Abstract
Malformin C, en sopp syklisk pentapeptide, har blitt hevdet å ha anti-kreft potensial, men ingen
in vivo
studien var tilgjengelig for å underbygge denne eiendommen. Derfor gjennomførte vi
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter for å undersøke sin anti-kreft effekt og toksisitet. Våre undersøkelser viste Malformin C hemmet Colon 38 og HCT 116 cellevekst doseavhengig med en IC
50 på 0,27 ± 0.07μM og 0,18 ± 0.023μM hhv. Denne hemmingen ble explicated av Malformin C effekt på G2 /M arrest. Videre observerte vi opp-regulert ekspresjon av fosfo-histon H2A.X, p53, spaltes caspase 3 og LC3 etter Malformin C behandling, mens den apoptose-analysen indikerte en økt populasjon av nekrotiske og sene apoptotiske celler.
In vivo
, patologisk studie viste den akutte giftigheten av Malformin C ved dødelig dose i BDF1 mus kan være forårsaket av en akutt ennå subtile betennelsesreaksjon, i samsvar med forhøyet IL-6 i plasma cytokin analysen. Ytterligere anti-tumor og toksisitetsforsøk viste at 0,3 mg /kg injisert hver uke var det beste terapeutiske dosen av Malformin C i Colon 38 xenopodet BDF1-mus, mens 0,1 mg /kg annenhver dag, viste ingen effekt med høyere motstand, og 0.9mg /kg per uke enten ført til dødelig forgiftning i syv uker gamle mus eller vises ingen fordel over 0,3 mg /kg gruppen i ni uker gamle mus. Samlet konkluderer vi med at Malformin C arrestasjoner Colon 38 celler i G2 /M fase og induserer flere former for celledød gjennom nekrose, apoptose og autofagi. Malformin C har potent hemming av cellevekst aktivitet, men den terapeutiske indeksen er for lav til å være en anti-kreft narkotika
Citation. Wang J, Jiang Z, Lam W, Gullen EA, Yu Z, Wei Y, et al. (2015) studie av Malformin C, en Fungal Kilde Cyclic Pentapeptide, som et kreftlegemiddel. PLoS ONE 10 (11): e0140069. doi: 10,1371 /journal.pone.0140069
Redaktør: A R M Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA
mottatt: 02.05.2015; Godkjent: 20 september 2015; Publisert: 05.11.2015
Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Yung-Chi Cheng er Fellow Utsmykkingsfondet for Cancer Research, USA. En del av lønnen er fra NCI tilskuddet fra CA-154295. Mesteparten av forskningsstøtte er finansiert av et fond til Yung-Chi Cheng laboratoriet ved Yale University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Malformins er en gruppe av sykliske pentapeptider opprinnelig oppdaget og isolert fra kultur filtrat av soppen
Aspergillus niger
, og det fremkaller de misdannelser i bønneplanter og krumninger av mais røtter [1, 2] . Malformin kan også fås fra ekstrakt av
Aspergillus tubingensis product: [3]. I dag er tre undergrupper av Malformins identifisert, nemlig Malformin A, Malformin B [4], og Malformin C. Som først oppdaget sub-gruppe, Malformin A består hovedsakelig av Malformin A
1, A
2, A
3 og A
4 [5, 6], hvor Malformin A
1 er mest godt studert, og dets biologiske aktiviteter har blitt rapportert inkludert misdannelser av planter, antibiotika effekt mot visse bakterier arter [7], forbedring av fibrinolytisk aktivitet [8, 9], og forebyggelse mot IL1-indusert prokoagulerende reaksjon [10]. Malformin C er en forholdsvis ny og toksiske medlem av Malformins [11] (figur 1A). Det har vist antibakteriell aktivitet [12], så vel som potente antimalaria og antitrypanosomale egenskaper [13]. Også hemmer Malformin C bleomycin-indusert G2 sjekkpunkt i Jurkatceller [14], og ble hevdet å ha potensial i behandling av kreft. Imidlertid har ingen
in vivo
studien blitt presentert for å underbygge sin anti-tumor eiendom. Derfor gjennomførte vi en serie med innledende
in vitro Hotell og
in vivo
studier for å utforske Malformin C anti-kreft effekt og dens
in vivo
toksisitet.
(A) Kjemisk struktur av Malformin C. Malformin C er et medlem av Malformins, en gruppe av sopp sykliske pentapeptider. Den kjemiske formelen er C
23H
39O
5N
5S
2 med en molekylvekt på 529,7. (B) progresjon Celle syklus av Colon 38-celler utsatt for en økende konsentrasjon av Malformin C i 24 timer. (C) cellesyklusutvikling av Colon 38-celler utsatt for en økende konsentrasjon av Malformin C i 48 timer. (D) Den doseavhengige akkumulering av G2-M fase Colon 38-celler behandlet med Malformin C ved konsentrasjoner på 90 nM, 270 nM og 810 nM. Sammenlignet med kontrollgruppen, symbolet Δ representert
P
0,05, mens * representert
P
0,01. (E) Cellesyklus analyse av Colon 38 celler behandlet med kombinasjoner av Malformin C og SN38. Alle cellene ble utsatt for de respektive forbindelser som er angitt ovenfor diagrammet i 24 timer, og analysen ble gjort i duplikat. Når behandlet med SN38, ble det ikke observert signifikante endringer av cellecyklusprogresjonen uten eller med annen dosering av Malformin C.
Selv om forekomst og dødelighet av tykktarm og endetarm kreft har gått ned de siste tjue årene, tykktarmskreft (CRC) er fortsatt den fjerde hyppigst diagnostisert kreft og den nest største årsaken til kreft dødsfall i USA [15]. Kjemoterapi brukes vanligvis for CRC ved forskjellige stadier. Irinotecan (CPT-11, Camptosar) er et kjemoterapeutisk medikament som forhindrer DNA fra avkobling ved inhibering av topoisomerase I handling, og brukes for behandling av fremskreden eller metastatisk CRC. I denne studien brukte vi murine Colon 38-celler, HCT116-celler og allograft-tumor som modell for å studere mulighetene for Malformin C anti-kreft-egenskap og valgte CPT-11 som en kontroll for å utforske sine mulige kombinasjoner og underliggende mekanisme.
Materialer og Metoder
Fungal Material
kultur
Aspergillus tubingensis
ble isolert fra sand jord av Patong beach i Phuket, thailandske øya (7,89 ° N , 98.29 ° E). Sanden jord ble samlet inn fra en offentlig strand, og ingen spesifikk tillatelse var nødvendig for at plassering eller slik aktivitet. Vi bekrefter at våre feltstudier ikke innebærer truede eller vernede arter. Isolatet ble identifisert ved en av forfatterne (Prof. Yixuan Zhang) basert på sekvensanalyse av den ITS regionen av rDNA og dens morfologi. Stammen ble tildelt aksesjonsnr 6992 kultursamling på Kina General Mikrobiologisk Culture Collection Center, Beijing. Soppens stamme ble dyrket på skråkulturer av potet-dekstroseagar (PDA) ved 28 ° C i 4 dager. Da skråkulturer sporer ble inokulert i 250 ml Erlenmeyer-kolber, hver inneholdende 40 ml av medium (1% glukose, 1% sukrose, 1% pepton, 0,5% peanøttmel, 0,3% KH
2PO
4, 0,1% NH
4Cl, 0,3% MgSO
4 · 7H
2o) og den endelige pH i mediet ble justert til 6,5 før sterilisering. Flaske-kulturer ble inkubert ved 28 ° C på en rotasjonsrystemaskin ved 160 rpm i 48 timer for å oppnå frø væske for gjæring. Fermenteringen ble utført i Fernbach kulturflasker (500 ml) hver inneholdende 80 ml av medium (1% glukose, 0,2% asparaginsyre, 0,1% KH
2PO
4, 0,05% MgSO
4 · 7H
2o og sporstoffer) og den endelige pH 6,0 før sterilisering. Sporstoffer per 1L gjæring media inneholdt 0,1 mg MnSO
4, 0,1 mg ZnSO
4, 0,2 mg FeCl ^
3, 1 mg Vitamin B
1, 5 ug biotin. 8% (volumforhold) frø ble plantet væske inn i hver flaske gjæring, deretter dyrket ved 28 ° C på en rotasjonsrystemaskin ved 160 rpm i 96 timer.
ekstraksjon, isolering og identifikasjon av Malformin C
20L gjæring materiale ble vakuumfiltrert for å fjerne myceliet, deretter ekstrahert med N-butyl-alkohol, og det organiske oppløsningsmiddel ble fordampet til tørrhet under vakuum for å gi et urent ekstrakt. 5g råekstraktet ble oppløst i CH
3OH fulgt av silikagel-kolonnekromatografi (CC) (10 x 100 cm) under anvendelse av CHCI
3-CH
3OH gradienteluering (15: 1 → 10: 1 → 5: 1). Den fraksjon (0,8 g) eluert med 15: 1 CHCb
3-CH
3OH ble separert ved kolonnekromatografi, og ytterligere rensing ved RP-HPLC (Shimadzu LC-10A; Diamonsil C18 200 x 4,6 mm 5um; 1ml /min, 80% CH
3OH i H
2o for eluering, deteksjon UV bølgelengde på 215 nm, malformin C t
R 13.065min) til 99% renhet. Den rene forbindelse ble identifisert på grunnlag av omfattende spektroskopiske undersøkelser, inkludert HR-ESI-MS, 1D-NMR og 2D-NMR. HR-ESI-MS-spektra ble oppnådd på et Bruker mikro-Q-TOF massespektrometer. 1D og 2D-NMR-spektra ble målt på et Bruker ARX-300 spektrometer (300 MHz for
1 H, 75 MHz for
13C). Den rene forbindelse ble identifisert som malformin C via sammenligning av data med de som tidligere er rapportert [16].
Narkotika og cellelinjer
CPT, doxorubicin, vinkristin, Taxol, VP-16, oksaliplatin og DAPI ble kjøpt fra Sigma. L-OddC ble gitt av Shire Pharmaceuticals, Inc. ble Murine Colon 38 cellelinje etablert før [17] og hentet fra Dr. Giuseppe pizzorno av translasjonell Science i Nevada Cancer Institute, USA. Menneskelig lunge adenokarsinom NCI-H1975 cellelinje ble kjøpt fra National Cancer Institute og gitt av Dr. Don Nguyen av avdeling for patologi ved Yale University. Menneskelig lymfoid CEM, menneskelig nasopharyngeal carcinoma KB og HCT 116 tykktarmskreft cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC). Murine bukspyttkjertelkreft PanO2 og KB-resistente cellelinjer ble tidligere etablert i laboratoriet og beskrevet før [18-22]. Colon 38, NCI-H1975, CEM og KB-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium, PanO2-celler ble dyrket i DMEM-medium, og HCT 116 celler i McCoys 5a-medium. KB-resistente cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 med 37nmol /L Doxorubicin for KB-MDR, 300nm CPT for KB300-CPT, 20nm vinkristin for KBv20c, 20 uM VP16 for KB20a-VP16 og 7μM VP16 for KB7d, og alle disse stoffene ble trukket tilbake fra mediet når cellene ble sådd ut for eksperimentene. Alle celler ble dyrket i medium supplementert med 10% FBS, og holdt ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
Cell Growth Assay
Celler ble sådd ut 1 × 10
4 /ml i 48-brønners plater. Etter inkubasjon over natten, Colon 38, HCT 116, PanO2, NCI-H1975, CEM, KB, KB-MDR, KB300-CPT, KBv20c, KB20aVP16, og KB7d celler ble behandlet med legemidler i 72 timer, 72 timer, 72 timer, 120 timer, 72 timer, 120 timer, 72 timer, 108 timer, 72 timer, 108 timer, og 108 timer, henholdsvis. Celler ble fiksert og farget med 0,5% metylenblått i 50% etanol i 2 timer ved romtemperatur (RT), etterfulgt av vasking med vann fra springen for å fjerne uabsorbert metylenblått. Platene ble lufttørket over natten, solubilisert i 1% Sarkosyl og rotert i 3 timer ved værelses RT. Cellevekst ble kvantifisert basert på mengden av metylen-blått adsorbert til å interagere med cellulære proteiner målt ved spektrofotometer (Molecular Devices) ved 595 nm. Verdiene ble midlet og dagen nullverdi ble subtrahert fra hver verdi gjennomsnitts inkludert den ubehandlede kontroll. De legemiddelbehandlede verdier ble uttrykt som en prosent av den ubehandlede kontroll, og prosentandeler ble plottet vs. medikamentkonsentrasjon for å generere en IC
50 verdi. Alle forsøkene ble utført i duplikate brønner og ble gjentatt minst tre ganger.
klonogene Assay
Colon 38 og HCT 116-celler ble sådd ut på 2,4 x 10
5 /brønn i seks- brønners plater henholdsvis, og ble behandlet med Malformin C eller oksaliplatin i 24 timer. Den neste dagen ble cellene høstet og sådd ut på nye seks-brønns plater ved 300 /brønn med friskt kulturmedium. Koloniene ble farget med metylenblått etter 11 dager, og deretter telles. Resultatene er inkludert midler og S.D. oppnådd fra tre uavhengige eksperimenter.
Cell Cycle Analysis
Colon 38 og HCT 116 celler ble sådd separat på seks-brønners plater ved 3 x 10
5-celler per brønn, og inkubert i 48 timer. Forskjellige konsentrasjoner av Malformin C eller oksaliplatin ble tilsatt til kulturmediet og inkubert i ytterligere 24 timer. Cellene ble deretter høstet ved hjelp av pankreatin og 10 ug /ml DNase1, 37 ° C, 5 min og vasket to ganger med kald PBS. Totalt 1×10
6-celler for hver prøve ble delt i porsjoner, resuspendert i 500 ul PBS og fiksert ved tilsetning av 500 ul 4% PFA. Etter 30 minutters inkubering på is, ble prøvene vasket to ganger med kald PBS. Før analyse ble cellene resuspendert i 150 ul 1 ug /ml DAPI i PBS i 30 minutter, deretter filtrert for å fjerne aggregater. Analysen ble utført på en BD Biosciences LSRII og analysert ved hjelp av FlowJo programvare (Tre stjerne).
apoptose analysen
Tidlig apoptotiske hendelsene ble bestemt ved hjelp av en Vybrant apoptose Assay Kit # 2 (Molecular Probes , V13241) i henhold til produsentens instruksjoner, og metoden beskrevet tidligere [23]. Kolon 38 celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Malformin C og CPT i 24 timer. Celler behandlet med 3,7% formaldehyd i 15 minutter ble anvendt som positive kontrollceller. Analysen ble utført på en BD Biosciences LSRII og analysert ved hjelp av FlowJo programvare (Tre stjerne).
Konfokalmikroskopi
Colon 38 celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av Malformin C i tre forskjellige tids kurs inkludert 24-timers behandling, 48-timers behandling, og 24-timers behandling etterfulgt av Malformin C tilbaketrekking og en annen 24-timers inkubasjon. Alle cellene ble fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS og deretter permeabilisert med 0,5% Triton X-100 i PBS. 3% bovint serumalbumin i PBS ble brukt til å blokkere ikke-spesifikk binding. Cellene ble deretter eksponert til monoklonalt anti-p53-monoklonalt anti-spaltet kaspase 3 eller monoklonalt anti-LC3 (1: 200; Cell Signaling Technology) ved romtemperatur i 1 time, vasket med 0,2% Tween 20 i PBS og etterfulgt av fluorescein isothiocyanate- konjugert anti-kanin-IgG på 1: 400 fortynning. Cytoplasmatiske aktin ble kontra farget med 0.25μg /ml rhodamine phalloidin (Invitrogen). Cellene ble deretter forseglet i antifade reagens (Invitrogen). Confocal mikrobilder ble skannet av en laser scanning confocal mikroskop (LSM 510, Carl Zeiss, Inc., Thornwood, New York).
Western Blot
Colon 38 celler og HCT 116 (5 × 10
5) ble sådd ut på 6-brønners plater. Etter 24 timer ble cellene behandlet som indikert i figuren legender. Celler ble lysert i 2 x SDS-prøvebuffer (26.7mM pH 6,8 Tris-HCl, 1% SDS, 25% glycerol, 0.36M β-merkaptoetanol og 0,05% bromfenol-blått) og ultralydbehandlet i 10 sekunder til å skjære DNA. De hel-celle-ekstrakter ble deretter underkastet elektroforese gjennom 15% eller 8% SDS-polyakrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). De ble deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med blokkeringsløsning (TBS, 0,1% Tween 20, og 3% fettfri melk), etterfulgt av et spesifikt antistoff til fosfo-Histone H2A.X (Ser139) (1: 2000, kanin monoklonalt mAb ; Cell Signaling Technology, # 9718), total H2A.X (1: 2000, kanin monoklonalt mAb, Cell Signaling Technology, # 7631), caspase 3 (D2R6Y) (1: 1000, kanin monoklonalt mAb, Cell Signaling Technology, # 14220 ), og LC3A (D50G8) (1: 1000, kanin monoklonalt mAb, Cell Signaling Technology, # 4599) over natten ved 4 ° C. Membranene ble deretter ytterligere inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-IgG (1: 2000; Sigma) ved romtemperatur i 2 timer, og signalene ble visualisert ved forsterket kjemiluminescens (Perkin-Elmer Life Science). Den fosfor-Histone H2A.X og totale H2A.X blotter ble reprobed med antistoffer til p-Actin. (1: 2000, Sigma, A5316)
Animal Studies
Totalt tretti fire ± 0,5 uker gammelt BDF1 mus (Charles River Laboratories) ble brukt for første eksperimentet, tjuefem 6 ± 0,5 uker gamle mus for det andre eksperimentet, og seks 6 ± 0,5 uker gamle mus for patologisk undersøkelse. Alle musene ble plassert i to uker før eksperimentet til å tilpasse seg miljøet ved Yale Animal Facility, spesifikk patogen gratis (SPF), 23 ± 2 ° C, 12:12 lys og mørke syklus, 5 per bur. 2 x 10
6 murine Colon 38-celler ble transplantert subkutant i hver mus for eksperimentet. Vi overvåket daglig vekten av dyret, tap av mobilitet, redusert kroppstemperatur og unormal bevegelse eller stilling, mangel på stell aktivitet, dehydrering som bedømt ved A 2-3 sek telt tid og /eller hvis mus tapte mer enn 15% av kropps vekt, ville det bli fjernet fra undersøkelsen. Et dyr som dukket opp veldig syk som var kaldt å ta på, krum, kunne ikke bevege seg, spise eller drikke normalt fra behandlingen ble avlivet med 30% isofluran (blanding av 30% v /v isofluran og 70% propylenglykol) innånding og livmorhals forvridning. Etter 10 til 14 dager, mus med kreft størrelser av 150-300 mm
3 ble valgt inn i et basseng, og deretter tilfeldig fordelt til ulike grupper, med 5 mus i hver gruppe. Malformin C ble oppløst ved 10 mM DMSO og sluttkonsentrasjonen av DMSO var mindre enn 0,05% av den Malformin C-oppløsning som anvendes for behandling. Forskjellige konsentrasjoner av sterilisert malformin C (0,1 mg /kg, 0,3 mg /kg, 0.9mg /kg, 1,8 mg /kg, 2,6 mg /kg) og sterilisert PBS ble administrert intra-peritonealt (ip) i morgen fra dag 1. etter at hele behandlingen ble blodprøver samlet opp etter bedøvelsen med 30% isofluran inhalering, og deretter ble musene avlivet ved cervikal dislokasjon. Tumor vevsprøver ble oppsamlet etter at musene ble bekreftet døde og frosset på -70 ° C for senere studier. For patologisk studie av Malformin Cs akutt giftighet, vi tilfeldig tildelt seks mus i PBS-gruppen og 1,8 mg /kg Malformin C-gruppen. Narkotika ble injisert intraperitonealt og alle fagene ble overvåket hvert 15. minutt i 6 timer til mus i Malformin C gruppen var døden nær. Deretter ble musene avlivet, ble blodprøver tatt for kjemi, en del av milten og peritoneum ble dyrket i bakteriologi, og resten av undersøkte vev ble fiksert i formalin, innstøpt i parafin, seksjonert og for histopatologiske studier. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med godkjent Yale University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) protokoll (2013-07784). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse. Alle deler av denne rapporten følger de ankommer retningslinjer for rapportering av dyreforsøk.
Plasma cytokine assay
plasma cytokin Analysen ble gjennomført etter bruksanvisningen for BD cytometrisk Bead Array (CBA) Mouse Th1 /Th2 cytokin Kit bruksanvisningen. Muse Th1 /Th2 cytokin-standarder ble rekonstituert i assayfortynning og serielt fortynnet til konsentrasjonen av 0-5000pg /ml. En mengde på 10 ul av hver test mus cytokin innfangingskulen suspensjonen ble blandet, og 50 ul av standard fortynninger eller test blandet perler ble overført til analysen rør. Etter tilsetning av 50 ul av PE deteksjonsreagensen, ble prøvene inkubert ved RT i 2 timer. Deretter ble prøvene vasket, og 300 ul vaskebuffer ble tilsatt til hvert rør. Alle prøvene ble analysert ved hjelp av BD FACS Array System.
Statistical Analysis
Data ble analysert ved ett- eller to-veis variansanalyse (ANOVA) (GraphPad Prism 5), Student t test (Microsoft Office Excel), og korrelasjonsanalyse (GraphPad Prism 5). Forskjellen ble ansett for å være statistisk signifikant når
P
. 0,05
Resultater
Den veksthemming og clonogenicity av Malformin C mot ulike kreftcellelinjer
effekten av Malformin C på veksten hemming av forskjellige kreftcellelinjer ble undersøkt. Alle cellene ble utsatt for økende konsentrasjoner av Malformin C og L-OddC. IC
50-verdien ble definert som den konsentrasjonen av medikamentet som hemmet cellevekst med 50%. L-OddC, også kjent som troxacitabin, er en L-nukleosid analog med anticancer aktivitet [24-27] og ble anvendt som en positiv kontroll i denne studien. Malformin C hemmet Colon 38, HCT 116, PanO2, NCI-H1975, CEM og KB-celler på en doseavhengig måte med en IC
50 på 0,27 ± 0,07 uM, 0,18 ± 0,02 uM, 0,29 ± 0,05 uM 0,16 ± 0,04 mikrometer, 0,030 ± 0,008 mikrometer og 0,18 ± 0,05 mikrometer henholdsvis (S1 tabell). Malformin C hadde forskjellige inhiberings effekter blant forskjellige kreftcellelinjer (
P
0,01, en-veis ANOVA), og den Malformin C var mer potent enn L-OddC for veksthemming av Colon 38, HCT 116 og PanO2 (
P
0,01, t-test). Derfor valgte vi Colon 38 og HCT 116 for følgende studie. Virkningene av Malformin C på kolonidannende evne for Colon 38 og HCT116 ble deretter bestemt som prosentandelen av synlige koloni antall av medikament-behandlede gruppen sammenlignet med ikke-behandling kontrollgruppe av klonogene assay. Kolon 38 og HCT 116 celler oppviste en doseavhengig tap av kolonidannende evne når de utsettes for Malformin C med en LC
50 verdi på 0,6 ± 0,07 uM og 0,7 ± 0,09 uM henholdsvis, som ble definert som den konsentrasjon av legemiddel som inhiberte kolonidannelse med 50%. Forholdet mellom LC
50 til IC
50 ble omtrent 2: 1 i Colon 38 celler og 4: 1 i HCT 116 celler, og dette resultatet viste at Malformin Cs effekter på vekst hemming av Colon 38 og HCT 116 var delvis irreversible.
Effekter av Malformin C på kreft narkotika resistente cellelinjer
De kryssresistens profiler av Malformin C, sammenlignet med andre konvensjonelle anti-kreft narkotika, ble undersøkt ansette KB cellelinje og en rekke veldefinerte KB medikamentresistente cellelinjer (tabell 1). Malformin C viste et 233-gangers resistens overfor KB-MDR-celler som overuttrykt human P-gp 170-proteinet, sammenlignet med KB-celler (
P
0,0001). Det var også 4,4 ganger motstandsdyktig mot KBv20c celler (
P
0,001) og 2,8 ganger mer følsom for KB300-CPT celler (
P
0,05) sammenlignet med KB-celler ( tabell 2). For ytterligere å bekrefte Malformin C motstand mot KB-MDR-celler, Verapamil (VRP), en kalsiumkanal antagonist av P-gp 170-proteinet, ble anvendt til å reversere multimedikamentresistens [28]. En ikke-toksisk konsentrasjon av VRP (5 uM) ble administrert til KB-resistente celler i tillegg til Malformin C, Taxol og Doxarubicin i 72 timer. Med VRP, hadde IC
50 av Malformin C for KB-MDR betydelig redusert, fra 233-fold til 4 ganger av den for KB-celler (tabell 3). Disse dataene viser at KB-MDR-celler ble svært motstandsdyktig mot Malformin C og multiresistent effekten ble reversert av VRP.
Malformin C forårsaket G2 /M arrest i Colon 38 cellelinje
virkningene av Malformin C på cellesyklus fase fordeling av Colon 38 og HCT 116 celler ble undersøkt og en konsentrasjon av 90 nM, 270 nm, 810nM av Malformin C ble administrert henholdsvis i 24 timer og 48 timer. Som illustrert i figur 1, andelen av G2-M fase gradvis, men signifikant økt i kolon 38 celler behandlet med 270 nm og 810nM Malformin C i både 24-timers (fig 1B og 1D) og 48 timer (figur 1C og 1D) eksperimenter . Motsatt, prosentandelen av G1 fase redusert i celler eksponert for 810nM Malformin C. Disse resultatene antydet at Malformin C induserte en doseavhengig G2-M arrest i Colon 38 celler. Imidlertid ble det ikke observert noen tidsavhengige endringer av cellesyklusprogresjon i Colon 38 celler (figur 1D, S1 figur), og ingen cellesyklus mønster endringer ble funnet i HCT 116 celler (S2 Fig). Videre undersøkte vi effekten av Malformin C på cellesyklusprogresjon av Colon 38 celler eksponert for SN38 i 24 timer. Alle cellene ble behandlet med en økende dose av Malformin C (0nM, 30nm, 100 nM, 300nm) i tillegg til noe medikament eller 9nM SN38, respektivt. Irinotecan (CPT-11) er en analog av camptothecin-en topoisomerase I-inhibitor. Inne i kroppen, er det omdannes til den aktive metabolitten SN38 (7-etyl-10-hydroxy-camptothecin) av lever og tarm carboxyesterases, og SN38 har en mye høyere potens
in vitro
forårsake alvorlig skade på DNA som fører til G2-M arrest i kreftceller. I denne studien, igjen vi bekreftet at når de behandles med 300nm Malformin C alene, andelen av G2-M fasen Colon 38 celler økt betydelig sammenlignet med kontrollgruppen (Fig 1E). I tillegg SN38 indusert G2-M arrest i Colon 38 celler og fungerte som en positiv kontroll. Det var ingen signifikant forskjell i progresjonen mønster mellom Colon 38 celler behandlet med SN38 alene og de som ble behandlet med Malformin C i tillegg til SN38 (Fig 1E).
Irreversible handling av Malformin C i forårsaker kreft celledød
Induksjon av tumor suppressor protein p53 er en viktig begivenhet for cellene i respons til DNA-skade [29]. De fleste av kjemoterapeutiske midler for kreftbehandling arbeide gjennom DNA-skade, som resulterer i celledød ved apoptose, nekrose eller autophapy [30]. For apoptose, både ytre og indre veier fører til
kaspase 3 aktiveringen
som til slutt induserer apoptose, og derfor spaltes caspase 3 kan brukes til å evaluere apoptose prosessen [31]. For autophagy, blir deteksjon av mikrotubulus-assosiert protein lettkjede 3 (LC3) er mye brukt til å overvåke autofagi og Autophagy-relaterte prosesser, inkludert autophagic celledød [32]. I denne studien, p53, ble spaltet caspase 3 og LC3 kontrollert påføring konfokalt mikroskop. Alle Colon 38-celler for konfokal ble behandlet med Malformin C ved konsentrasjoner på 0 uM, 0,27 uM og 0,54 uM i 24 timer, 24 timer, fulgt av Malformin C uttak og en annen 24 timer i kultur ved å endre media, og 48 henholdsvis timer, ( figur 2A). Ekspresjon og plassering av p53 ble vist i immunofluorescens-mikroskopibilder som p53-ekspresjon ble indusert i kjernen etter eksponert for 0,54 pM Malformin C i 24 timer uansett om cellene dyrket i ytterligere 24 timer, eller ikke (fig 2B-2D). Når behandlet i 48 timer, selv om p53 ikke ble vist i celler, ble celletallet betydelig redusert, noe som indikerte de celler som uttrykker p53 var sannsynligvis døde fra DNA-skade (figur 2E). Også uttrykkene for spaltede kaspase 3 og LC3 var høyere i Malformin C behandlede Colon 38-celler, spesielt ved en konsentrasjon på 0,54 uM, som tilkjenne det var flere celler som opplever apoptose og autofagi etter å ha blitt utsatt for Malformin C (figur 2B-2E) .
ekspresjonsnivået (grønn fluorescens) ble probet med spesifikke monoklonale p53, spaltes caspase 3 og LC3 antistoffer henholdsvis, etterfulgt av FITC-konjugert anti-mus IgG. Cytoplasmatiske Actin (rød fluorescens) ble kontra med rhodamine phalloidin. Immunfluorescens mikrografer er tatt av konfokalt mikroskop. (A) Experiment design Malformin C ble gitt for 24 timer og farget på 24, for 24 og farget på 48t, for 48t og farget på 48t, henholdsvis. (B) immunfluorescens farging på 24 etter 24 behandling. (C) Immunofluorescens farging ved 48 timer etter 24 timers behandling. (D) Immunofluorescens farging ved 48h 48h etter behandling. (E) Uttrykk for p53, kløyvde caspase 3 og LC3 etter tre måter administrasjon av forskjellig konsentrasjon av Malformin C basert på konfokalmikroskopi resultater.
Malformin C førte til flere former for celledød
histone H2A.X er en variant histone som representerer ca 10% av de totale H2A histonproteinene i normale humane fibroblaster. Innen minutter etter DNA-skader, er H2A.X fosforylert ved Ser139 på områder av DNA-skade [33]. I vår studie ble Colon 38 celler og HCT 116 celler behandlet med Malformin C i 2 timer, 4 timer, 8 timer og 24 timer, og uttrykk for fosfor-Histone H2A.X og total H2A.X ble undersøkt med Western blot. Som vist i figur 3, var det en doseavhengig opp-regulert ekspresjon av fosforylert H2A.X ved Ser139 etter 24-timers behandling av Malformin C i begge Colon 38 og HCT 116 cellene, mens ekspresjonen av total H2A.X økte bare i kolon 38 celler etter 24 timers behandling av Malformin C. Dessuten ble det observert en mindre doseavhengig økning av fosfo-H2A.X uttrykk etter 8 timers behandling av Malformin C i HCT 116 celler. Når vi tok forholdet mellom fosforylerte og total H2A.X, indikerte at Malformin C forårsaket av fosforylering H2A.X i HCT 116-celler på en doseavhengig måte når behandlet i 8-24 timer.
( A, C) uttrykk for fosforylert og total H2A.X i Colon 38 celler behandlet med ulike konsentrasjoner av Malformin C (0μM, 0.14μM, 0.27μM, 0.54μM) og Hydroxyurea (1 mM, 2mm) for to-timers, 4 timer , 8 timer og 24 timer ble testet ved hjelp av Western blot med β-Actin uttrykk som en intern kontroll. Hydroksyurea ble benyttet som positiv kontroll. H2A.X fosforyleres ved Ser139. (B, D) Ekspresjon av fosforylert og total H2A.X i HCT116-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Malformin C (0μM, 0.14μM, 0.27μM, 0.54μM) og hydroksyurea (1 mM, 2 mM) i 2 timer, 4 timer, 8 timer og 24 timer ble testet ved hjelp av Western blot med β-Actin uttrykk som en intern kontroll. Hydroksyurea ble benyttet som positiv kontroll. H2A.X fosforyleres ved Ser139.
uttrykk for caspase 3 og LC3 ble også undersøkt med Western blot. Under autofagi, er LC3AI konvertert til LC3AII gjennom lipidering, og LC3AII fungerer som en indikator på autofagi. Så vi analysert LC3AII uttrykk for å teste Malformin C effekt på autofagi. Etter 24-timers behandling av Malformin C, observerte vi en doseavhengig opp-regulering av spaltet caspase 3 i HCT 116 celler, og en doseavhengig opp-regulering av LC3AII i både Colon 38 og HCT 116 celler (figur 4A og 4B ). Men det var ingen doserespons for den økte ekspresjon av spaltet caspase 3 i Colon 38-celler, og det kan på grunn av det faktum at noen av apoptotiske celler løsnet fra platen i løpet av kulturen og gikk tapt når mediet ble fjernet. Ingen vesentlige endringer av kløyvde caspase 3 og LC3AII uttrykk ble oppdaget etter 4 timer og 8-timers behandling (S5 fig). For ytterligere å undersøke dødsprosessen av disse DNA-skadede celler, gjennomførte vi den apoptose-analyse og funnet en betydelig større gruppe av sen apoptotiske celler og nekrotiske celler etter Malformin C eksponering, mens andelen av tidlige apoptotiske celler viste ingen forskjell fra kontrollgruppen ( fig 3E). Alt i alt, fant vi at 24-timers behandling av Malformin C kan føre til DNA-skader og føre til celledød ved apoptose, autophapy og nekrose.
(A, B) Uttrykket av spaltet caspase 3, totalt caspase 3, LC3AI og LC3AII i kolon 38 og HCT 116 celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av Malformin C (0μM, 0.14μM, 0.27μM, 0.54μM i 24 timer ble testet ved hjelp av Western blot med β-Actin uttrykk som en intern kontroll. Under
