Abstract
En kombinasjon av molekylær målrettede kreft bildebehandling og terapi er en ny strategi for å bedre kreftdiagnose og redusere bivirkningene av konvensjonelle behandlinger . Her, genererte vi et rekombinant protein, EC1-Gluc-p53C, ved å fusjonere EC1 peptid, en kunstig ligand av ErbB2, med
Gaussia
luciferase (Gluc) og en p53-aktivering peptid, p53C. EC1-Gluc-p53C ble uttrykt og renset fra
E. coli
BL21.
In vitro
eksperimenter viste at EC1-Gluc-p53c var stabil i selvlysende aktivitet og selektivt målrettet ErbB2-overekspresjon BT474 celler for bioluminesens imaging. Videre er internalisert EC1-Gluc-p53C i BT474 celler utøves dens funksjon for å aktivere p53 og betydelig hemmet cellulær proliferasjon. I tumor-bærende mus, ble den ErbB2-målrettede bioluminescens avbildning og terapeutisk effekt av EC1-Gluc-p53C også observert spesielt i BT474-tumorer, men ikke i MCF7-tumorer, som ikke overuttrykker ErbB2. Dermed denne studien demonstrerer EC1-Gluc-p53C å være en effektiv theranostic reagens rettet mot ErbB2 for bioluminescence bildebehandling og kreftbehandling
Citation. Han XJ, Sun LF, Nishiyama Y, Feng B, Michiue H, Seno M, et al. (2013) Theranostic Protein Targeting ErbB2 for Bioluminesens Imaging og Terapi for kreft. PLoS ONE 8 (9): e75288. doi: 10,1371 /journal.pone.0075288
Redaktør: Xiaoyuan Chen, NIH, USA
mottatt: 18 april 2013; Akseptert: 12. august 2013, Publisert: 17.09.2013
Copyright: © 2013 Han et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd-i-hjelp for Unge Forskere (B) fra departementet for utdanning, vitenskap, sport og kultur fra Japan (No: 21790202, http: //www.waseda.jp/rps/en/manual/kaken hi_honbun.html) og av Grant-i-hjelpemiddel for Scientific Research fra Japan Society for Promotion of Science (No: 22,00119, http: //www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ErbB2 er et medlem av den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) familie av reseptor-tyrosin-kinaser, også kalt ErbB-familien. ErbB familien omfatter fire medlemmer, ErbB1, ErbB2, ErbB3 og ErbB4. Det er flere endogene ligander for ErbB-reseptorer, med unntak av ErbB2 [1]. Tyrosinkinaseaktiviteten av ErbBs kan aktiveres ved endogene ligander og homo- eller hetero-dimerisering av ErbB-reseptorer, som er involvert i regulering av cellulær proliferasjon og celleoverlevelse [1-3]. I tillegg har ErbB2 vært implisert i patogenesen tumorprogresjon og [4-6]. Klinisk er overekspresjon av ErbB2 forbundet med ca 30% av brystkreft, eggstokk-kreft [7] og andre vanlige typer kreft, inkludert lungekreft, magesekken, og oral cancer [8]. Overekspresjon er også forbundet med metastase, terapeutiske motstand og dårlig prognose av kreft [9-11]. Således kan ErbB2 være en lovende molekylære mål for kreft avbildning og behandling ved hjelp av monoklonale antistoffer og peptid-målsøkende vektorer [12,13]. I et fagdisplay studie ble flere små kunstige sykliske peptider med spesifikk affinitet for ErbB2 identifisert. EC1, en av disse kunstige peptider bundet til det ekstracellulære domenet av ErbB2 i levende celler og ferske frosne humane brystcancerprøver [14]. Videre biotin-konjugert EC1 og det rekombinante protein EC1-EGFP beholdt for ErbB2-affinitet og ble internalisert av ErbB2-overekspresjon cancerceller [14,15]. Nylig ble toverdige og flerverdige former av EC1-Fc-ligand i liposomer rapportert å forbedre affiniteten til ErbB2 og forbedre internalisering [16]. Således kan EC1 peptid være en potensiell kunstig ligand for målretting mot ErbB2.
I tumor patogenese, flere unormale mutasjoner er funnet i tumor-suppressor-gener. En av de mest kjente tumor-suppressor-gener er
p53
, noe som er en viktig regulator av apoptose, og den mest vanlige muterte genet i cancer [17,18]. Restaurering av p53 aktivitet har vist seg å være et effektivt middel for å behandle kreftceller med p53 mutasjoner [19,20]. I våre tidligere studier [21-23], ble en full-lengde rekombinant p53 levert inn i menneskelige ondartede glioma celler, muntlig og blæren kreftceller ved å fusjonere med poly-arginin, en celle-gjennomtrengende peptid (CPP). Det ble funnet at den full-lengde rekombinant p53 hadde en signifikant inhiberende virkning på proliferasjonen av kreftceller. Imidlertid, den store molekylstørrelse og rask nedbrytning av ubiquitin-proteasom-reaksjonsveien sterkt påvirket effektiviteten av protein transduksjon og effekten av transduserte p53 på kreftceller [24]. Den C-terminale ende av p53 er en lysin-rik domene gjenstand for en rekke modifikasjoner posttranslational [25,26]. Et peptid som stammer fra C-terminalen aktiverer spesifikke DNA-binding til p53
in vitro
gjennom en ukjent mekanisme [27]. Det ble rapportert at p53-avledet C-terminale peptid (p53C) indusert hurtig apoptose i brystkreftceller som bærer endogene p53-mutasjoner eller overuttrykt villtype (wt) p53, men var ikke toksisk for ikke-ondartede humane cellelinjer inneholdende wt p53 [28 ]. I tillegg p53C peptid fusjonert med CPP hemmer proliferasjonen av kreftceller ved reaktive endogen p53, og øker levetiden i dyremodeller av terminal peritoneal karsinomatose og blærekreft
in vivo product: [29-31] betraktelig. Disse studiene viser reaktivering av p53 protein ved p53C peptid å være en lovende middel for kreftbehandling.
Bioluminesens bildefremstår som en relativt enkel, kostnadseffektiv og ekstremt følsom måte å overvåke dynamiske biologiske prosesser i intakt celler og levende dyr [32]. De siste årene har teknologien utviklet seg raskt med forbedringer i luciferase journalister og instrumentering [33]. De vanligste luciferases for bioluminesens bilde inkluderer
Firefly
luciferase (Fluc),
Renilla
luciferase (RLuc) og
Gaussia
luciferase (Gluc). Hver luciferase har forskjellige egenskaper i anvendelsen av bioluminesens imaging. Fluc (62 kDa) katalyserer oksydasjonen av luciferin for å gi bioluminescens i nærvær av O
2, magnesium og ATP [34]. RLuc (36 kDa) og Gluc (19,9 kDa) katalyserer den oksydative dekarboksylering av coelenterazine å sende ut lys uavhengig av ATP. Imidlertid har RLuc en lavere kvanteutbytte enn Fluc, og også mindre enzymatisk effektivitet [35,36]. Gluc gir ca 200- (
in vivo
) til 1000 ganger (
in vitro
) mer bioluminesens i pattedyrceller enn Fluc og RLuc [37]. Derfor, sine små molekylære størrelse (19.9kDa), uavhengighet fra ATP og sterk utslipps gjøre Gluc mye mer egnet for bioluminesens bilde
in vitro Hotell og
in vivo product: [38,39].
begrepet «Theranostic» ble startet av Funkhouser i 2002 fra en av hans vurderinger [40]. Theranostics er definert som et materiale som kombinerer modalitetene for behandling og diagnostisk avbildning på samme tid i løpet av den samme dose. Målet med theranostic er å donere materialer med kapasitet av å overvåke det behandlede vev og effekten på lang sikt periode [41]. Theranostic reagenser er utviklet raskt i det siste tiåret, spesielt etter fremveksten av noen nye optiske sonder og potente biomolekyler for målretting og terapi. I denne studien ble en roman ErbB2 målretting bioluminescence protein konstruert ved å fusjonere EC1 med Gluc og p53C peptid. To menneskelige brystkreft cellelinjer, MCF7- uten uttrykk for ErbB2 og BT474 overekspresjon ErbB2, ble ansatt for å vurdere rollen til EC1-Gluc-p53C i bestemte bioluminescence bildebehandling og kreftbehandling. Vi observerte at EC1-Gluc-p53C ikke bare målrettet ErbB2 for bioluminesens imaging, men også selektivt hemmet celledeling og tumorvekst av BT474
in vitro Hotell og
in vivo
. De foreliggende resultatene indikerer at EC1-Gluc-p53C kan være en lovende theranostic reagens rettet mot ErbB2 for bioluminescence bildebehandling og terapi.
Materialer og metoder
Cell kultur og påvisning av ErbB2 uttrykk
MCF7 og BT474-cellelinjer ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC). BT474-celler bærer en missense mutasjon (E285K) i p53-genet [42], mens MCF7-celler med overekspresjon av vill p53 [28]. BT474-celler ble dyrket i et RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 pg /ml penicillin-streptomycin (P /S). MCF7-celler ble dyrket i DMED medium supplert med 10% FBS og 100 ug /ml P /S. Mediene, FBS og P /S var fra Invitrogen. Alle kulturer ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C med en atmosfære inneholdende 5% CO
2.
ekspresjon av ErbB2 i MCF7 og BT474-celler ble undersøkt ved Western immunoblotting. Kort sagt ble MCF7 og BT474-celler på 35 mm tallerkner vasket en gang med PBS, og skrapet i en x SDS-prøvebuffer. Cellelysater ble utsatt for 6% SDS-PAGE, og immunoblottet med kanin anti-ErbB2-antistoff (1: 1000; Cell Signaling) over natten ved 4 ° C. HRP-konjugert sekundært antistoff (Sigma-Aldrich) ble anvendt ved 1: 2000. Immunoblotting signaler ble oppdaget av Versa Doc 5000 bildesystem (Bio-Rad) med en forbedret chemiluminescence deteksjon kit (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA).
Plasmid bygging
pGLuc plasmid ble kjøpt fra LUX bioteknologi Ltd (Scotland, UK). Den Gluc-genet ble amplifisert fra plasmidet ved anvendelse av en følelse primer (5′- GGATCCGAAACCAACTGAAAACAATGAAG-3 «) og antisense-primer (5′-GTCGACATCACCACCGGCACCCTTTAT-3′). PCR-produktet ble ligert inn i pCR2.1-TOPO vektor (Invitrogen) for forsterkning, og reklonet i pET52b vektoren (Invitrogen) for å konstruere Gluc-pET52b. Følgende fornuft og antisense oligonukleotider (Hokkaido System Science, Japan) med passende motstand enzym nettsteder for EC1 eller p53C peptid var forberedt; for EC1; 5»-GGGTGGACTGGCTGGTGCCTGAATCCAGAAGAATCTACTTGGGGATTCTGTACTGGATCTTTCGGTGGAGGTAGTTCAG-3 «(forstand, indikerer understreking
Sam
jeg og
Bam
HI nettsteder) og 5′-GATCCTGAACTACCTCCACCGAAAGATCCAGTACAGAATCCCCAAGTAGATTCTTCTGGATTCAGGCACCAGCCAGTCCACCC-3′ (antisense, indikerer understreking
Bam
HI og
Sam
-seter), og for p53C; 5’TCGACGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAAGGCGC-3 «(forstand, indikerer understreking
Sal
Ⅰand
ikke anbefale Ⅰsites), og 5′-GGCCGCGCCTTTTTTATGGCGGGAHHTAGACTGACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGTGAGCCCTGCTCCCG-3′ (forstand, indikerer understreking
Ikke
ⅰand
Sal
ⅰsites). De oligonukleotider for EC1 og p53C ble modifisert ved fosforylering ved 5 «. De sense- og antisense oligonukleotider (10 pmol hver) ble ko-inkubert ved 95 ° C i 10 minutter, og glødet ved romtemperatur for å danne dobbelttrådet DNA. Den dobbelt-trådet DNA for EC1 eller p53C ble ligert til Gluc-pET52b behandlet med de riktige motstands enzymer for å konstruere EC1-Gluc-pET52b eller EC1-Gluc-p53C-pET52b. Seterettet mutagenese ble innført ved BamHI i EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C bruker en QuikChange kit (Stratagene) i henhold til produsentens instruksjoner. Primerne for mutagenese var 5»-GTGGAGGTAGTTCAGGAACCAAACCAACTG-3 «(forstand, angir understreking den muterte nukleotid), 5′-CAGTTGGTTTGGTTCCTGAACTACCTCCAC-3» (antisens). Gluc, EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C ble deretter subklonet inn pGEX-6p-en mellom
Bam
HI og
Eco
RI nettsteder for protein rensing. Sekvensene til konstruerte plasmider ble bekreftet ved bruk av en ABI 3100 sequencer.
Ekspresjon og rensing av rekombinante proteiner
Ekspresjon og rensing av rekombinante proteiner ble utført som beskrevet tidligere [21]. Kort,
E. coli
BL21 (DE3) transformert med plasmidet for Gluc, EC1-Gluc eller EC1-Gluc-p53C ble dyrket i et LB-medium inneholdende 100 ug /ml ampicillin ved 37 ° C. Når OD600 nådde 0,6, ekspresjon av GST-fusert protein ble indusert ved tilsetning av 0,2 mM isopropyl-1-tio-β-D-galaktopyranosid ved 25 ° C over natten. Fusjonsproteinene ble renset ved anvendelse av en kolonne av glutation Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). For å holde seg GST fra fusjonsproteiner, ble de rensede proteiner videre behandlet med PreScission protease (GE Healthcare) i henhold til produsentens instruksjoner. Rekombinante proteiner ble utsatt for 15% SDS-PAGE, og bekreftet av Coomassie brilliant blå flekker og immunoblotting med kanin anti-
Gaussia
Luciferase serum (1: 1000, Nanolight). Proteinene ble til slutt dialysert mot PBS, og konsentrasjonene ble bestemt ved anvendelse av et proteinanalysesett (Bio-Rad Laboratories). Alikvoter av proteinet ble lagret ved -80 ° C før bruk.
Fremstilling av coelenterazine (CTZ)
Substratet for Gluc ble fremstilt som tidligere beskrevet [32]. I korthet CTZ (Nanolight) ble oppløst i surgjort metanol (1 dråpe konsentrert HCl (12,4 N) i 10 ml metanol) til en konsentrasjon på 5 mg /ml. Aliquoter av 100 pl ble lagret ved -80 ° C. For luminescens avbildning, ble alikvoter av CTZ (5 mg /ml) ble fortynnet med PBS (inneholdende 5 mM NaCl, pH 7,2) for høyere lysutbytte og mer stabilitet.
Analyser av det luminiserende aktivitet og stabilitet av rekombinante proteiner
å bestemme den luminescerende aktiviteten til de rensede proteiner, 2 ug av hvert protein ble overført til en 96-brønns plate. Bioluminesens ble målt ved anvendelse av en plate luminometer (Microlumat pluss LB 96V, Berthold teknologier) etter tilsetning av 10 ul CTZ (20 uM). Bioluminescent aktivitet ble rapportert i relative lysenheter (RLU), målt med et 10 sekunders integrasjonstid og beregnet som RLU pr mikromol for hvert protein. Verdiene for EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C var normalisert med Gluc.
Stabiliteten av rekombinante proteiner ble vurdert som beskrevet tidligere [38]. Alikvoter av proteinet ble inkubert med et likt volum av museserum (Sigma) ved 37 ° C. På hvert tidspunkt ble prøver tatt ut for bioluminescens avbildning og Western blotting. I analysen av Bioluminescens stabilitet, ble prosentandelen av den opprinnelige mengde av RLU ved hvert tidspunkt er plottet for hvert protein. For å detektere nedbrytningen av proteiner etter inkubasjon med serum, ble prøver tatt ut ved hvert tidspunkt underkastet elektroforese på 15% akrylamid SDS-PAGE-gel, og immunoblottet med kanin anti-
Gaussia
Luciferase-serum ved en fortynning på 1: 1000. HRP-konjugert sekundært antistoff (kanin, Sigma-Aldrich) ble benyttet på 1: 2000
Bioluminesens bildebehandling
in vitro
, Intern av ErbB2-overekspresjon celler og WST-1-analysen
.
For bioluminesens bilde
in vitro
, MCF7 og BT474 celler ble dyrket på 35 mm glassbunn retter. For å forbedre etterlevelse av MCF7 og BT474 celler, alle glassbunn retter ble pre-belagt med laminin (Roche). MCF7 og BT474-celler ble inkubert med 1 uM av hvert protein i 24 timer. Etter tre vaskinger med DMEM, ble bioluminescens detektert med et Olympus Luminoview LV-200 (Bio-luminescens mikroskop) umiddelbart etter tilsetning av 1 mg /ml CTZ i serumfritt DMEM. Bilder ble kjøpt og analysert med Metamorph programvare (Molecular Devices).
For å undersøke internalisering av EC1-smeltet proteiner i ErbB2 overekspresjon kreftceller, ble BT474 celler inkubert med 1 mikrometer av Gluc, EC1-Gluc eller EC1- Gluc-p53C. I blokkering av studien ble BT474-celler behandlet med anti-ErbB2-antistoff mot ekstra-cellulære domene av ErbB2 (kylling, 1,0 ug /mL, Abcam) 1 time før inkubering med EC1-Gluc eller EC1-Gluc-p53C. Etter 24 timer ble cellene vasket med PBS tre ganger, og trypsinisert. Cellelysat ble fremstilt og utsatt for 15% SDS-PAGE. Internalisering av fusjonsprotein ble immunoblottet med kanin anti-
Gaussia
Luciferase serum. β-actin ble brukt som en endogen kontroll.
For å evaluere den terapeutiske effekten av EC1-Gluc-p53C
in vitro
, celle levedyktighet ble bestemt ved hjelp av en WST-en analyse som beskrevet tidligere [ ,,,0],21]. Etter 3,0 x 10
3 MCF7 og 1,0 x 10
4 BT474-celler ble sådd på 96-brønners flatbunnede plater, de ble dyrket i DMEM, eller RPMI1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum i 24 timer. Cellene ble deretter supplert med 1 uM av protein eller PBS (day0) og ytterligere dyrket 96 h (Dag 4). Celleviabilitet fra dag 0 til dag 4 ble målt ved bruk av WST-1-analysen i henhold til produsentens instruksjoner (Roche Applied Science). For å bestemme den doseavhengige effekt av EC1-Gluc-p53C på proliferasjonen av BT474-celler, ble det protein som brukes ved 0,1 ~ 2,0 pM, og den WST-1-analysen ble utført på dag 4.
Reporter Assay for p53-drevet trans
reporteren analysen ble utført som beskrevet tidligere [22]. Kort, luciferase reporter vektor pGL2-basic (Promega) som inneholder en 2,4 kbp fragment av den menneskelige p21
WAF1
arrangøren var en gave fra legene. T. Akiyama (Tokyo University) og K. Yoshikawa (Osaka University). BT474 celler dyrket inntil 80% sammenflytende i 35 mm diameter retter ble transfektert med luciferase reporter vektor av lipofektamin 2000 (Invitrogen). Etter 24 timer ble cellene inkubert med 1 uM av Gluc, EC1-Gluc, EC1-Gluc-p53C eller det samme volum av PBS i 24 timer, og ytterligere dyrket i et nytt medium 2 t før innhøsting celle. Cellelysatet ble brukt for å måle luciferaseaktiviteten med et luminometer og Luciferase Assay System (Promega). Bakgrunnen luciferaseaktivitet ble subtrahert i alle forsøk. Fem uavhengige eksperimenter ble utført for hver betingelse.
Fremstilling av tumor-bærende mus
naken mus (Balb /c Slc-nu /nu, hunn, 6 ~ 8 uker) ble innkjøpt fra Charlesriver , Japan. Planen av dyreforsøk ble gjennomgått og godkjent av etisk komité for dyreforsøk av Okayama-universitetet under IDer OKU-2010378, OKU-2011400. 17β-østradiol pellets (0,72 mg; Innovative Forsknings of America) ble implantert 4 dager før tumorcelletransplantasjon og holdt seg på plass inntil slutten av studien. De dyrkede MCF7 og BT474-celler ble vasket to ganger med PBS, typsinized, og høstet ved sentrifugering. Celler (5,0 x 10
6 celler) suspendert i Matrigel (BD Bioscience) ble transplantert subkutant i begge flanker av bedøvede mus med intraperitoneal injeksjon av 5 mg /100 g pentobarbital oppløsning under aseptiske betingelser. Mus med svulster som er utviklet for 10 ~ 14 dager ble brukt til
in vivo
eksperimenter. Under tumorutviklingen, ble pusten og adferdsaktivitet overvåkes to ganger hver dag for å vurdere smerter hos mus. Forsøk ble umiddelbart stanset hvis mus dukket betydelig symptom på smerte. Alle mus ble avlivet ved intraperitoneal injeksjon av 15 mg /100 g pentobarbital løsning etter forsøkene.
ekspresjon av ErbB2 i MCF7 og BT474-xenotransplantater ble bekreftet ved immunofluorescens (IF) farging. Parafininnstøpte stykker av tumorer ble fremstilt i en tykkelse på 5 um. Først ble histologiske observasjoner av xenopodet svulster laget ved hjelp av H E farging. HVIS farging ble deretter utført med anti-ErbB2-antistoff (1:50; Cell Signaling). Det sekundære antistoffet var Cy3-konjugert anti-kanin-IgG (1: 100; Invitrogen, Molecular Probes). Kjernen var kontra farget med 0,1 ug /ml Hoechst 33248 (Sigma) i 5 minutter. Fluorescens signaler ble observert ved hjelp av et konfokal laser mikroskop (FV300, Olympus).
Tumor nettstedet oppbevaring av EC1-Gluc-p53C i tumorxenotransplantater
Neste, 30 mL av EC1-Gluc-p53C protein (0,5 ug /ul) ble injisert inn i intratumorally MCF7 og BT474-xenotransplantater i nakne mus. Ved 1, 3, 6, 12 og 24 timer etter injeksjonen, ble musene avlivet. Svulster ble skåret ut og umiddelbart fast med 4% paraformaldehyde. Parafininnstøpte skiver MCF7 og BT474 svulster var forberedt på 10 mikrometer. Immunofluorescens-farging ble gjennomført for å analysere fordelingen av EC1-Gluc-p53C i tumorer. Den immunfluorescens farging ble utført i henhold til instruksjonene som fulgte med kanin anti-
Gaussia
Luciferase serum. Det sekundære antistoffet var FITC-konjugert kanin-IgG (1: 100, Invitrogen, Molecular Probes). Fluorescens signaler ble observert ved hjelp av et konfokal laser mikroskop (FluoView, Olympus, Japan).
Bioluminesens bildebehandling
in vivo
For bioluminesens bilde
in vivo
, 30 ul EC1-Gluc-p53C protein (0,5 ug /ul) ble intratumorally injisert i MCF7 og BT474-xenografter ble etablert i nakne mus. På 6, 8, 12 og 24 timer etter injeksjonen ble musene fotografert ved injeksjon via en halevene med 100 ul CTZ-løsning (3 mg /kg) under bedøvelse ved hjelp av et avkjølt CCD-kamera (IVIS Lumina-II, Caliper Life Sciences ) som tidligere beskrevet [39]. Bioluminescent intensiteten av det valgte området over tumoren ble registrert som maksimal fotoner s
-1 cm
-2 steradian
1.
Effekt av EC1-Gluc-p53C på tumorvekst
MCF7 og BT474 xenografter på begge flankene av nakne mus fikk lov til å vokse til en gjennomsnittlig volum på ~ 100mm
3 ± 10mm
3 ble innhentet før protein injeksjon. Deretter, 30 pl av renset rekombinant protein (0,5 ug /ul) eller 30 ul av PBS ble injisert i intratumorally MCF7 og BT474 xenotransplantater hver dag i 5 dager. Musene ble overvåket daglig, og deres tumorvolum ble målt ved hjelp av digitale vernier calipers to ganger i uken. Under hele behandlingsforløpet i tumorbyrde eksperiment døde ingen mus. Tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen: tumorvolum = L x W
2 x 0,5 (L er den lengste diameter, W er den korteste diameter)
Statistisk analyse
data. er vist som gjennomsnitt ± SD eller gjennomsnitt ± SEM Data ble analysert ved hjelp av enten Student t-test for å sammenligne to forhold eller ANOVA etterfulgt av planlagte sammenligninger av flere forhold, og P 0,05 ble ansett å være betydelig
Resultater
Rensing og biokjemisk karakterisering av. de rekombinante proteiner
de tre GST-smeltet protein konstruksjonene ble uttrykt i
E. coli BL21
og renses ved hjelp av en kolonne av glutation Sepharose 4 Fast Flow. Etter rensing ble GST-tag spaltes av protease PreScission å høste Gluc, EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C som vist i Figur 1a. Gluc og EC1-Gluc ble anvendt som kontrollproteiner. Coomassie brilliant blå farving viste renheten av alle tre proteiner for å være 80%. De molekylære størrelser av Gluc, EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C var tilnærmet 20, 23, og henholdsvis 25KDa, (figur 1b). I Western blotting, ble de viktigste bånd av Gluc, EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C og flere mindre bånd tilsvarende de GST-fusert proteiner observert (figur 1c). Dessuten ble et tap i bioluminescent aktivitet indusert ved fusjon av EC1 og p53C peptid med Gluc. En tilnærmet 30% og 50% reduksjon ble detektert i bioluminescent aktiviteten til EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C sammenlignet med Gluc, henholdsvis (figur 1d).
a) Schema for rensing av EC1-Gluc -p53C med GST uttrykk system. GST tag ble spaltet av PreScission protease etter rensing. b) Coomassie brilliant blå farving av rensede proteiner etter 15% SDS-PAGE. Lane 1 ~ 4 er markør, Gluc, EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C, henholdsvis. c) De rensede proteiner etter 15% SDS-PAGE ble oppdaget ved hjelp av Western blotting med kanin anti-
Gaussia
Luciferase serum. Lanes 1 ~ 3 er Gluc, EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C, henholdsvis. d) Bioluminescent aktivitetene av de rensede proteiner. Hvert protein (2 ug) ble evaluert ved hjelp av en plate luminometer. Bioluminescent verdier av EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C ble normalisert med Gluc. n = 6 hver, * p. 0,01
Stabiliteten Gluc, EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C ble evaluert ved inkubasjon i museserum ved 37 ° C. Stabiliteten av Gluc ble forbedret ved fusjon av EC1 og p53C. Halveringstiden av det luminiserende aktiviteten av Gluc ble bestemt som 18,6 timer, mens det av EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C var 189,5 og 216 timer, respektivt (figur 2a). Som et resultat, bioluminescent aktiviteten av EC1-Gluc-p53C nådde 92% av det Gluc i 3 timer etter inkubering i serum (figur 2b). I tillegg ble nedbrytningen av de tre proteinene i serum også undersøkt ved Western blotting ved anvendelse av anti-Gluc-antistoff. Alle tre proteinene var stabile mot nedbrytning når inkubert i serum ved 37 ° C (figur 2c). Disse resultatene tyder på bioluminescent aktivitet og stabilitet av EC1-Gluc-p53C for å være egnet for anvendelse både
in vitro
og
in vivo
.
Proteiner inkubert med et likt volum av museserum ved 37 ° C ble tatt ut ved de angitte tidspunkter for bioluminescent aktivitet evaluering (a) og Western blotting (c). b) bioluminescent aktiviteten av EC1-Gluc-p53C og Gluc ble undersøkt i 3 timer etter inkubasjon i serum. Bioluminescent verdier av EC1-Gluc-p53C ble normalisert med Gluc. n = 6 hver.
EC1-Gluc-p53C retter seg mot ErbB2 for bioluminesens bilde
in vitro
To menneskelige brystkreft cellelinjer, MCF7 og BT474, var brukes til å evaluere ErbB2 målrettede bildebehandling
in vitro
. Overekspresjon av ErbB2 i BT474 ble bekreftet ved Western-blotting, mens ekspresjonen av ErbB2 i MCF7-celler var ikke målbart (figur 3a). For å detektere den ErbB2-målrettede bioluminescens, ble MCF7 og BT474-celler behandlet med 1 pM av de rekombinante proteiner. Et sterkt signal ble påvist i ErbB2-overekspresjon BT474 celler inkubert med EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C (figur 3b, figur S1). I motsetning til dette ble ingen signifikant bioluminescens observert i MCF7-celler inkubert med hvert protein (figur 3b, figur S1). Videre, internalisering av de rekombinante proteiner ble også observert i BT474-celler inkubert med EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C, og internalisering av EC1-fuserte proteiner var for det meste umulig å oppdage, da den ekstra-cellulære domenet av ErbB2 ble blokkert av anti- ErbB2-antistoff (figur 3c). Disse resultatene tyder på at EC1-Gluc og EC1-Gluc-p53C beholde affinitet for ErbB2, og blir internalisert i ErbB2-overekspresjon celler
in vitro
.
a) Uttrykk for ErbB2 i MCF7 og BT474 celler. Cellelysat av de to cellelinjene ble utsatt for 6% SDS-PAGE og immunoblottet med anti-ErbB2-antistoffet. β-aktin ble benyttet som en endogen kontroll. b) Bioluminesens bilde
i
vitro
. Celler inkubert med 1 pM av EC-Gluc-p53C ble vasket med kulturmedium uten serum. Bilder ble ervervet med et biolumine-mikroskop umiddelbart etter tilsetning av 1 mg /ml CTZ. I og III, Bioluminescens bilder; II og IV, fase-kontrast. Bar = 100 mikrometer. c) internalisering av EC1-smeltet proteiner til ErbB2-overekspresjon BT474 celler. Celler ble inkubert med 1 pM av protein i 24 timer, Felt 1: Gluc; lane 2: EC-Gluc-p53C; spor 3: EC-Gluc; lane 4: anti-ErbB2 + EC1-Gluc-p53C; lane 5: anti-ErbB2 + EC-Gluc. Internalisering av fusjonsprotein ble immunoblottet med kanin anti-
Gaussia
Luciferase serum. β-aktin ble benyttet som en endogen kontroll.
EC1-Gluc-p53C selektivt inhiberer proliferasjon av ErbB2-overekspresjon BT474-celler
WST-1-assay ble anvendt for å evaluere virkningen av rekombinante proteiner på spredning av MCF7 og BT474-celler. EC1-Gluc-p53C vesentlig hemmet proliferasjonen av BT474 men ikke MCF7 celler på dag 3 og 4 (figur 4a). Styre proteiner, Gluc og EC1-Gluc, hadde ingen signifikant effekt på proliferasjonen av enten cellelinje (figur 4a). Videre virkning av EC1-Gluc-p53C på proliferasjonen av BT474 var doseavhengig (figur 4b). I tillegg er resultatene av luciferase reporter Assay for p53-drevne transaktivering indikerte at p53C peptid var aktiv og reaktivert endogen p53 når internalisert i BT474-celler (figur 4c). Tatt sammen tyder disse resultater på at den hemmende effekten av EC1-Gluc-p53C på proliferasjon av kreftceller har en ErbB2-målsøkende egenskap, og er på grunn av effekten av p53C peptid i fusjonsproteinet.
a) Tid -avhengige endringer i spredning av MCF7- (topplaten) og BT474 (nederst panel) celler. Celler ble supplementert med 1 pM av hver rekombinant protein eller PBS (kontroll) på dag 0, og ytterligere dyrket 96 h (dag 4). Cellulær proliferasjon ble bedømt ved den WST-1-analysen hver 24 timer. ♦, PBS (kontroll); ■, Gluc; ▲, EC1-Gluc; ×, EC1-Gluc-p53C. n = 6 hver. * P 0,05 og ** p 0,01 vs kontroll. b) Doseavhengig effekt av EC1-Gluc-p53C på proliferasjonen av BT474-celler. BT474-celler ble behandlet med EC1-Gluc-p53C ved forskjellige konsentrasjoner eller PBS (forts.), Og WST-1-analysen ble utført på dag 4. n = 6 hver. *, P 0,05; **, P 0,01. c) p53-drevet transkripsjonen aktivitet med p21
WAF1
luciferaseaktivitet reporter analysen. BT474-transfektert med luciferase reporter vektor ble inkubert med 1 uM av Gluc, EC1-Gluc, EC1-Gluc-p53C eller PBS i 24 timer. p21
WAF1
luciferaserapportørplasmid aktiviteter i cellene ble målt med Luciferase Assay System. Data er presentert som middelverdier ± S.E.M..
n
= 5 i hver gruppe; ** P 0.01.
EC1-Gluc-p53C rettet mot ErbB2 for bioluminesens bilde
in vivo
For forsøkene
in vivo
, vi forberedt mus med MCF7 og BT474 xenopodet svulster på begge flankene. Histologiske observasjoner av svulster ble gjort ved hjelp av H E-farging (figur S2A). Høy uttrykk for ErbB2 i BT474 svulster ble også bekreftet av IF farging (figur S2B). For å evaluere ErbB2 målretting eiendom EC1-Gluc-p53C
in vivo
, oppbevaring av EC1-Gluc-p53C i svulster etter intratumoral injeksjon ble undersøkt av IF farging med anti-Gluc antistoff. EC1-Gluc-p53C ble observert hos BT474 svulster i opptil 24 timer etter injeksjonen. I motsetning til dette ble EC1-Gluc-p53C bare svakt detektert i MCF7 tumorer opp til 6 timer etter injeksjonen (figur 5). Resultatet antyder at retensjonstiden for EC1-Gluc-p53C å være mye lenger i BT474 enn MCF7 tumorer. På grunnlag av oppholdstiden av EC1-Gluc-p53C i tumorer, ble bioluminescerende bilder ervervet 6, 8, 12 og 24 timer etter injeksjonen proteinet. Signal ble detektert i BT474 tumorer i opptil 24 timer, mens det var ikke målbart på MCF7 tumorsider 8 timer etter injeksjonen proteinet (figur 6). Disse resultatene tyder på at ErbB2-targeting eiendom EC1-Gluc-p53C letter sin oppbevaring i BT474 svulster og bioluminesens bilde
in vivo
.
På angitte tidspunkter etter intratumoral injeksjon av EC1-Gluc -p53C, ble musene drept og tumorene ble skåret ut. Svulster ble deretter umiddelbart fast med 4% PFA. Parafininnstøpte stykker av tumorer ble fremstilt i en tykkelse på 10 um.
