Abstract
Eggstokkreft er den dødeligste av gynekologiske sykdommer og den femte årsaken til kreft dødsfall blant amerikanske kvinner. Dette er hovedsakelig på grunn av mangel på prognostisk verktøy som er i stand til å påvise tidlige stadier av eggstokkreft og den høye frekvensen av resistens mot de nåværende kjemoterapeutiske regimer. I dette scenariet den samlede fem års overlevelse for eggstokkreft pasienter diagnostisert på sent stadium er mindre enn 25%. Unormalt forbundet med ondartet fenotype og mekanismene for tumorprogresjon er ikke klart forstått.
In vitro
studier er nødvendig, men har vært hemmet på grunn av begrensninger sammen med bruk av ovarian cancer cellelinjer og heterogenitet av eggstokkreft cellepopulasjon avledet fra ascitesvæsker. I denne studien presenterer vi en enkel, hurtig og reproduserbar metode for isolering og karakterisering av eggstokkreft celler fra fast tumor vev og viser at enzymatisk fordøyelse i 30 minutter med dispase II resulterer i den mest effektive utvinning av levedyktige ovarialcancer (EOC) celler. Den resulterende kreft (EOC) cellepreparater demonstrerer et signifikant utbytte, høye nivåer av levedyktigheten og er fibroblast-fri. De vokser i opp til seks passasjer og beholde evnen til å danne sfæroider-lignende strukturer i agarose. I tillegg kan de være genetisk manipulert og anvendes for medikamentscreening, og således gjør dem meget egnet til nedstrøms applikasjoner. Spesielt, isolering av eggstokkreft celler fra solide prøver ved hjelp av denne metoden har den fordelen at for isolering av kreft celler fra tidlige stadier av eggstokkreft, samt innhenting av celler fra definert enten primære og /eller metastatisk eggstokkreft nettsteder. Dermed disse cellene er godt egnet for undersøkelser med sikte på å forstå eggstokkreft
Citation. Sueblinvong T, Ghebre R, Iizuka Y, Pambuccian SE, Isaksson Vogel R, Skubitz APN, et al. (2012) Etablering, karakterisering og Nedstrøms Bruk av Primary eggstokkreft celler avledet fra solide tumorer. PLoS ONE 7 (11): e50519. doi: 10,1371 /journal.pone.0050519
Redaktør: Elad Katz, University of Edinburgh, Storbritannia
mottatt: 23 april 2012; Godkjent: 22 oktober 2012; Publisert: 30.11.2012
Copyright: © 2012 Sueblinvong et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av det amerikanske forsvarsdepartementet Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 til MB og APNS og av Randy Shaver Cancer Research and Community Fund til MB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
morfologiske og molekylærgenetiske studier har fastslått at eggstokkreft er en heterogen sykdom som omfatter en rekke forskjellige histotypes inkludert høy grad av serøs karsinom [1]. Den nåværende kjemoterapiregime for eggstokkreft består av taxan og platinabasert terapi. Mens 80% av pasientene med tidlig fase sykdom viser et 5 års overlevelse, har behandlingen begrenset effekt mot avansert stadium epitelial eggstokkreft (EOC). Mangelen på effektive diagnostiske og prognostiske verktøy for ovarial cancer gjør denne spesielt kreft svært vanskelig å håndtere, og de fleste pasienter utvikler kjemoterapi-resistente svulster og tilbakefall [2], [3], [4], [5], [6]. Mye av vår nåværende kunnskap om menneskelig eggstokkreft har blitt avdekket gjennom bruk av etablerte udødelig eggstokkene overflaten epitelceller (IOSEs), eggstokkreft cellelinjer og primære eggstokkreft celler avledet fra ascitisfluider [7], [8]. Bruken av IOSEs og eggstokkreft cellelinjer har åpenbare fordeler, inkludert deres høye proliferativ kapasitet og utvidet levetid. Dessverre, både genetiske og fenotypiske endringer knyttet til utvidet
in vitro
passasjer og heterogeniteten som følge av primær eggstokkreft celler fra ascitisfluider gjør dem til en mindre enn ideell modell for eggstokkreft studier. Således, evnen til å isolere og kultur frisk EOC celler fra faste prøver eggstokkreft gir en unik modell for studier av nye terapeutiske tilnærminger for ovarian cancer behandling.
Flere fremgangsmåter er blitt beskrevet for den primære kultur av enten human ovarian overflate epitelial (OSE) celler fra normale eggstokkene eller EOC-celler isolert fra ascitesvæske av kreftpasienter [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15] . Imidlertid har veksten av ondartede celler fra faste tumorer vært problematisk på grunn av stromal celle eller fibroblast overvekst, liten eller ingen vekst av ondartede celler, eller for tidlig tap av proliferativ kapasitet i kultur. Mens det er flere alternativer for å skape encellede suspensjoner fra solide tumorer gjennom mekaniske hjelpemidler eller enzymatisk dissosiasjon, ingen har adressert hvilken teknikk gir den mest pålitelige resultatet [16], [17], [18]. I denne studien, beskriver vi for første gang en systematisk sammenligning mellom mekanisk ødeleggelse og enzymatisk spaltning med enten kollagenase A, hyaluronidase eller dispase II for forskjellige tidsrom fra 30 til 120 minutter for isolering av EOC celler fra faste eggstokkreft tumorer. Vi rapporterer at enzymatisk fordøyelse i 30 minutter med dispase II resultatene i den mest effektiv utvinning av levedyktige EOC celler og at langvarig eksponering for enzymatisk fordøyelse er sammen med betydelig reduksjon i utvinning av levedyktige celler.
EOC cellekulturer er fibroblast-free, som vurderes av EpCAM farging med MOC-31 og Ber-EP4 mAbs, og vokste eksponentielt for inntil seks passasjer før de senesced og døde. Viktigere, EOC kulturene opprettholdt noen av de fenotypiske egenskapene til de tumorer som de stammer fra, herunder evnen til å danne sfæroide-lignende strukturer på agar-substrater. Til slutt, EOC kulturer var egnet for nedstrømsapplikasjoner som de var svært utsatt for genetisk manipulering ved hjelp av lentiviral infeksjon og nyttig i narkotika screening tester.
A. Gjennomsnitt ± standardavvik av det totale antall levedyktige celler pr 500 mg vev avledet fra hver tilstand umiddelbart etter behandling (dvs. pre-vedheft kulturer) og deretter igjen etter 7-10 dager etter adhesjon i vevskultur (dvs. adherente kulturer). B. Prosentandel av celle-levedyktighet for hver tilstand uttrykt som prosent av pre-vedheft kulturer til adherente kulturer. Minste kvadrats midler (justert for gjentak innen pasient), åtte uavhengige eksperimenter og 95% konfidensintervall presenteres.
Materialer og metoder
Material
følgende materialer ble innkjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, CA) cellekulturmedier: DMEM, føtalt bovint serum (FBS), 100X penicillin-streptomycin, 0,05% vekt /volum trypsin-EDTA. Enzymer:. Dispase II og kollagenase A (Roche, Indianapolis, IN), hyalorunidase (EMD Chemicals, Gibbston, NJ)
(a) Representative eksempler på primære EOC celler isolert fra kreftprøve etter to dager i kultur ( pil viser erytrocytter); (B) Swirl-lignende klynger av EOC celler etter 3-4 dager i kultur (pilen viser den voksende klynger); (C) En koloni av EOC-celler som sprer seg i vevskultur plast etter 7-8 dager i kultur; (D) En konfluent monolag av EOC celler som viser typisk epitel brostein morfologi etter 13-14 dager i kultur; og (e) En konfluent monolag av fibroblaster her brukt som negativ kontroll.
Antistoffer.
De to monoklonale antistoffer som gjenkjenner EpCAM, Ber-EP4 og MOC-31, ble kjøpt fra Dako (Carpinteria, CA) og brukes på konsentrasjon anbefalt av produsenten for immunhistokjemisk analyse. Valget mellom å bruke disse to spesielle anti-EpCAM mAb ble gjort fordi de har vist større spesifisitet for epitelceller i forhold til andre epiteliale markør [19], [20], [21], [22] ICC av primære EOCs kulturer var utføres av sertifiserte teknikere i Immunocytochemistry og Histopatologi Laboratory of Fairview University Medical Center ved University of Minnesota hvor disse markørene blir rutinemessig brukt til farging av kirurgiske prøver å bekrefte sin epitel natur, inkludert ovarialcancer kliniske prøver. PARP, β-actin og peroksydase-bundet anti-mus og anti-kanin-immunoglobulin G-antistoffer ble anskaffet fra henholdsvis BD Pharmingen (San Diego, California) og Sigma (St. Louis, MO) og anvendes ved den konsentrasjon som er anbefalt av produsenten for immunoblot analyse
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
den menneskelige eggstokkreft cellelinjer ES-2 og NIH… OVCAR5 ble ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia)
A FFPE blokk av normal eggstokk, som viser positiv farging for EpCAM med begge de monoklonale antistoffene Ber-EP4 og MOC-31 av de normale ovarian overflate epitelceller. En FFPE blokk av serøs eggstokk-adenokarsinom som viser positiv farging for EpCAM med begge de monoklonale antistoffene Ber-EP4 og MOC-31 av EOC-celler i tumoren. Immunocytokjemisk farging av parafininnstøpte EOC kulturer med de monoklonale antistoffene Ber-EP4 og MOC-31 viser positiv farging for EpCAM. Immunocytokjemisk farging av parafin-embedded fibroblast kulturer med de monoklonale antistoffer Ber-EP4 og MOC-31, her brukt som negative kontroller.
Reagens Setup
Komplett DMEM medium.
DMEM supplert med 10% FBS, og 100 enheter penicillin-streptomycin. Mediet ble lagret ved 4 ° C og oppvarmet til 37 ° C før bruk.
enzymer.
Dispase II (2,4 U /ml), hyaluronidase (0,0369 U /ml) og kollagenase A (0,15 U /ml) ble fortynnet i PBS, alikvotert og lagret ved -20 ° C i en ikke-frostfri fryser.
A. Kulturer av celler (EOC donor 8) avledet fra 30 minutter etter enzymatisk spalting med dispase II eller hyaluronidase ble vurdert med hensyn til spredning over en periode på 5 dager (D1, D3, D5). Forsøk ble utført i tre paralleller. B. Dobling tid for celler behandlet med dispase II i 30 minutter (
toppen
) eller hyaluronidase 30 minutter (
nederst
) beregnes ved ikke lineær regresjonsanalyse.
Tissue samling
Åtte vevsprøver (~ 5 g i størrelse) fra EOC svulster ble hentet fra University of Minnesota vev anskaffelser Facility (TPF) etter Institutional Review Board Committee: human Subject Board (IRB) godkjennelse. Spesielt samtykke ble frafalt av IRB ved University of Minnesota.
Pasientenes alder varierte mellom 47 og 68 år gammel. Den gjennomsnittlige pasientens alder var 60 år Vevsprøver ble samlet inn fra områder makroskopisk identifisert som kreft ved patologer. Prøvene var deidentified og registrert følge protokollen for Bionet vev anskaffelser Facility. Valgte vevsprøver ble plassert i sterile 50 ml konisk rør inneholdende is-kald DMEM, som deretter ble levert til en cellekultur laboratorium i en bøtte med is i løpet av 30 minutter av frisk prøvesamling.
tilstøtende områder av alle svulster gikk påfølgende rutine vev behandling (formalin fiksering og parafin embedding). Histopatologisk analyse av seksjoner for å vurdere sub-type, grad av eggstokkreft og iscenesettelse basert på patologiske og bildedata som utføres av kirurgiske patologer ved University of Minnesota Medical Center, Fairview.
(a) EOC celler fra donor 8 danner kuler-lignende strukturer på agarose; (B) NIH: OVCAR5 menneskelig eggstokkreft cellelinje også dannes kuler (positiv kontroll); (C) EOC celler fra donor 8 transfektert med GFP uttrykker lentivirus pEF-GFP-SIN; og (d) fasekontrast av det samme feltet.
ovarialcancer (EOC) isolasjon protokollen.
vevsprøver (~ 5 g) ble delt med en skalpell i ti stykker av lik vekt (rundt 500 mg) som ble plassert i 60 mm Petri-skåler inneholdende 5 ml DMEM og videre kuttet i mindre biter på omtrent 2 mm. For mekanisk ødeleggelse, ble prøven oppslemmingen presset gjennom en 70 pm sikt med en sprøytestempelet og cellen filtratet ble sentrifugert ved 1200 opm i 7 minutter ved 4 ° C. De resterende ni prøver ble behandlet via enzymatisk fordøyelse ved tilsetning av enten kollagenase A, hyaluronidase eller dispase II, og deretter inkubert i 30 til 120 minutter, på hvilket tidspunkt celle oppslemmingene ble ført gjennom 70 pm sikt og sentrifugert som beskrevet ovenfor. Etter resuspensjon i DMEM inneholdende 10% FBS, ble prøver for hver tilstand evaluert for cellenes levedyktighet ved trypan blå eksklusjon fargestoff. Medium ble forandret 24 timer etter første platekledning og hver tredje dag for de neste to ukene.
immunocytokjemisk analyse.
immunocytokjemisk analyse for EpCAM uttrykk med de monoklonale antistoffer MOC-31 og Ber-EP4 var utføres på eggstokkreft celler som var i kultur i 14 dager. Spesielt ble primære eggstokkreft celler høstet ved trypsinering, vasket med PBS og spunnet. Den avledede celle-pelleten ble deretter formalinfiksert og parafin innebygd (FFPE EOC) for å generere celleblokker. Snittene ble utsatt for immunocytochemistry hjelp av Ventana XT automatiserte Stainer fra Ventana Medical System (Tucson, Arizona). I korthet, ble objektglassene deparaffinized og følgende antigen gjenfinning, inkubert med de monoklonale antistoffer mot EpCAM (MOC-31 og Ber-EP4) for 32 og 16 minutter, henholdsvis, før farging med den iView DAB deteksjon kit fra Dako (Carpinteria, CA). Immunocytochemistry ble utført i Histopatologi Laboratory of Fairview University Medical Center ved University of Minnesota.
Måling av celle levedyktighet.
Cell antall og levedyktighet av EOC kulturer ble bestemt av trypanblått eksklusjon analysen.
Anchorage uavhengig analyse.
metoden som brukes for anker uavhengige analysen var basert på væske overlay teknikk som tidligere beskrevet [23]. I korthet, for å forby celle adhesjon til et substrat, ble 24-brønners vevskulturplater (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) belagt med 200 ul 0,5% SeaKem LE agarose (BioWittaker Molecular Applications, Rockland, ME) i serumfritt media , og tillatt å stivne i 30 minutter ved 20 ° C. NIH: OVCAR5 eller EOC cellesuspensjoner (5000 celler) ble lagt på toppen av de faste agarose-belagte plater ved et volum på 1 ml /brønn i DMEM supplert med 10% FBS og deretter inkubert i 48 timer ved 37 ° C
morfologi av celler og kuler.
A Nikon Eclipse TE 2000E invertert mikroskop ble brukt til avbildning av cellulær morfologi med fasekontrast. Bilder ble tatt med Spot 3.5.8 oppkjøpet programvare (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).
Infeksjon av EOC med lentivirus.
lentivirus vektor pEF-GFP-SIN, den VSVG konvolutt og delta-8,9 plasmidene ble ko-transfektert inn i 293T celler for virusproduksjon som tidligere beskrevet [24]. Viruset Supernatanten ble spin-infisert i nærvær av 10 ug /ml polybrene til 1 x 10
5 av EOC cellene ved 2500 rpm i 2 timer ved 33 ° C. GFP-ekspresjon ble overvåket 48 timer etter infeksjonen.
Western blot-analyse.
Totalt cellulært protein (10-20 ug) fra hver prøve ble separert ved SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner og kastet Western blot-analyse ved bruk av PARP og p-aktin-antistoffer.
A. Morfologiske endringer i EM-celler enten uekte behandlet eller behandlet med bortezomib (2 nM) og Vorinostat (6 uM) alene og i kombinasjon i 18 timer. B. Representative eksempler på lysat av EOC celler fra donorer 1 og 8 (
og visum panel
) eller ES-2 human eggstokkreft cellelinje (
bunnpanelet
) enten håne behandlet eller behandlet med bortezomib (2 nM) og Vorinostat (6 uM) eller bortezomib (6 nM) og Vorinostat (3 uM) henholdsvis, alene og i kombinasjon i 18 timer og immunoblottet med et antistoff som gjenkjenner den full-lengde og de spaltede former av PARP. Lik protein lasting ble verifisert ved hjelp av et antistoff rettet mot β-aktin. * = Et bestemt band. C. Økning i de kløyvde-PARP arter i mock versus behandlet EOC celler uttrykt som kløyvet full lengde /spaltet PARP-forhold.
Statistisk analyse
Alle resultatene ble analysert ved hjelp av blandede effekter lineære regresjonsmodeller med faste effekter for behandling eller lengden på behandling som er hensiktsmessig og en tilfeldig effekt for svulst kilde. Til tross for den ikke-normaliteten av noen av dataene, lineære regresjonsmodeller er ganske robust, og gir mulighet for inkludering av tilfeldige effekter. Minste kvadraters gjennomsnitt og standardfeil ble rapportert og p-verdier ble justert for multiple sammenligninger med en Bonferroni korreksjon. Alle betydning nivåer ble satt til 0,05. Beregning av cellenes dobling tid (DT) ble oppnådd ved ikke-lineær regresjonsanalyse ved hjelp av Prism (V.5 Graphpad, San Diego, California).
Diskusjon
Sammenligning av dissosiasjon Teknikker
Resultater og
Mens mekanisk ødeleggelse og enzymatisk fordøyelse representerer to åpenbare valg for isolering av EOC celler fra solide vevsprøver, en direkte sammenligning har ikke blitt gjort for å finne ut hvilken prosedyre resulterer i en større celle yield og levedyktighet. For å løse dette spørsmålet, åtte solide ovarialcancer kliniske prøver inkludert fem høy klasse serøse adenokarsinomer, to serøs border og ett udifferensierte høy klasse karsinomer (tabell 1) ble samlet på tidspunktet for kirurgi og utsatt utelukkende til mekanisk avbrudd eller enzymatisk fordøyelse etterfulgt av mekanisk avbrudd. Spesielt ble hver prøve kuttet i prøver av lik vekt (500 mg) og deretter underkastet utelukkende for mekanisk ødeleggelse ved bruk av et 70 um celle sil eller ble enzymatisk spaltet i 30, 60 eller 120 minutter med dispase II, hyaluronidase eller kollagenase A og deretter mekanisk avbrutt ved passering gjennom en 70 um sikt. For hver tilstand, ble cellenummer og levedyktighet vurderes av trypan blått fargestoff utelukkelse på to tidspunkter: umiddelbart etter prøvebehandling (pre-vedheft kulturer), og etter en periode på sju til ti dager (heft kulturer)
. den innledende antall celler gjenvunnet (dvs. pre-adhesjons kulturer) var høyest når tumorer ble utelukkende mekanisk avbrutt uten enzymatiske behandlinger. Ikke overraskende er det totale antall celler som opprinnelig utvinnes etter enzymatisk behandling øker med lengden av tiden som ble vevet utsatt for de forskjellige enzymatiske behandlinger. Den høyeste prosentandel av celle utvinning, basert på start antall celler, inntraff når celler ble eksponert i 30 minutter for å dispase II (figur 1A). Mens det ikke er statistisk signifikant etter justering for multiple sammenligninger, den gjennomsnittlige prosentvise gjenvinning av cellen når cellene ble utsatt for dispase II i 30 minutter (58,0%) er høyere enn de andre, særlig mekaniske (19,9%, figur 1B). Interessant nok en uke etter utplating (adherente kulturer) de vev som hadde blitt eksponert for de lengste tidsperioder i den enzymatiske behandling, viste en statistisk signifikant reduksjon i utvinningen av levedyktige celler (p = 0,02).
Tatt sammen, dette tyder på at mekanisk ødeleggelse og langvarig enzymatisk behandling var spesielt harde på EOC celler og at en 30 minutters eksponering for dispase II representerer det beste valget for å få levedyktige EOC kulturer.
Vekst Kjennetegn på EOC kulturer og karakterisering av deres Epitelial Nature av EpCAM Farging
Deretter dokumentert vi morfologiske endringer og vekstegenskaper av ferskt isolerte EOC celler avledet fra solide tumorer. To dager etter utplating i DMEM supplementert med 10% FBS, EOC cellene begynte å følge den plate som indikert ved tilstedeværelse av små klaser adherente (figur 2a). På dag to, til erytrocytter (pil) fortsatt dukket være levedyktig i kulturen. Ved dag 4 (figur 2b), de adherente kolonier av EOC-celler dannes virvelliknende former (pil) og begynte å spre seg i vevskultur plate, mens de resterende erytrocytter progressivt forsvunnet fra kulturen. Store flercellede Aggregatene ble også observert på dette trinn; disse senere inndelt i cellemonolagene. Ved dag 7, den første EOC cellegruppene begynte å spre seg (figur 2c). Ved dag 14, EOC-cellene ble et konfluent monolag og viste det typiske epiteliale brostein morfologi (figur 2d), som så ut til å være ulik fra den ene av en 14-dagers fibroblast kultur her anvendt som en negativ kontroll (figur 2e).
for å bekrefte epithelial natur 14-dagers EOC kulturer, neste utførte vi immunocytochemistry (ICC) for epithelial markør EpCAM ved hjelp av to ulike monoklonale antistoffer, Ber-EP4 og MOC-31. Viktigere, i motsetning til de som rutinemessig anvendes maskin, som ikke kan skille mellom epitelceller, mesothelial celler eller fibroblaster, den Ber-EP4 og MOC-31-antistoffer utelukkende flekken for det EpCAM markør i epitel-celler [19], [20], [21], [22]. Farging med disse to antistoffer tillater oss å bedømme renheten av de isolerte EOC celler. Som vist i figur 3, EOC-celler viste den karakteristiske cytoplasmatisk farge EpCAM med begge, Ber-EP4 og MOC-31 monoklonale antistoffer. EOC celler som vi isolert besto av en homogen populasjon av epitelceller. Det ble ikke observert forskjell i forhold til renhet mellom mekanisk ødeleggelse eller enzymatiske fordøyelsen teknikker (ikke vist). Som positive kontroller, normal ovarie flate epitel (nese) celler og serøs adenocarcinoma også farget for epitelisk markør EpCAM med begge, Ber-EP4 og MOC-31 mAbs figur 3). En to-ukers lange fibroblastisk kultur ble også underkastet ICC med for epitelisk markør EpCAM med Ber-EP4 og MOC-31 mAbs som negativ kontroll (figur 3).
Vekst Karakteristika for EOC Kulturer og deres Ned- stream Applications
for å bedømme vekstegenskapene til de oppnådde primære EOCs kulturer, målte vi formeringshastigheten av de EOCs celler som ble avledet fra 30 minutter spaltning med dispase II og hyaluronidase omtrent på dag 14 fra isolasjon ( etter at de ble et konfluent monolag, vises typisk epitel brostein morfologi og positiv farging for EpCAM epitel markør). Celler ble overvåket i formeringshastigheten av trypan blått fargestoff utelukkelse telle i løpet av syv dager. Som vist i figur 4A, EOC-celler fra både dispase II og hyaluronidase behandlinger vokste med en fordoblingstid (DT) på 3,1 og 5,4 dager, henholdsvis som beregnet ved ikke-lineær regresjonsanalyse (4B
topp
og
bunn
). Videre celler oppnådd ved disse to enzymatiske fordøyelse metoder kan bli passert inntil seks ganger i løpet av en periode på 4 uker før de senesced og døde (ikke vist).
A unik modell for å studere eggstokkreft progresjon samt å teste følsomheten av eggstokkreft celler til nye kjemoterapeutiske midler
in vitro
er avhengig av deres evne til å danne kuler [23], [25]. I bukhulen til pasienter med kreft i eggstokkene, sfæroider naturligvis dannes i ascites væske og, når den er dannet
in vitro
, de etterligner kreften er tredimensjonale strukturen i selve svulsten. Dermed har vi testet de primære EOCs kulturene for deres evne til å danne sfæroide lignende strukturer i en forankringsuavhengig vekst assay ved å dyrke dem på den ikke-klebende agarose substratet. Ovarian cancer cellelinje NIH: OVCAR5, som er kjent for å danne sfæroider, ble anvendt som positiv kontroll [26]. EOC-celler og NIH: OVCAR5 celler var like stand til å danne sfæroide-lignende strukturer over syv dager (figur 5a og 5b, henholdsvis). Kulene av flercellede aggregater var av varierende størrelse og besto av flere titalls opp til nesten hundre celler per aggregat.
Genetisk manipulering av primære eggstokkreft celler er ofte nødvendig for forståelsen av rollen til onkogener og tumorsuppressorgener under eggstokkreft initiering og progresjon. Derfor, testet vi de primære EOCs kulturene for deres evne til å være genetisk manipulert via infeksjon med lentiviral partikler som uttrykker pEF-GFP-SIN. Effektiviteten var infeksjons 80% når vi målte forholdet mellom GFP-uttrykke celler (Figur 5c, blå kanal) versus total celle nummer (figur 5d, lyse felt). Disse forsøk gir bevis for at de isolerte primære EOCs kulturer cellene beholdt noen av deres fenotypiske karakteristika /attributter.
Toksisitetsstudier forsøkte å bestemme aktivitetsprofilen av nye chemotherapic midler og deres kombinasjon i kreftceller er av avgjørende betydning for målrettet behandling for eggstokkreft. Vi har tidligere vist at kombinasjonen proteasominhiberingens og pan-HDACs hemmere indusere synergistisk drap av eggstokkreft cellelinjer mens sparsom sin udødelig motstykke [27]. Således, sammenlignet vi følsomheten til dette spesielle legemiddelkombinasjonen i de primære EOCs kulturer, samt i den kommersielt tilgjengelige ovarian cancer cellelinje ES-2. Nærmere bestemt ble EOCs cellene utsatt for sub-optimale konsentrasjoner av den proteasominhibitor bortezomib (2 nM) og pan-HDACs inhibitor Vorinostat (6 uM), enten alene eller i kombinasjon, og inntreden av apoptose ble målt ved å overvåke morfologiske endringer og ekspresjonsnivåer av spaltes PARP i primær EOCs kulturer og ES-2 ovarian cancer cellelinje (fra giverne 1 og 8) etter 18 timers medikamenteksponering.
Som vist i figur 6A, kombinasjons-behandling resulterte i større apoptose-assosierte morfologiske endringer i primær EOCs kulturer sammenlignet med monoterapi eksponering. Kombinasjonsbehandling også ført til økte nivåer av kløyvde PARP sammenlignet med monoterapi eksponering i både grunnskolen EOCs kulturer (figur 6B
øvre og midtre panelet
) og ES-2 eggstokkreft cellelinjer (figur 6B,
nedre panelet
). Kvantifisering av forholdet mellom spaltede full lengde og spaltet PARP er primær EOCs kulturer er vist i figur 6C.
Konklusjoner
En bedre forståelse av initiering, utvikling og progresjon av eggstokkreft er av overordnet betydning for å forbedre resultatet av ovarian kreftpasienter. Ett av de mest utfordrende problemene knyttet til disse studiene er mangelen på pålitelighet ved bruk av etablerte ovarie cancer cellelinjer, noe som ofte har gjennomgått flere hundre passasjene
in vitro
. Cellelinjene kan ikke lenger ligne kreften fra hvilken de opprinnelig ble utledet. I denne studien vil vi beskrive den mest effektive og raske metode for å isolere EOC celler fra faste tumorer. EOC cellepreparater er blottet for fibroblaster og vokse eksponensielt for opptil 6 passasjer før de senesce og dø. Viktigere er disse nylig isolerte EOC cellene beholde evnen til å danne sfæroide-lignende strukturer, kan lett bli transfektert ved hjelp av en lentiviral system, og er et levedyktig verktøy for medikament-screening. Dermed er disse cellene gjøres egnet for nedstrøms forskning.
Til slutt, evnen til å isolere og manipulere eggstokkreft celler avledet fra faste tumorer versus ascites fluid har den potensielle fordel av å isolere EOC celler fra tidlige stadier av sykdommen før det tidspunkt da ascitesvæske dannelse skjer. Spesielt er cellelinjer avledet fra ascites-væske erholdt fra et relativt sent stadium av sykdommen, og det er ikke mulig å bestemme hvorvidt cellene var avledet fra det primære tumor-stedet, eller fra et metastatisk område.
Takk
Vi vil gjerne takke legene. Linda Carson, Levi Downs, Melissa Geller, Peter Argenta, Patricia Judson og Amy Jonson, Seksjon for gynekologisk onkologi, University of Minnesota for å bistå med valg av tumorprøver. Vi vil gjerne takke Karin Daniels fra Fairview Medical Center og Sarah Bowell fra vev anskaffelser Facility ved University of Minnesota for å få hjelp med immunocytokjemisk analyse og anskaffelse av pasient vevsprøver, henholdsvis. Vi ønsker også å takke Dr. Charles Landen, Seksjon for gynekologisk onkologi, University of Alabama for å bistå med protokollen oppsett.
