Abstract
Mange kreftlegemidler er ment for å drepe kreftceller ved å indusere apoptose. Imidlertid potensundersøkelser brukes ved måling av bioaktiviteten av disse produktene er generelt cellelevedyktighet analyser som ikke skiller mellom celledød og veksthemming. Her beskriver vi et cellebasert fluorescens resonans energioverføring (FRET) biosensor er utformet for å måle den biologiske aktivitet av apoptose-induserende kreftlegemidler. Den biosensor inneholder cyan fluorescerende protein (CFP) koblet via caspase 3 og caspase 8 spesifikke cleavage gjenkjenningssekvenser til gul fluoriserende protein (YFP). Ved caspaseaktivering, som i tilfelle av apoptose-induksjon, er linkeren spaltes å oppheve den cellulære FRET signal. Denne analysen gir et godt bilde av virkningsmekanismen til kreftlegemidler, i å drepe kreftceller og derfor kan fungere som en potens test for forskjellige kreftlegemidler. Vi strengt demonstrere dette gjennom karakterisering av en klasse av proteiner rettet mot dødsreseptorer. Den ett-trinns analyse viser seg å være bedre enn andre apoptose-baserte analyser på grunn av sin enkelhet, bekvemmelighet og robusthet
Citation. Bozza WP, Di X, Takeda K, Rivera Rosado LA, Pariser S, Zhang B (2014) bruk av et stabilt uttrykt FRET Biosensor for Bestemme styrken av kreftlegemidler. PLoS ONE ni (9): e107010. doi: 10,1371 /journal.pone.0107010
Redaktør: Wei Xu, University of Wisconsin – Madison, USA
mottatt: 28 april 2014; Godkjent: 10 august 2014; Publisert: 04.09.2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle data er inkludert i papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Food and Drug Administration, Senter for narkotika evaluering og forskning, Critical Path Initiative fond; og Food and Drug Administration, Senter for narkotika evaluering og forskning, medisinsk mottiltak Initiative fond. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Styrken er et mål på aktiviteten av et medikament i form av konsentrasjon eller mengde som kreves for å fremstille en definert biologisk virkning [1]. Derfor bør en potens assay konstrueres for å reflektere så mye som mulig virkningsmekanismer av et medikament. For onkogene midler, som har til hensikt å drepe kreftceller, vil en potens assay være et mål for stoffets cytotoksisitet i kreftceller. Historisk sett ble mange kjemoterapeutiske midler identifisert ved high throughput screening av forbindelsesbiblioteker ved hjelp av celle-levedyktighet analyser med MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) eller andre beslektede fargestoffer [2], [3]. Denne analysen formatet har vært mye vedtatt som en potens test i utviklingen av kreftlegemidler. Imidlertid kan celleviabilitet analyser ikke skille mellom celledød og vekst arrest effekter, og etterlater en påminnelse i vurderingen av den sanne bioaktivitet av kreftmedisin. Som mål for cancerterapi er å drepe kreftceller, er det viktig å vurdere evnen til et medikament for å indusere kreftcelledød. Den form for celledød oftest assosiert med kreft behandling, både
in vivo Hotell og
in vitro
er apoptose, eller programmert celledød.
Et kjennetegn på apoptose er aktiveringen av caspase proteaser, noe som resulterer i spalting av strukturelle proteiner og apoptotisk legeme formasjon [4]. Det er to forskjellige reaksjonsveier, nemlig indre og ytre, som fører til caspaseaktivering i respons til en medikamentbehandling. Klassiske kjemoterapi slik som etoposid, Compactin, fluorouracil (5-FU), taxol, og camptothecin indusere caspase 3 aktiveringen i et p53-avhengig måte, [5] – [7], noe som ofte innebærer mitokondrielle endringer. I motsetning til en ny klasse av proteiner rettet mot død reseptorer uttrykt på celleoverflaten er under utvikling [8] – [11]. Disse proteinene omfatter det rekombinante human tumornekrosefaktor (TNF) varianter, TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) og død reseptor-agonistiske antistoffer. TRAIL binder seg til døden reseptor 4 og /eller 5 (DR4 /5) og deretter induserer montering av en dødsinduserende aliserte kompleks (DISC) inneholdende adapter protein Fas-assosiert protein med død domene (FADD) og pro-kaspase 8. Innenfor DISC, pro-kaspase 8 blir aktivert ved selv-spaltning og er sluppet inn i cytosolen hvor den aktiverer caspase 3. i noen celletyper, den apoptotiske signalering blir ytterligere forsterket
via
mitokondriene som et resultat av translokasjon av caspase 8 mediert spalting av Bud (BH3 samspill-domene protein). Således kan styrken av en kreft legemiddel vurderes ved å måle størrelsen av kaspase-aktivitet i behandlede celler. En fremgangsmåte ved måling av kaspase-aktivitet har vært bruken av fluorescerende prober som inneholder kaspase substrater, viser endringer i fluorescensintensitet ved caspaseaktivering [12] – [16]. Alternativt kan aktive caspaser bli detektert ved immunblotanalyse ved anvendelse av antistoffer som er spesifikke til det spaltede form av de enkelte enzym [14], [17] – [19]. Imidlertid kan disse analysene være forbundet med stor variasjon på grunn av kompliserte prosedyrer for operasjonen. I denne studien, har vi utviklet en cellebasert assay FRET for testing av styrken av kreft-produkter. Den FRET sonde inneholder gjenkjenningssekvenser for både caspase 3 og kaspase 8, og ble funnet å være sensitive overfor kreft medikamenter som virker gjennom indre eller ytre veier. Spesielt med den som stabilt uttrykte FRET sonde, blir medikament-indusert respons direkte overvåket på de behandlede celler uten ytterligere behandlingstrinn. Videre registrerer FRET analyse celler gjennomgår apoptose med markert følsomhet og eksperimentell enkelhet, noe som gjør det til en lovende styrke analyse for evaluering av kreftlegemidler.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
MDA-MB-231 human brystcancer-cellelinjen ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). En pCMV6-AC plasmid for ekspresjon av et fusjonsprotein (552 aminosyrer) inneholdende full-lengde cyan fluorescerende protein (CFP) og gul fluorescerende protein (YFP) tilknyttet via et caspase gjenkjennelsessekvens ble kjøpt fra OriGene (Rockville, MD). Den linker mellom CFP og YFP inneholder seksten aminosyrer, GSGDEVDGGIETDGSG, som kan spaltes ved aktivert caspase 3 i G ↓ DEVD eller caspase 8 på G ↓ IETD, hvor ↓ indikerer protease kutt nettstedet. Den kodende cDNA sekvensen (1656 basepar) for CFP-linker-YFP-fusjonsprotein ble klonet inn i pCMV6-AC-vektoren ved SGF I og Mlu I-restriksjonsseter, og den korrekte konstruksjon ble bekreftet ved nukleotidsekvensering. Plasmidet ble transfektert inn MB231 celler ved hjelp Lipofectamine 2000 reagens per produsentens instruksjoner (Invitrogen, Carlsbad, California). Transfekterte celler ble utvalgt mot neomycin (G418) ved 1 mg /ml (Corning Cellgro, Manassas, VA). G418-resistente kloner ble plukket ved hjelp av kloningssylindere (Millipore, Temecula, CA) og testet for fluorescens intensitet og protein ekspresjonsnivåene. Den stabile klon med de høyeste ekspresjonsnivåer av CFP-linker-YFP probe, betegnet som MB231_CFP-YFP, ble anvendt i de følgende analyser. Celler ble opprettholdt i DMEM /F-12 50/50 media supplert med 5% FBS, 4 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, og 0,4 mg /ml G418 sulfat. Sperre MB231 celler ble dyrket i det samme mediet uten tilsetning av G418 sulfat. Både rekombinant humant TRAIL (rhTRAIL, Cat # 375-TEC) og en agonistisk monoklonalt antistoff (Cat # MAB631) bestemt til døden reseptor 5 ble kjøpt fra R Dette bidrar til å oppnå et forbedret signal-til-støy-forhold, og unngår høye bakgrunns subtraksjoner som kan komplisere FRET beregninger. I tillegg arbeidet vårt har strengt fokusert på hensiktsmessigheten av den beskrevne analyse i å fungere som en potens test for komplekse protein legemidler som er rettet mot de dødsreseptorer, mens annet arbeid har primært fokusert på lite molekyl legemiddelforskning.
En begrensning av vår analysen er relatert til tilgjengeligheten av molekylære mål (e) i MDA-MB-231-celler til en spesifikk medikamentmolekylet.
