Abstract
epotiloner er en ny klasse av microtubule stabiliseringsmidler med lovende preklinisk og klinisk aktivitet. Deres mobil mål er β-tubulin og faktorer som påvirker iboende følsomhet for epotiloner er ikke godt forstått. I denne studien ble den funksjonelle betydningen av spesifikke p-tubulin isotypes i indre følsomhet for epotilon B undersøkt ved hjelp av siRNA genet knockdown mot βII-, βIII- eller βIVb-tubulins i to uavhengige ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer, NCI-H460 og Calu-6. Narkotika behandlet klonogene analyser viste at følsomhet for epotilon B ikke ble endret følgende knockdown av βII-tubulin i begge NSCLC cellelinjer. I motsetning til dette, knockdown av SIII-tubulin økt betydelig følsomhet for epothilon B. Interessant nok βIVb-tubulin knock-out var signifikant mindre følsomme for epotilon B, sammenlignet med mock- og kontrollere siRNA-celler. Cellesyklusanalyse av SIII-tubulin knockdown-celler viste en høyere prosentandel av celledød med epotilon B-konsentrasjoner så lave som 0,5 nM. I motsetning til dette viste βIVb-tubulin knockdown-celler en reduksjon i epotilon B-indusert G
2-M cellesyklus akkumulering sammenlignet med kontroll siRNA-celler. Viktigere, viste SIII-tubulin knock-out-en signifikant doseavhengig økning i andelen av apoptotiske celler ved behandling med epotilon B, som påvist ved anvendelse av caspase 3/7 aktivitet og Annexin V-farging. Høyere konsentrasjoner av epotilon B var nødvendig for å indusere apoptose i de βIVb-tubulin knock-out sammenlignet med kontroll siRNA, fremhever en potensiell mekanisme som ligger til grunn redusert følsomhet for denne agent. Denne studien viser at spesifikke p-tubulin isotypes kan påvirke følsomheten for epotilon B og kan påvirke differensial følsomhet for dette lovende ny agent
Citation. Gan PP, McCarroll JA, Byrne FL, Garner J, Kavallaris M (2011 ) Spesifikke beta Tubulin isotypes Kan Funksjonelt forsterke eller redusere epotilon B følsomhet i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE seks (6): e21717. doi: 10,1371 /journal.pone.0021717
Redaktør: Paraskevi Giannakakou, Weill Cornell Medical College of Cornell University, USA
mottatt: 13 oktober 2010; Godkjent: 09.06.2011; Publisert: 29 juni 2011
Copyright: © 2011 Gan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Barnas Cancer institutt Australia for medisinsk forskning, som er tilknyttet University of New South Wales og Sydney Children Hospital og tilskudd fra New South Wales Cancer Council (MK). Endeavour International Postgraduate forskningsstipend (PPG), University of New South Wales medisinske fakultet Fellowship (JAM), University of New South Wales medisinske fakultet Early Career forskningspris (JAM), Balnaves Award (JAM), Anthony Rothe Graduate Award (JLB ), og etter en NHMRC Senior Fellowship (MK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. MK, PPG og syltetøy, patentsøknad 20100159030 metoder for å detektere og module følsomheten av tumorceller til anti-mitotisk agenter og for å modulere TUMORGENICITY 06-24-2010. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
taxaner (inkludert paclitaxel og docetaxel) er etablert narkotika mye brukt i behandling av flere typer av faste tumorer, inkludert ovarie, bryst, lunge og hode- og halskreft, enten alene eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske midler. Den kliniske suksessen taxaner har gitt drivkraft til å søke etter andre nye legemidler med tilsvarende egenskaper, men med forbedret effektivitet. Epotiloner er en ny klasse av ikke-taxan mikrotubul-stabiliserende midler som har vist lovende antikreftaktivitet. Blant dem, epotilon B analoge, ixabepilone (BMS-247550, aza-EpoB) ble godkjent i 2007 av Food and Drug Administration for behandling av metastatisk eller lokalavansert brystkreft resistente mot antracykliner, taxaner og kapecitabin, enten enkeltvis eller i kombinasjon med disse midler [1]. Den naturlig forekommende epotilon B (patupilone, EPO906), har også vist seg lovende aktivitet i forskjellige prekliniske modeller som er resistente mot taksan-kjemoterapi og er for tiden under fase II /III kliniske studier [2], [3], [4], [5]. Til tross for liten strukturell likhet mellom epotilonene og taxaner, begge midler har samme eller en overlappende bindingssete på β-tubulin [6], [7]. I likhet med taxaner, epotiloner indusere microtubule bunting [6], undertrykke mikrotubulidynamikk; som fører til inhibering av celleproliferasjon og mitotisk blokk [8]. Selv epotiloner og taxaner stabilisere mikrotubuli mot depolymerization, viser de tydelige forskjeller i aktivitet og effekt (anmeldt i [9], [10]).
Begge epotiloner og taxaner kan stabilisere mikrotubuli mot depolymerization, men de viser klare forskjeller i aktivitet og effekt (gjennomgått i [9], [10]). Årsakene til forskjellene i aktivitet er dårlig forstått. Hittil har studier fokusert på ervervet resistens mot epotiloner bruker narkotika valgt populasjoner som viser flere resistensmekanismer herunder endringer i tubulin isotype uttrykk og mutasjoner i β-tubulin [11], [12], [13], [14]. Vi har tidligere beskrevet epotilon B analoge resistente leukemiceller som oppviser flere mikrotubul endringer slik som økt ekspresjon av SIII-tubulin, økt ekspresjon av MAP4, og mutasjoner i βI-tubulin [13]. Mens ervervet resistens mot epotiloner har blitt beskrevet, har forskning på indre faktorer som medierer følsomhet for epotilonene og relatert til mobil mål av stoffet, tubulin, vært mangelvare. Ettersom disse midler videre til klinikken er det viktig å forstå hvordan denne klassen av forbindelsen interagerer med tubulin forskjellige isotyper og hvordan iboende nivåer av disse proteiner påvirker effekten.
Ved hjelp av RNAi-teknologi, vi har tidligere vist at SIII-tubulin formidler følsomhet for paclitaxel og
Vinca
alkaloider i NSCLC celler [15]. Dempe ekspresjonen av βII- og βIVb-tubulin isotyper, på den annen side øke sensitiviteten av disse celler overfor
Vinca-alkaloider
men ikke paclitaxel [16]. Korrelerende bevis på at oppregulering av SIII-tubulin ikke medierer resistens mot epotilon B har også blitt rapportert [12]. Imidlertid overekspresjon av SIII-tubulin i HeLa-celler gjør cellene mindre følsom for epotilon B [17]. Det er ikke kjent hvorvidt differensial ekspresjon av β-tubulin isotyper innflytelse respons på epotilonene. Forstå dette samspillet er sterkt ønskelig for utvikling av prediktive markører for å gi mer skreddersydd behandling for NSCLC pasienter og andre pasienter som behandles med epotiloner.
For å undersøke den funksjonelle betydningen av disse p-tubulin isotyper som respons på epotilon B i NSCLC, vi ansatt RNAi teknologi for å spesifikt knockdown uttrykket av disse isotyper i to uavhengige NSCLC cellelinjer og karakterisere virkninger på cellen morfologi, følsomhet for epotilon B og legemiddelindusert apoptose.
Materialer og metoder
Cell kultur, siRNA transfeksjon og cellegift
H460 og Calu-6 celler ble oppnådd fra ATCC (Manasses, VA, USA) og vedlikeholdes som tidligere beskrevet [15]. Cellelinjene blir rutinemessig undersøkt og fri for mykoplasma. Alle transfeksjon prosedyrer ble utført som rapportert tidligere [15]. Styrken og spesifisitet av siRNAs rettet mot hver β-tubulin isotype er validert tidligere [15], [16]. Epotilon B (Calbiochem, Merck biovitenskap) var forberedt på et lager konsentrasjon på 100 mikrometer i DMSO.
immunfluorescens farging
Kort, siRNA-transfekterte Calu-6 celler som vokser i glass kammer lysbilder ble behandlet med epotilon B at de angitte konsentrasjoner i 1 time. Immunfluorescens farging av siRNA-transfekterte celler ble deretter utført som tidligere beskrevet [15], [16].
medikamentbehandlede klonogene analyser
medikamentbehandlede klonogene analyser ble utført som tidligere beskrevet [15 ], [16]. Resultatene ble uttrykt som en brøk overlevende og inhiberende dose (ID
50) ble ekstrapolert fra dose-responskurve ved bruk av GraphPad Prism-programmet [15], [16].
Cell syklus analyse
for analyse av DNA-innhold ved propidiumjodidfarging, H460 og Calu-6 celler ble sådd i 6-brønners plater som inneholder 6 × 10
4 celler per brønn og transfektert med siRNA. Etter 72 timers transfeksjon, ble cellene eksponert for epotilon B ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. På dagen for analysen ble både adherente og flytende cellene høstet, vasket med PBS og fiksert med 80% etanol i minst 24 timer ved 4 ° C. De fikserte celler ble så farget med en oppløsning inneholdende 50 ug /ml propidiumjodid og 2 ug /ml DNase-fri RNase i 30 minutter ved 37 ° C i mørket. DNA-innhold ble målt ved hjelp av et FACSCalibur flowcytometer (BD). Den Cellquest program ble anvendt for å kvantifisere fordelingen av celler i hver cellesyklus fase: sub-G
1 (død eller fragmentert), G
1, S og G
2-M [15], [ ,,,0],16].
apoptose assays
Cellular apoptose ble bestemt ved måling av kaspase 3/7 aktivitet ved anvendelse av caspase-Glo 3/7 assay som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [18], [19 ]. I korthet ble cellene transfektert med siRNA i 24 timer og på ny sådd ut i 96-brønners plater (5 x 10
3 celler /brønn) og tillatt å følge i ytterligere 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med varierende konsentrasjoner av epotilon i 24 timer. Etter behandling, ble celler inkubert med Caspase-Glo 3/7 reagens i 2 timer ved romtemperatur, og luminescens ble målt med et luminometer (PerkinElmer Victor 3). I tillegg apoptose ble også bestemt ved Annexin V-FITC farging kit (Becton Dickinson) som tidligere beskrevet [15], [19].
Statistisk analyse
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM og analysert ved hjelp av ANOVA eller studentens
t
test etterfulgt av nonparametric Dunnett eller Mann-Whitney tester ved hjelp av GraphPad Prism-programmet. AP verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Differensial følsomhet for epotilon B etter βII-, βIII- eller βIVb-tubulin knockdown
spesifisitet av hver av den β-tubulin siRNA ble bekreftet ved proteinnivå (figur S1). I overensstemmelse med våre tidligere studier, βII-, βIII-, og βIVb-tubulin siRNA potent hemmet protein ekspresjon av hvert av disse målene henholdsvis uten å påvirke ekspresjonen av andre store p-tubulin isotyper i NSCLC-cellelinjer (figur S1) [15] [16]. For å undersøke effekten av disse p-tubulin isotyper som respons på epotilon B i NSCLC celler og for å kvantifisere eventuelle endringer i medikamentsensitivitet, ble medikamentbehandlede klonogene analyser utført. Knockdown av βII-tubulin-ekspresjon i både H460 og Calu-6 celler påvirket ikke følsomhet for epothilon B (Fig. 1A). I motsetning til dette, knockdown av SIII-tubulin signifikant sensibiliserte begge NSCLC-cellelinjer til (fig. 1B) epotilon B. Nylig har vi beskrevet utviklingen og karakteriseringen av H460-celler som er valgt for stabil ekspresjon av shRNA mot SIII-tubulin, og den økte følsomheten av disse cellene til paclitaxel, cisplatin og karboplatin dens analoge [19]. Viktigst, økt følsomhet for epotilon B ved hjelp av forbigående knockdown av SIII-tubulin ble også bekreftet ved hjelp av stabile H460 SIII-tubulin shRNA knockdown celler (Figur S2), ytterligere styrke våre funn med denne isotype. Interessant, knockdown av βIVb-tubulin betydelig redusert følsomhet for epothilon B i begge cellelinjer, sammenlignet med mock- og kontrollere siRNA-transfekterte celler (fig. 1C), som tyder på at tumorer som uttrykker høye nivåer av denne isotype kan være mer følsomme for epotilon B enn tumorer med lave nivåer av denne isotype.
klonogene analyser ble utført på mock (lukkede firkanter, heltrukket linje), tak siRNA (åpne firkanter, heltrukket linje) og spesifikk p-tubulin isotype siRNA-transfekterte celler (lukkede diamanter, stiplet linje) i to NSCLC cellelinjer, H460 (venstre panel) og Calu-6 (høyre panel). Grafene viser klonogene overlevelse (A) βII-tubulin; (B) SIII-tubulin og (C) βIVb-tubulin knockdown-celler utsatt for epotilon uttrykt som overlever fraksjon. Barer, middelverdi ± SEM fra minst fire individuelle analyser. Statistikk ble beregnet ved å sammenligne overlevende brøkdel av de knockdown celler med mock-transfekterte celler ved hver medikamentkonsentrasjon. *
P
0,05, **
P
. 0,01
Vi har også undersøkt ulike effekter av epotilon B på mikrotubuli og cellemorfologi i βII -, βIII- og βIVb-tubulin knockdown celler. Som vist i fig S3, alle ubehandlede siRNA-transfekterte celler viste ingen åpenbare endringer i mikrotubul-strukturer, i overensstemmelse med våre tidligere studier [15], [16]. Men epotilon B (5 nM) hadde en markert effekt på celler med SIII-tubulin utarmet mikrotubuli. Mikrotubulidynamikk bunter var mer fremtredende i SIII-tubulin knockdown celler. I motsetning til dette forble mikrotubul-nettverk i stor grad organisert og intakt i kontroll siRNA, βII- og βIVb-tubulin knockdown-celler ble behandlet ved samme konsentrasjon. Ved 20 nM epotilon B, både kontroll og βII-tubulin knockdown cellene begynner å stille mikrotubulidynamikk bunter sammenlignet med de βIVb-tubulin knockdowns. Disse funnene utfylle klonogene data og foreslår at cellene reagerte forskjellig på epotilon B etter spesifikke knockdown av hver enkelt β-tubulin isotype.
knockdown av SIII-tubulin reduserer epotilon B indusert cellesyklus arrest og forbedrer celledød
cellesyklusanalyse ble utført ved å bestemme hvorvidt knockdown av hver p-tubulin isotype påvirker cellesyklus profiler i nærvær av epotilon B i 24 timer. Ved behandling med konsentrasjoner så lave som 0,5 nM epotilon B, SIII-tubulin knockdown-celler viste en signifikant økning i sub-G
1 innhold, en indikasjon på celledød (fig. 2). En større forskjell ble observert med 20 nM epotilon B, med kontroll siRNA- og βII-tubulin siRNA-behandlede celler viste en markert G
2-M-blokk mens SIII-tubulin knockdown-celler viste en økning i sub-G
1 befolkningen (fig. 2). SIII-tubulin knockdown-celler hadde mindre celler akkumuler ved G2-M sammenlignet med kontroller, noe som tyder på at celledød kan inntreffe uavhengig av mitotisk stopp. Det er åpenbart at knockdown av SIII-tubulin sterkt øker følsomhet for epothilon B via økt celledød fordi den sub-G
en populasjon ble økt ved alle konsentrasjoner som ble testet. I βIVb-tubulin knockdown celler på den annen side, ble en lavere G
2-M-innhold observert sammenlignet med kontroll siRNA-behandlede celler i 20 nM epotilon B (Fig. 2). Under G
1 innhold ikke skiller mellom βIVb-tubulin knockdown og kontroll siRNA-behandlede celler på 20 nM. I motsetning til dette, knockdown av βIVb-tubulin, viste et lavere antall celler blokkert ved G
2-M og bekrefter derved reduksjon i følsomheten av disse cellene til å epotilon B.
Medikamentkonsentrasjonene ble angitt på toppen av figuren. Cellene ble høstet etter 24 timers medikamentbehandling, og deretter analysert for deres DNA-innhold ved strømningscytometri, som beskrevet i Materialer og Metoder. Representative figurer av fire uavhengige forsøk er vist. *
P
0,05, **
P
. 0,01
For å finne ut om epotilon B-indusert G
2-M cellesyklus forsinkelse ble forekommer ved tidligere tidspunkter, ble cellesyklusanalyse ved anvendelse av H460 og Calu-6 celler utført ved 4, 8 og 12 timer i nærvær eller fravær av epotilon B (20 nM). I nærvær av medikamentet, ble G
2-M cellesyklus-stans observert så tidlig som fire timer etter H460-celler (Tabell S1) og 8 timer for Calu-6-celler (Tabell S2) i både SIII-tubulin knockdown og kontroll-siRNA transfekterte celler. Ved 8 og 12 timer prosentandelen av H460-celler blokkert ved G
2-M var lavere enn kontrollen (tabell S1), selv om en lignende tendens ble ikke observert i Calu-6-celler (Tabell S2).
følsomhet for epotilon B korrelerer med graden av apoptose-induksjon
å adressere om økt eller redusert sensitivitet for epotilon B som er spesifikk for hver β-tubulin isotype var knyttet til apoptose-induksjon, målte vi caspase 3/7 aktivitet i disse celler etter 24 timers behandling. Kaspase 3/7 aktivitet i SIII-tubulin knockdown-celler ble øket i det minste to ganger i forhold til det i kontrollen siRNA-transfekterte celler ved alle konsentrasjoner som ble testet (Fig. 3). Den økte caspase aktivitet i SIII-tubulin knockdown celler korrelerte med økt celledød observert i disse cellene ved medikamentell behandling. I kontrast, forble caspase 3/7 aktivitet på bakgrunnsnivå i βII- og βIVb-tubulin knockdown celler, tilsvarende kontroll siRNA cellene ved ≤1 nM epotilon B. Viktigere var det en betydelig nedgang i caspase aktivitet i βIVb knockdown celler ved ≥2 nM, noe som tyder på βIVb-tubulin knock-out var mindre følsomme for epotilon-indusert apoptose.
siRNA-transfekterte H460-celler ble høstet etter 24 timers inkubering i nærvær eller fravær av epotilon B og deretter analysert for apoptose induksjon av caspase aktivitetsanalyse. Åpne barer: kontroll siRNA-transfekterte celler; lys grå solid barer: βII-tubulin knockdown celler; heldekkende svarte striper: SIII-tubulin knockdown celler; mørkegrå solid barer: βIVb-tubulin knockdown celler. Data representerer middel ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05; **
P
. 0,01
For å definere rollen som beta-tubulin isotyper i epotilon B-indusert apoptose videre, Annexin V-FITC farging ble også utført etter 48 timer behandling med epotilon B. Som vist i fig. 4A, behandling av SIII-tubulin knockdown H460-celler indusert apoptose fra en konsentrasjon så lav som 320 pM av epotilon B. Prosentandelen av apoptotiske celler var signifikant høyere i SIII-tubulin siRNA-behandlede celler enn i kontrollen, βII- eller βIVb- tubulin siRNA-behandlede celler ved alle konsentrasjoner som ble testet (fig. 4A). I motsetning til dette ble en høyere konsentrasjon av epotilon B er nødvendig for å indusere apoptose i βIVb-tubulin knockdown-celler sammenlignet med enten kontroll eller βII-tubulin siRNA-transfekterte celler (Fig. 4B). Til sammen kan disse dataene viser at økt apoptoseinduksjon være en av mekanismene bak overfølsomhet for epotilon B etter SIII-tubulin knockdown. Knockdown av βIVb-tubulin, på den annen side, redusert følsomhet for epothilon B-indusert apoptose-induksjon i NSCLC
åpne søyler: tak siRNA-transfekterte celler;. lys grå solid barer: βII-tubulin knockdown celler; heldekkende svarte striper: SIII-tubulin knockdown celler; mørkegrå solid barer: βIVb-tubulin knockdown celler. Merk epotilon B var i stand til å indusere apoptose i de SIII-tubulin knockodown celler ved konsentrasjoner så lave som 24:32 (A), mens høyere konsentrasjoner av epotilon B induserer signifikant lavere apoptose i βIVb-tubulin knockdown-celler (B). Data representerer middel ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. *
P
0,05; **
P
. 0,01
Diskusjoner
epotiloner representerer en ny klasse av mikrotubulidynamikk stabiliserende midler som potensielt kan gi en annen tilnærming til å overvinne paclitaxel motstand. Epotiloner har vist lovende klinisk aktivitet i en fase II studie i NSCLC pasienter [20] og har nylig blitt godkjent for bruk i metastatisk brystkreft. Det er ikke kjent hvordan denne klassen av forbindelsen interagerer med tubulin forskjellige isotyper og hvordan disse påvirker epotilon B følsomhet. Her i, viser vi at spesifikke p-tubulin isotypes forskjellig påvirke NSCLC celle følsomhet for epotilonene (tabell 1).
Selv om endret uttrykk for p-tubulin isotypes har vært forbundet mye med taxan motstand, begrenset informasjon er tilgjengelig på rollen til p-tubulin isotyper i følsomheten for epotiloner. I denne studien ble βII-tubulin ikke påvirke følsomhet for epothilon B i en av de to uavhengige NSCLC-cellelinjer som ble undersøkt, H460 og Calu-6-celler. Interessant, følsomhet overfor mikrotubul stabiliserende middel paklitaxel ikke ut til å påvirkes ved overekspresjon eller undertrykkelse av βII-tubulin uttrykk [16], [21]. Dette resultatet står i kontrast til vår forrige undersøkelse undersøker
Vinca
alkaloider, hvor undertrykkelse av βII-tubulin forbedrer følsomhet for disse midlene [16].
prekliniske og kliniske studier har tidligere vist at resistens til låns-TBAer er ofte forbundet med SIII-tubulin oppregulering (gjennomgått i [10], [22]). Det har vært spekulasjoner og samsvarende bevis for at de cytotoksiske effektene av epotiloner er uavhengige av SIII-tubulin uttrykk på grunn av sin aktivitet i SIII-tubulin overekspresjon celler
in vitro
og i humane xenograft modeller [9], [12] . Imidlertid har definitive bevis ikke blitt vist at epotilon aktivitet er helt uavhengig av SIII-tubulin uttrykk. Ved hjelp av RNAi teknologi, viser vi at knockdown av SIII-tubulin fører til en betydelig økning i følsomhet for epotilon B. I avtalen ble stabil overekspresjon av SIII-tubulin i HeLa celler funnet å gi resistens mot en rekke låns-TBAer inkludert epotilon B [17 ]. En rapport beskrev epotilon-resistente ovarie cancer cellelinjer med redusert SIII-tubulin uttrykk [12]. Resistens er multifaktorielle og ulike cellelinje modeller kan ta hensyn til forskjeller. Viktigere, andre endringer i beta-tubulin isotypes og βI-tubulin punktmutasjoner ble også observert i epotilon B-resistente cellelinjer [12], noe som tyder på at disse faktorene kan ha bidratt til resistent fenotype. Vi har tidligere beskrevet epotilon B analoge resistente leukemi-celler som viste flere mikrotubul endringer slik som økt ekspresjon av SIII-tubulin ekspresjon og βI-tubulin mutasjoner [13]. Hittil bidrag fra oppkjøpte epotilon B resistensmekanismer er ikke godt korrelert med iboende følsomhet for epotilonene. Det bør understrekes at de to uavhengige NSCLC-celler som anvendes i denne studien har hverken vært utsatt for før medikamentseleksjon heller ikke uttrykker P-glykoprotein (data ikke vist) og gir derfor en mulighet for å vurdere følsomhet for epotilon B gitt av hver av de β -tubulin isotyper undersøkt.
Interessant, mens banket ned SIII-tubulin hypersensitizes cellene til epotilon B, knockdown av βIVb-tubulin redusert følsomheten av NSCLC celler til epotilon B. Nylig, Cabral og medarbeidere har rapporterte at celler som overuttrykker βIVb-tubulin utviste en liten, men signifikant økning i følsomhet for epothilon A [23]. Tatt sammen med vår studie, kan βIVb-tubulin uttrykk være et gunstig terapeutisk indikator for epotilon B terapi. Vi har tidligere vist at knockdown av βII- og βIVb-tubulins i NSCLC celler er brukt i denne studien ikke signifikant innvirkning paclitaxel følsomhet, men fikk betydelig øke følsomheten for vinkaalkaloidene [16]. Derfor, til tross for paclitaxel og epotilon B deling overlappende bindingssteder på β-tubulin, βIVb-tubulin uttrykk nivåer utløse klare effekter på følsomheten til paclitaxel og epotilon B. Det er økende bevis som viser at bindingen av epotiloner og paclitaxel til tubulin kan ikke være identisk [13], [24]. Tydeligvis noen punktmutasjoner i β-tubulin subenheten konferere paclitaxel men ikke epothilon motstand i cellekultur modeller [7], [25], noe som tyder på at epotiloner og taxaner kan ha ulike interaksjoner med p-tubulin isotypes. En rasjonalisering for forskjeller i følsomhet indusert av β-tubulin isotype ekspresjon kan være relatert til aminosyre-forskjeller mellom isotyper. Beta-tubulin isotypes βI, βII, βIVa og βIVb, dele minst 95% identitet og har et begrenset antall ikke-konservative aminosyresubstitusjoner (figur S4) [26]. I motsetning til dette skiller SIII-tubulin så det deler bare 92% identitet med de ovenfor β-tubulin isotyper. Innenfor paclitaxel /epothilon bindende lomme, i βII og βIVb isotyper, Ser275 har vært innblandet som en formidler av paclitaxel diffusjon gjennom nanopores [27] og kan hydrogen bånd med Gln279 og Lys216, stabilisere M-loop (Fig. 5). I sin tur kan dette øke hydrogenbindingene som er observert mellom Arg276 til laktonet karbonyl og Thr274 til ketonet oksygen på C5 av epotilon A (og antagelig epotilon B). I SIII-tubulin, er det en Ser275Ala mutasjon som kunne destabilisere M-løkke og derved svekke Arg226 og Thr274 hydrogenbindinger med liganden, og bidrar til sin reduserte følsomhet. Men dette forklarer ikke forskjellig sensitivitet observert mellom SIII-tubulin og βIVb, som aminosyresekvensene er identifisert som å være viktig i den paclitaxel /epotilon bindende lomme, eller BNP-bindingssetet er ingen forskjell i disse to isotyper [24]. Den aktuelle studien kan ikke utelukke at differensial uttrykket av spesifikke p-tubulin isotypes påvirker binding av epotiloner til microtubuli veggen, eller gjennom stabilisering av kontakter mellom dimerer i forming protofilaments. Men en fersk studie med epotilon A viste det binder like godt til både βI- og SIII-tubulin [28]. En lignende studie undersøker binding av epotilon B og spesifikke p-tubulin isotypes ville være viktig å finne ut hvordan disse isotypes påvirke samspillet av dette stoffet med tubulin.
epotilon B er vist som pinner (lys grå karboner). Bindende lomme rester av 1TVK vises som pinner (mørkegrå karbonatomer). Ikke-polare hydrogener er utelatt for oversiktens skyld. Hydrogenbindinger er vist som stiplede grønne linjer. Ser275 kan danne 3 hydrogenbindinger med Gln292 og Lys216. Bilder som genereres i DS Modellering 3,0 (Accelrys®).
Antitumor aktivitet epotiloner formidles av undertrykkelse av mikrotubulidynamikk, mitotisk arrest på G
2-M cellesyklus fase etterfulgt av apoptose. For å møte de potensielle mekanismene bak differensial respons til epotilon B etter knockdown av en bestemt β-tubulin isotype, undersøkte vi tilbøyelighet av cellene til å gjennomgå legemiddelindusert cellesyklus og apoptose. Etter inkubering med epotilon B, viste SIII-tubulin knockdown en økning i sub-G
1 populasjoner (celledød), mens en reduksjon i G
2-M blokken når sammenlignet med kontroll siRNA-transfekterte celler. Knockdown av SIII-tubulin i betydelig grad kan redusere omfanget mitotisk blokk indusert ved inkubasjon med enten paclitaxel eller vinkristin [15], mens øke nivået av celledød. Effekten på epotilon B følsomhet kan ikke bare forklares ved en endring i mikrotubulidynamikk, som vi nylig demonstrert at mikrotubulidynamikk ikke endrer i H460 celler etter SIII-tubulin knockdown [29]. Sammen er disse studiene viser at knockdown av SIII-tubulin kan forsterke TBA-indusert celledød ved apoptose via en egen bane som er uavhengig av mitotisk arrest. En annen studie har vist at anti-tumor virkningene av paclitaxel, korrelerte med paclitaxel-indusert apoptose, men ikke med mitotisk stopp [30]. Epotiloner kan ha en lignende virkningsmekanisme. Interessant, βIVb-tubulin knockdown cellene hadde en nedgang i antall celler blokkert på G
2-M (epotilon B 20 nM) i forhold til kontroll og βII-tubulin knockdown celler, om enn på et nivå høyere enn βIII- tubulin knockdown celler. Men i motsetning til SIII-tubulin knockdown celler, βIVb-tubulin knockdown celler gjennomgå narkotika-indusert celledød på et tilsvarende nivå som kontroll og βII-tubulin knockdown celler. Videre, både caspase 3/7 aktivitet og Annexin V-farging viste at SIII-tubulin knockdown-celler hadde en signifikant økning i epotilon B-indusert apoptose-induksjon ved alle konsentrasjoner som ble testet. I kontrast, knockdown av βIVb-tubulin beskyttede celler mot epotilon B som gjenspeiles i redusert induksjon av apoptose. Derfor kan apoptoseinduksjon tjene som en av de mekanismer som ligger til grunn for øket eller redusert følsomhet observert med disse spesifikke p-tubulin isotyper som respons på epotilon B.
molekylær forbindelse mellom β-tubulin og epotilon B-indusert apoptose gjenstår å bli etablert. Det har vist seg at nylig epotilon B-indusert apoptose i humane neuroblastom-celler ved å øke dannelsen av reaktive oksygenarter fra mitokondrier og deretter relocalization av proapoptotiske protein Bim i mitokondriene rommet [31]. Fremtidige undersøkelser vil avgjøre om ROS generasjon og mitokondrier eller uttrykk for ulike pro- og antiapoptotic proteiner er ansvarlig for evnen til SIII-tubulin eller βIVb-tubulin til forskjellig påvirke epotilon B-indusert apoptotiske signaler, og om disse signalene opptrer uavhengig av mitotisk arrest .
betydningen av differensial β-tubulin isotypes i følsomhet for epotilon B krever videre validering i klinisk setting å vurdere anvendelsen i å forutsi effekten av epotilon B. det vil også være av stor interesse for å avgjøre om uttrykket av βIVb-tubulin korrelerer med klinisk respons i krefttyper med epothilon, som er basert på resultatene i denne studien, svulster med høy βIVb-tubulin nivåer forventes å være mer følsomme for denne agenten.
til sammen disse resultatene viser at β-tubulin isotype sammensetningen av en celle berører følsomhet for epothilon B. kliniske studier er garantert å bedømme den terapeutiske verdi av differensiell ekspresjon av p-tubulin isotyper i NSCLC og deres rolle i klinisk respons på epotilonene.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
siRNA rettet mot βII, SIII eller βIVb-tubulin demper spesielt til uttrykk i H460 og Calu-6 NSCLC celler. Representative western blot som viser siRNA målretting βII (A), SIII (B), eller βIVb-tubulin (C) inhiberer dets protein ekspresjon i H460 og Calu-6 NSCLC-celler sammenlignet med celler behandlet med kontroll siRNA eller Mock (lipofektamin 2000) . Det ble ikke observert signifikante endringer i uttrykket av andre β-tubulin isotypes. Glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) ekspresjon ble anvendt som en kontroll lasting. Representative geler.
