliske konsentrasjonen av laktat er avhengig av balansen mellom glykolytiske produksjon, mitokondriell forbruk av pyruvat og laktat, og utvekslingen med det ekstracellulære laktat bassenget via MCT. (B) Intracellulær laktat ble overvåket i de enkelte HEK293-celler i løpet av transient eksponering til phloretin (50 uM), i nærvær av 25 mM glukose (øvre panel) eller 1 mM laktat (nedre panel). (C) Responsen for intracellulær laktat til forbigående inhibering av MCT med phloretin (50 uM) eller pCMBS (500 um) ble sekvensielt målt på samme HEK293-celle i nærvær av 25 mM glukose. De rette linjene representerer bakken av melkesyre montert ved lineær regresjon under det første minuttet av eksponering. Den søylediagram som oppsummerer data fra tre eksperimenter. (D) Effekten av 5 mM natriumazid ble målt i en astrocyte under eksponering til 50 mikrometer phloretin.
encellede Real-Time diagnostisering av kreft Metabolism
Kreftceller har defekte mitokondrier og sterk glykolyse, et fenomen kjent som Warburg virkning, som også er til stede i cellelinjer [15]. I samsvar med en mindre rolle for mitokondrier i ATP produksjon i kreftceller, real-time glukosemåling med FRET glukosesensoren [37] viste at glykolyse i T98G glioma celler er mye mindre mottakelig for OXPHOS hemming enn glykolyse i astrocytter (Fig. S5) . Dermed kan en robust glycolytic respons på azid tolkes som et tegn på at mitokondriene har en betydelig rolle i mobilnettet ATP produksjon. Reversibiliteten av effektene av azid og phloretin tillates sekvensielle anvendelse av azid, floretin og pCMBS til den samme celle. Resultatene viser astrocytter og glioma celler presentere motsatte mønstre, med astrocytter reagerer sterkt på azide men svakt til phloretin /pCMBS og T98G celler reagerer svakt til Azid og sterkere til phloretin /pCMBS (fig. 5A-D). En analyse av frekvensen av anskaffelses som kreves for nøyaktig estimering av responsen til azidet er beskrevet i fig. S6. Kontrollforsøk viste at det som observeres i HEK-celler, i T98G glioma celler pCMBS er en bedre inhibitor av MCT enn phloretin (95 ± 5% og 53 ± 3% inhibering, henholdsvis Fig. S3). Et forhold mellom basallaktatproduksjon og responsen på OXPHOS inhibering målt ved det samme området av fluorescens-forholdet og i den samme cellen bør være ufølsom for laktatkonsentrasjon og derfor mindre påvirket av mulige forskjeller i hvilende laktatkonsentrasjon eller sensor oppførsel mellom celletyper. Et slikt forhold, som vi har kalt den Warburg Index, var svært følsomme for den metabolske forskjellen mellom astrocytter og glioma celler. Beregnet med phloretin, som undervurderer laktat produksjon mer i glioma celler og HEK celler enn i astrocytter (Fig. S3), den Warburg Index var 0,07 ± 0,01 i astrocytter, 0,74 ± 0,15 i HEK celler og 1,7 ± 0,2 i glioma celler. Beregnet med pCMBS, den Warburg Index var 0,07 ± 0,01 i astrocytter, 0,94 ± 0,08 i HEK celler og 4,1 ± 0,6 i glioma celler (Fig. 5E). Mer spesifikke MCT-hemmere blir introdusert i forskning og i kliniske studier som kan brukes ved mikromolare konsentrasjoner eller lavere. AR-C155858, en spesifikk inhibitor av MCT1 og MCT2 [38], ble funnet å hemme opptaket av 5 mM laktat i astrocytter med 87% (Fig. S7). Ved hjelp av AR-C155858 den Warburg Index anslått i astrocytter var 0,07 ± 0,006 (Fig. S7). Kontroll eksperimenter viste at phloretin, azid og AR-C155858 var uten effekt på laktat sensing
in vitro plakater (Fig. S8). pCMBS forventes ikke å samhandle med sensoren som det ikke kommer inn pattedyrceller.
(A) En astrocyte uttrykker Laconic ble sekvensielt utsatt til 5 mm azid, 50 mikrometer phloretin og 500 mikrometer pCMBS. De rette linjene representerer første bakken av melkesyre montert ved lineær regresjon innenfor samme område av forholdet verdier. (B) En T98G gliom celle som uttrykker Laconic ble sekvensielt utsatt for 5 mM azid, 50 uM phloretin og 500 uM pCMBS. De rette linjene representerer første bakken av melkesyre montert ved lineær regresjon innenfor samme område av forholdet verdier. (C) Sammendrag av de første bakkene (Δ forholdet /min) ble oppnådd i tre forsøk av den type som er vist i A og B. (D) Korrelasjon plottet mellom satsene for melkesyre (Δ forholdet /min) i azid og i pCMBS. Symboler representerer enkelt astrocytter (hvite), HEK293 celler (grå) eller T98G celler (svart). (E) The Warburg indeksen ble beregnet som forholdet mellom satsene for laktat produksjon med pCMBS og melkesyre med azid, og brukes til å farge silhuetten av hver celle i henhold til 16-fargers se tabell. Det innfelte viser en isolert celle som var lokalisert ca 100 mikrometer fra klyngen. Søylediagrammet oppsummerer data fra 3 forsøk i hver celletype. Skala barer er 20 mikrometer. *, P 0,05 mellom hver celletype.
Diskusjoner
Vi har brukt den bakterielle transkripsjonen regulator LldR som anerkjennelse element å generere Laconic, en genetisk kodet biosensor som oppdager laktat i fysiologiske området. Uttrykt i pattedyrceller, sensoren var i stand til å følsom estimering av laktat transportøraktivitet og laktatproduksjon og ble brukt til å generere en ny én-celle-parameteren i Warburg-effekten, den metabolske varemerke for kreftceller. Utviklingen av en sensor basert på LldR gir grunnlag for å skape et bredt utvalg av nye indikatorer fordi GntR super, hvorav LldR er medlem, omfatter minst 270 andre transkripsjonsfaktorer som binder pyruvat, fettsyrer, aminosyrer, TCA syklus mellomprodukter, etc. [19], [39], som er mulige gjenkjenningselementer for genetisk kodede nanosensorer.
sensoren var i stand til å kvantifisere laktatnivåer i området mellom 1 mM og 10 mM. Den utvidede spekter av påvisning var uventet som tidligere utviklet metabolitt sensorer span bare to størrelsesordener [40] – [43]. Affinity blir hovedsakelig bestemt av egenskapene til den erkjennelse element og ikke av de fluorescerende partnere, slik at den karakteristiske kinetiske oppførselen til denne LldR-baserte sensor og dens følsomhet for mM nivåer av pyruvat kan være av interesse for forskere som arbeider med transkripsjonen regulering. Laconic tilbyr fordeler i forhold til alternative metoder, den første var oppløsning. Enzymatiske analyser og HPLC krever et stort antall celler, slik at meningsfylte data bare hvis det er metabolsk homogenitet. Virkelige vev og til og med kulturer primære vev er komplekse blandinger av celler som vokser og differensiere best i nærvær av hverandre, er en populær eksempel være ko-kulturer av neuroner og astrocytter. Som med andre genetisk kodet nanosensorer, kan Laconic uttrykkes
in vivo
i identifiserte celletyper ved hjelp av transgenesis eller viral transduksjon og kan være rettet mot subcellulære organeller. Et annet pluss for optiske målinger, er at de ikke krever ødeleggelse av prøven, slik at utformingen av statistisk kraftige før og etter typen eksperimenter. I tillegg til å være transportert av MCT, hvis virksomhet kan estimeres ved hjelp av et pH-følsomt fargestoff, er laktat også transporteres uavhengig av protoner gjennom gap veikryss [44] og eventuelt gjennom connexin hemichannels og pannexin kanaler, flukser som er usynlige for pH-målinger, og at kan nå bli kontaktet.
Selv om lignende form av kalibreringskurver innhentet
in vitro Hotell og i HEK celler er oppmuntrende, er det nødvendig harde full kalibreringsprotokoll et spørsmål om bekymring og det det er ikke mulig på dette stadiet for å sikre at de kinetiske parametrene oppnådd
in vitro
representerer oppførselen av sensoren i cellene. Dataene kan derfor betraktes som semi-kvantitative og uttrykkes i form av Δ forhold med null laktat punkt som en referanse, helst i før-og-etter eksperimenter med priser i forhold til lignende ratio verdier. En annen begrensning av Laconic er dens følsomhet pH i det alkaliske området. Under fysiologiske betingelser cytosoliske pH i de fleste celler som svinger mellom 7,0 og 7,4, område hvor føleren viste liten forandring, men gitt bredt område av konsentrasjoner dekket, og med en forholdsvis liten endring i pH-verdien kan innføre en feil i laktat-bestemmelse. Hvis en sterk pH endring er til stede, kan en korreksjon oppnås med rød pH-følsomme proteiner eller fargestoffer, co-lastet i de samme cellene eller med parallelle BCECF eksperimenter. En stående problem i cellemetabolismen er i hvilken grad mitokondriene forbrenne laktat i stedet for pyruvat [45] – [47], et fenomen som kan adresseres med laktatsensoren uttrykt i cytosol. Laktat målinger i den mitokondrielle matriks kan vise seg mer vanskelig på grunn av den reduserte følsomheten Laconic til pH 7,8-8,0 miljøet i dette kammer og mulige forstyrrelser av citrat. Disse begrensningene kan kanskje overvinnes ved mutagenese, som vist for den pH-følsomheten til sensoren NADH Peredox [28].
Protokollen for å vurdere laktatproduksjon /forbruk bør ideelt sett benytte en reversibel inhibitor er i stand til å blokkere laktat permeabilitet uten påvirke andre membran proteiner eller intracellulære prosesser. Verken pCMBS eller phloretin oppfylle en slik beskrivelse, men de utfyller hverandre. pCMBS ikke gå inn i cellen, men er rettet mot en rekke overflateproteiner og dens effekt er irreversible, utelukker utformingen av før-og etter eksperimenter. Vi vet ikke hvorfor astrocytter var mer motstandsdyktig mot pCMBS. Differential følsomheten MCT isoformer er mulig, men vi kunne ikke finne bevis for at det i litteraturen. Den delvise inhibering av pCMBS ventes å undervurdere laktatproduksjon i astrocytter med omtrent 35%, med en tilsvarende forspenning innført i Warburg-indeksen. Effekten av phloretin er reversible, men mindre effektiv, og er ikke spesifikk heller.
