Abstract
Kreft metastasering er en kompleks prosess som involverer celle-celle interaksjoner mediert av celle lim molekyler. I denne studien finner vi vedheft styrke mellom en endothelial celle monolayer og kreftceller i ulike metastatiske potensialer ved hjelp Atomic Force Microscopy. Vi viser at bruddkreftene reseptor-ligand-bindinger øker med tilbaketrekkhastigheten og varierer mellom 20 og 70 pN. Det er vist at de invasive cellelinjer (T24, J82) danner de sterkeste bindinger med endotelceller. Ved hjelp av ICAM-1-belagte substrater og et monoklonalt antistoff som er spesifikt for ICAM-1, viser vi at ICAM-1 virker som en nøkkel-reseptor på endotelceller, og at dets interaksjoner med ligander som uttrykkes av tumorceller er korrelert med de bruddkrefter som oppnås med de mest invasive kreftceller (T24, J82). For de mindre invasive kreftceller (RT112), betyr endotelial ICAM-1 ikke synes å spille noen rolle i adhesjonen prosessen. Videre er en detaljert analyse av fordelingen av bruddkrefter antyder at ICAM-1 samvirker fortrinnsvis med en ligand på T24 kreftceller og med to ligander på J82 kreftceller. Mulige benke reseptorer for disse interaksjonene er CD43 og MUC1, to kjente ligander for ICAM-1 som er uttrykt av disse kreftcellene
Citation. Laurent VM, Duperray A, Sundar Rajan V, Verdier C (2014) Atomic Force Mikros avslører en rolle for endotelcelle ICAM-1 Expression i blærekreft Cell Etterlevelse. PLoS ONE 9 (5): e98034. doi: 10,1371 /journal.pone.0098034
Redaktør: Andrew Pelling, University of Ottawa, Canada
mottatt: 21 januar 2014; Godkjent: 28 april 2014; Publisert: May 23, 2014
Copyright: © 2014 Laurent et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Kildene finansiering som har støttet arbeidet er Nanosciences Foundation, ANR Transmig, La Ligue contre le cancer, LABEX startet Tec21. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
adhesive interaksjoner av kreftceller med endotel er viktige hendelser i den metastaseprosessen (dvs. spredning av kreftceller fra ett organ til andre deler av kroppen) [1], [2]. Under dannelsen og veksten av tumorer, kreftceller klarer å rømme fra primærsvulster og trenge inn i blodstrømmen, og således kan reise over lange avstander. På fjerntliggende steder i menneskekroppen, kreftceller kommuniserer med endotelet, holder seg og til slutt ekstravasere, dvs. vandrer gjennom endoteliale barrierer. Leukocytter og kreftceller bruke lignende mekanismer for å kommunisere med endotelceller (ECS), men mens fenomener av adhesjon og migrasjon av leukocytter inn i endotelet har vært spesielt undersøkt i løpet av betennelse, noen resultater er tilgjengelig angående rollen til de sentrale molekyler som er involvert i heft og sjelevandring av kreftceller [1], [3], [4], [5].
i likhet med leukocyttfrie rekruttering, tethering og rulling av tumorceller (TCS) på endotelet er påvist for noen kreftceller og blir formidlet av selectins. Etter denne innledende interaksjon tar fast adhesjon sted, formidlet av flere celleadhesjonsmolekyler som tilhører integrinfamilien [6], så vel som det intercellulære adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) og vaskulær celleadhesjonsmolekyl-1 (VCAM-1) fra immunoglobulin familien, som fører til tumorinvasjon [7], [8]. VCAM-1 uttrykkes av endotelet etter stimulering, og samvirker med α4β1 grin, mens ICAM-1 uttrykkes ved ECS, leukocytter og noen TC, og kan bli oppregulert ved inflammatoriske cytokiner. ICAM-1 er involvert i leukocyttadhesjon til endotelet gjennom interaksjon med LFA-1 og Mac-1-leukocytt-integriner (β2 integrin). TCS mangler p2 griner, men nøytrofile kan fungere som en bro mellom TC og egenkapitalbevis, med LFA-1 på leukocytter binding til ICAM-1 uttrykt på både endothelial og TCS [5]. I tillegg, ICAM-1 er en reseptor for andre molekyler, slik som CD43 [9] og MUC1 [10], som uttrykkes av noen TC.
Cancer progresjon er assosiert med endringer i ekspresjonen av noen klebe molekyler. Noen fungerer undersøkte forholdet mellom den N-cadherin ekspresjon og progresjon av tumoren malignitet [11], [12]. En økning av kreftcelle invasivitet er kombinert med omkobling av E-cadherin av N-cadherin og en økning i ekspresjonen av integrin enkelte underenheter [13]. Fra et kvantitativt synspunkt, er sammenligningen av adhesive egenskaper i ikke-maligne og maligne epiteliale blære-celler vist seg at en forbedret N-cadherin nivået i T24 maligne celler ble ledsaget av endringer i uforpliktende Egenskapene til de individuelle N-cadherin-molekyler [14] . I tillegg har ICAM-1-ekspresjon er assosiert med en mer aggressiv fenotype tumor [15], [16]. Likevel, de som er involvert i firmaet vedheft av TC ligander er ennå ikke så klart definert som for leukocytter, og kvantifisering av slike selvklebende interaksjoner mellom egenkapitalbevis og kreftceller er ikke undersøkt så langt.
Kvantitativ informasjon om celle lim krefter kan oppnås ved hjelp av ulike kraft spektroskopi teknikker: bio-membran kraft probe [17], optiske pins [18] og atommikroskop (AFM) [19]. Alle disse teknikkene som opererer under et optisk mikroskop tillater å visualisere cellene og samtidig måle adhesjonskreftene fra noen få pN til noen få hundre pN eller mer. I dette arbeidet, velger vi å bruke encellede kraft spektroskopi modus for AFM til å studere celle-celle interaksjoner involvert i heft TCer på egenkapitalbevis. I motsetning til andre metoder for limstyrke, denne teknikken gjør det mulig å utføre målinger i en konfigurasjon i nærheten av
in vivo
situasjon. En kreftcelle er festet til en myk cantilever og satt i kontakt med et EC-monolaget og den kraft-målesignal blir overvåket AFM takket være den cantilever avbøyningen [19], [20]. Signalet kan også påvise hendelser som mulige samlivsbrudd av reseptor-ligand obligasjoner samt den globale vedheft styrke på cellenivå.
Fastsettelse av celle-celle interaksjoner ble utført for annen cantilever tilbaketrekking hastigheter for å studere hvordan bruddstyrken (som er involvert i celle-celle-klebende bindinger) blir modifisert. Vi har undersøkt forholdet mellom de målte reseptor-ligand-bindinger og tilsvarende metastatisk potensial av humane blærecancerceller, for å bestemme den klebende signatur av slike kreftceller. Til slutt viser vi at ICAM-1-reseptoren på ECS fungerer som en viktig mediator for limet interaksjon med de invasive kreftceller. Våre funn tyder på at de mer invasive blærekreftceller kommuniserer takket være en eller to typer ICAM-1 ligander: CD43 og MUC1 er gode kandidater, som demonstrert av flowcytometri eksperimenter. Denne kunnskapen om slike interaksjoner er viktig for forståelsen av kreft celle adhesjon til endotelet, en mekanisme som fører til invasjon og metastasering.
Materialer og metoder
Celler og cellekultur
Tre blærecellelinjer ble anvendt i denne studien: RT112, T24 og J82 (ATCC, Rockville, MD). Disse cellelinjene representerer progresjon fra brønn til dårlig differensierte fenotyper og oppstår fra overfladisk til invasiv epitelial human blærekreft. RT112 kreftceller er moderat differensiert og er karakterisert ved en cytologisk grad 2 (eller differensiering) [21]. T24 og J82 kreftceller er dårlig differensiert og preget av en cytologisk klasse 3. For å skille kreftceller fra HUVECs, ble kreftceller transfektert med et plasmid som uttrykker GFP (grønt fluorescerende protein – pEGFP). Menneske Vaskulær Umbilical endotelceller (HUVECs) ble kjøpt fra Promocell (Heidelberg, Tyskland). Kreftceller ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære, i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt kalveserum, 100 UI /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (komplett RPMI-medium). Egenkapitalbevis ble opprettholdt i Promocell dyrkingsmedium. ECS ble sådd ut i fullstendig kulturmedium på dekkglass belagt med kollagen (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrike) og venstre 3 dager for å spre seg for å oppnå konfluens. For AFM eksperimenter, ble kulturmediet supplert med HEPES (20 mM, pH 7,4).
Atomic Force Mikros
Vi brukte en Nanowizard II AFM (JPK Instruments, Berlin, Tyskland) montert på en Zeiss mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland). Denne konfigurasjonen gjør det mulig å gjennomføre AFM målinger og samtidig observere cellene ved hjelp av fasekontrast eller fluorescens moduser. Dette AFM er også utstyrt med «CellHesion «modul (JPK Instruments, Berlin, Tyskland). Denne modulen gjør det mulig for en lang vertikal forskyvning av scenen opp til 100 mikrometer som gjør kraft spektroskopi målinger mulig, inkludert celle-celle interaksjoner. Parallelt er et vertikalt piezotranslator (PIFOC, Physik Instrumente, Karlsruhe, Tyskland) som er montert på mikroskopobjektiv å bevege objektivet samtidig med objektbordet og fokusere på celler under utførelse av AFM målinger. Alle målingene ble utført ved 37 ° C ved hjelp av petriskål Heater (JPK Instruments, Berlin, Tyskland).
Cantilever belegg
Myke bommene var V-formede de uten tips (MLCT- O, Bruker, Frankrike). De ble kalibrert ved hjelp av termiske svingninger analysemetode [22] og viser en fjærkonstant nær 0,01 N /m. For å aktivere vedheft av kreftceller til cantilever, ble sistnevnte funksjon bruker biotin-Cona (Interchim, Montluçon, Frankrike) [23]. Etter skylling med PBS, ble utkraginger inkubert over natten ved 37 ° C i biotin-BSA (Interchim, Montluçon, Frankrike) (0,5 mg /ml), skylles igjen i PBS og deretter inkubert i streptavidin (Interchim, Montluçon, Frankrike) (0,5 mg /ml) i 10 minutter. Til slutt, utkraginger ble renset med PBS og satt inn i en biotin-ConA dråpe i løpet av 10 minutter og deretter skylt med PBS. Dette molekylet tillater binding av kreftceller til de bommene med en kraft større enn den celle-celle løsgjøring kraft i vår studie: biotin-ConA kleber til kreftcellemembran med en løsgjøring kraft av to nN [20], mens løsgjøring kraft aktuelle i samspillet mellom kreftceller og EU er i størrelsesorden 1 Nn.
kreft celle fangst
kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP ble dyrket i kulturflasker, deretter ble løsnet like før AFM eksperimenter, ved hjelp av en trypsin /EDTA-løsning (0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA). RPMI-medium med serum ble tilsatt til cellene for å blokkere virkningen av trypsin. Til slutt ble cellene sentrifugert og resuspendert i medium uten serum. Kreftceller ble avsatt i en petriskål på som en EC mono hadde vært dyrket, og slo seg ned i noen sekunder. Celle fange besto i å plassere braket spissen over en kreftcelle (siden kreftceller var fluorescerende, kan de skilles fra ECS, se figur 1), for å komme i kontakt med cellen i løpet av ti sekunder med en kraft på 1 Nn. Deretter cantilever med den fangede cellen ble trukket langsomt med konstant hastighet, og cellen ble holdt i dyrkningsmedium for å hvile i 15 minutter. Deretter ble 1 ml RPMI 1640 medium med serum tilsettes. Cellen ble fast bundet til cantilever og deretter anvendt for å probe adhesjon til ECS.
A) Fotografi av cantilever med vedlagte fluoriserende kreftcelle ovenfor HUVEC monolaget. Hvit skala bar tilsvarer 20 mikrometer. B) Skisse av tilnærmingen-tilbaketrekkings fremgangsmåte og et typisk tilbaketrekkingskraften kurve i form av piezo forskyvning. Kreftcelle nærmer seg EC monolaget med konstant hastighet. Da cellen kommer i kontakt med EF i løpet av 10 sekunder (under en nN tilført kraft) for å skape flere bindingen komplekser enn adhesjonen området. Cantilever trekkes ved konstant hastighet for å løsne limet obligasjoner. Tilbaketrekkings kurven viser tvinge hopp som gir brudd kraft (f) av obligasjoner. Klebemidlet energi (skravert område) representerer løsgjøring arbeidet utført av cantilever for fullstendig å løsrive cellen fra substratet. Løsgjøring kraft er den kraft som er nødvendig for å strekke kreftcellen og EF til bindinger begynner å løsne. Merk at noen kraft hopp kan følge et platå som tilsvarer tjore dannelsen
Force spektroskopi. Analyse av kreftcelle-EC interaksjon
Først kreftcellen ble satt over en EC. Cantilever ble senket ved konstant lav hastighet (ca. 1 pm /s) for å sette kreftcellen i kontakt med EC (ovenfor kjernen). En kompresjonskraft på en Nn ble påført på EC i løpet av 10 sekunder (figur 1A) for å danne bindinger og å reprodusere fast adhesjon. Til slutt ble kreftcellen trukket tilbake med en hastighet i området mellom 0,5 pm /s til 20 um /s. Måling av cantilever nedbøyning under vertikal bevegelse ble spilt inn i løpet av de forskjellige stadier (Figur 1b). Typisk, for en kreftcelle-EC par, ble en sekvens av fem kraftkurver erholdt ved fem forskjellige tilbaketrekningshastigheter (med en hviletid på ca. 1 minutt mellom hver kurve). Deretter kreftcellen var igjen i ro i løpet av ti minutter, og flyttet over en annen EC for å måle en sekvens av fem styrkekurvene på nytt. Til slutt ble hver kreftcelle anvendes tre eller fire ganger, derfor femten eller tyve slike styrkekurvene (N = 15 eller N = 20) ble oppnådd. Målingene ble deretter samlet opp for forskjellige kreftcellelinjer, under lignende eksperimenter. En skisse av den typiske tilbaketrekkingskraften i form av piezo forskyvning er vist i figur 1C. Den minste punkt på kurven er den løsgjøring kraften, dvs. den kraft som er nødvendig for å skille kreftcellen fra EF. Løsgjøring kraft er støttet av cellen deformerbarhet, men også av antallet og styrken av klebende bindinger som dannes mellom cellene. De ulike hopp i kraft tilsvarer de påfølgende samlivsbrudd av obligasjoner som er involvert i celle-celle interaksjon [24], [25] og representerer derfor ruptur krefter (dvs. reseptor-ligand obligasjoner). Merk at en kraft hopp kan følge et platå i kraft, tilsvarende tjore formasjon, hvis utvidelsen er platået lengde. Tilbaketrekkings kurve gir også informasjon om vedheft energi som er nødvendige arbeidet for å løsne kreftcellen (skravert område i figur 1C). Dette omfatter arbeidet som er gjort for å strekke celler samt arbeidet som er gjort for å bryte de molekylære bindinger [25]. Alle disse parametrene (løsrivelse kraft, brudd kraft, vedheft energi) er hentet fra kraftkurve ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (JPK instrument, Berlin, Tyskland). For hvert sett av betingelser, ble AFM-eksperimenter utført omtrent 9 ganger på 3 forskjellige dager. Med mindre annet er oppgitt, er data rapportert som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet. Alle statistiske tester ble utført ved hjelp av R-programvare (2.14 release). Siden dataene er korrelert, brukte vi en generalisert lineær Mixed Model (GLMM). Forskjeller mellom parametrene beregnet på ubehandlet og anti-ICAM-1-behandlede celler ble testet ved den blandede funksjon av Afex pakken i R programvare.
Hemning av ICAM-1 ligander på ECS
Humant monoklonalt antistoff mot ICAM-1 [27] ble anvendt ved en 30 mikrogram /ml konsentrasjon. Før AFM-forsøkene ble ECS inkubert i 15 minutter i nærvær av antistoffet ved 37 ° C. Deretter ble cellene skylt to ganger i PBS og inkubert i 2 ml dyrkningsmedium.
Immobilisering av ICAM-1 og BSA
En 20 pl prøve av rekombinant ICAM-1 (RD Systems, Lille, Frankrike) (25 ug /ml) i 0,1 M NaHCO
3 (pH 8,6) ble adsorbert over natten ved 4 ° C i midten av dekkglass. -Bundne proteiner ble fjernet ved vasking med PBS, og 2 ml komplett RPMI 1640-medium ble deretter tilsatt til ICAM-1 belagt rett før AFM-forsøkene.
For den BSA-belegget protokollen, en ul alikvot av BSA ved 100 ug /ml i PBS ble adsorbert i 30 minutter ved 37 ° C i midten av petriskålen. -Bundne proteiner ble fjernet ved vasking med PBS og 2 ml av den fullstendige RPMI-medium ble deretter tilsatt til BSA-belagte rett før AFM-forsøkene.
Strømningscytometri-analyse av ICAM-1, MUC1 og CD43 ekspresjon og immunfluorescens farging
Expression nivåer av ICAM-1 (på EC overflate), ble MUC1 og CD43 (på kreftcelleoverflaten) analysert ved flowcytometri (Accuri C6 flowcytometer, BD Bio-vitenskap). Kvantifisering ble gjort ved å måle den geometriske middel fluorescens. For immunfluorescens farging, ble dekkglass belagt med 25 mikrogram /ml humanfibronektin. Celler ble fiksert med 2% paraformaldehyd, og bearbeidet for indirekte immunofluorescens-mikroskopi.
For å måle ekspresjonsnivåene av ICAM-1 og MUC1, ECS eller kreftceller ble inkubert med det primære antistoff og deretter med FITC-konjugert (geit anti-mus IgG) sekundært antistoff (Jackson Immunoresearch, USA). De primære antistoffer er et humant monoklonalt antistoff mot ICAM-1 [26] eller et anti-MUC1 monoklonalt antistoff C595 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA). Den anti-MUC1 antistoffet gjenkjenner et tetrapeptid motiv innen proteinkjernen av den MUC1 molekylet.
For CD43 ekspresjon nivå, kreftceller ble inkubert med et monoklonalt antistoff CD43-klon L10 merket med FITC (Invitrogen, USA), som reagerer med det ekstracellulære domenet.
Resultater
klebe~~POS=TRUNC ulike kreftcellelinjer
for å vurdere om kreftcelle invasivitet er relatert til sine klebende egenskaper, gjennomførte vi kraft spektroskopi målinger rettet mot samspillet mellom kreftceller (av forskjellig invasivitet) og egenkapitalbevis. Kreftcellene knytter seg til følgende cellelinjer: RT112, T24 og J82. RT112 celler er de mindre invasive cellene mens T24 og J82 celler er de mer invasive [21]. Force-kurver ble utført mellom en kreftcelle festet til cantilever spiss og et monolag av ECS sådd ut på et dekkglass. Figur 2 viser typiske kraftkurver innhentet i løpet interaksjoner av de tre kreftcelletyper (T24, J82 og RT112) med egenkapitalbevis. Hver tilbaketrekkings kurve (tilbaketrekkingshastighet V = 5 um /s) viser flere brudd hendelser assosiert med den påfølgende brytning av bindinger som er involvert i celle-celleinteraksjon. Interessant, mindre invasive celler (RT112) presentere mindre brudd kraft skritt i forhold til de fleste invasive celler (T24, J82). Videre, løsgjøring kraft som er det laveste punkt (figurene 2A-B-C) av kurven er mindre for RT112 celler. Figurene 2A-B-C viser også fordelingen av bruddstyrker detektert for cancer-celleinteraksjoner med ECS ved V = 5 um /s. Disse størrelsene [10-70] PN er i området av typiske kraftverdiene oppnådd for reseptor-ligand-bindinger [23], [27], [28], [29]. Det er bemerkelsesverdig at de tre celletyper som utviser forskjellige kraftverdiene: målinger indikerer en gjennomsnittlig brudd styrke på 29,6 ± 0,8 pN for RT112, 34,0 ± 0,9 pN for T24 og 44,2 ± 1,1 pN for J82 (V = 5 um /s). Legg merke til at den gjennomsnittlige bruddstyrker er mindre for RT112 celler som er mindre invasiv art.
Typiske force kurver etter 10s-kontakt mellom en TC og en EF om et HUVEC monolag. Sannsynlighets histogrammer med oppsamlet bruddstyrker f for J82 (A), T24 (B) og RT112-celler (C) ved V = 5 um /s. Vertikale piler betegne eksempler på makt hopp tilsvarende oppdelingen av reseptor-ligand obligasjoner.
Vedheft energi og løsrivelse kraft (cellenivå)
Et viktig aspekt for å karakterisere samspillet mellom kreftceller til ECS er adhesjonen energi som involverer hele cellen kontaktområdet. Adhesjonen energi utledes ved integrering av arealet under kurven F (z), hvor F er kraften, og z er den piezo forskyvning. Grunnlaget linjen er valgt som den endelige grenseverdien, etter at alle obligasjoner er frittliggende. Den JPK programvare gjør det mulig å velge denne verdien, og deretter utfører integrasjonen. Derfor undersøkte vi adhesjon energi samt løsgjøring kraften (absoluttverdien av den minimale kraft trekke kraft kurve, se figur 1B) som funksjon av tilbaketrekkingshastighet (V). Som vist i figur 3, er disse to parametrene øker med tilbaketrekkhastigheten. Når det gjelder adhesjon energi, de invasive J82 celler tilstede større verdier som sammenlignet med de T24 eller RT112 celler. Dessuten er denne differansen bekreftes ved de anordnede adskillelseskraftverdiene som er høyere for J82 celler sammenlignet med T24 og RT112 celler. I alle fall, adskillelseskrefter eller klebe energier er alltid mindre med den mindre invasiv RT112 celle.
Plot av adhesjonen energi (A) og løsgjøring kraft (B) sammenlignet med tilbaketrekkingshastigheten etter 10s-kontakt mellom en TC og en EF om et HUVEC monolag. Tre kreftcellelinjer: T24 (åpen sirkel), J82 (full kvadrat) og RT112 (full trekant). Dataene er plottet som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. Linjen er bare en guide for øyet.
Effekt av tilbaketrekking fart på bruddstyrken
Bruddet kraft har vist seg teoretisk til å avhenge av logaritmen av lasterate på cantilever [30]. Å studere signaturen til hver kreftcellelinje, må man analysere kraft spektra av de tre kreftcelletyper i løpet av deres interaksjon med egenkapitalbevis (figur 4). Disse spektra er tilstede kraftverdiene avhengig av tilbaketrekkingshastigheten eller ekvivalent belastningshastigheten r
f (I /s), er lik produktet av den tilbaketrekkingshastigheten V (m /s) ganger fjærkonstant k (N /m) av cantilever, dvs. r
f = kV. Force verdier øker gradvis med tilbaketrekkingen fart og varierer mellom 20,8 ± 0,7 pN og 47,4 ± 1,9 pN for RT112 celler, mellom 27,1 ± 1,1 pN og 52,4 ± 2,0 pN for T24 celler, og mellom 31,6 ± 1,0 pN og 65,8 ± 1,6 pN for J82 celler. For de tre kreftcellelinjer, gjennomsnittlig bruddstyrken mot logaritmen av tilbaketrekking hastigheten øker, men er ikke lineær.
Forholdet mellom brudd kraft og tilbaketrekking fart etter 10s-kontakt mellom en TC og en EF om et HUVEC enkeltlag. Tre kreftcellelinjer: T24 (full sirkel), J82 (full kvadrat) og RT112 (full trekant) i samspill med endotelet. Dataene er plottet som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. Linjen er bare en guide for øyet.
Måling av spesifikke og uspesifikke vedheft krefter for kreftceller
I en tidligere studie viste vi at ICAM-1 var involvert i TC ekstravasasjon [4]. For å teste den spesifikke adhesjonen mellom kreftceller og ICAM-1-molekyler, gjennomførte vi kraft spektroskopi forsøk mellom en kreftcelle er festet til spissen av en AFM cantilever og immobiliserte ICAM-1-molekyler på en glassform. Som vist i figur 5, disse målingene viser at bruddkreftene er meget nær til de som allerede er oppnådd for kreftcelle-EC interaksjon [28]. Verdiene er i området [20-70pN] for en tilbaketrekking hastighet mellom 0,5 um /s og 20 mikrometer /s. Å sammenligne disse verdiene til de uspesifikke vedheft krefter, vi også målt brudd kreftene mellom TC og en BSA-belagt overflate. Kraftnivået som er involvert i ikke-spesifikk adhesjon er i området [10-45pN] som er mye mindre viktig, rundt 40% til 70% av den spesifikke bindingsstyrken.
Rupture kraft vs. tilbaketrekkingshastigheten for T24-celler gjensidig påvirkning enten med et belagt substrat eller med ECS (sirkel). Substratet er belagt med BSA 100 ug /ml (firkantet) eller rekombinante ICAM-1 25 pg /ml (diamant). Dataene er plottet som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. Linjen er bare en guide for øyet.
Rolle av ICAM-1 reseptoren
Som vist av konfokalmikroskopi imaging (Figur 6A), uttrykk for ICAM-1 på unstimulated egenkapitalbevis er moderat. FACS-analyse (figur 6B) bekrefter den ICAM-1-ekspresjon nivå, når man sammenligner fluorescens- nivåer av celler behandlet med et irrelevant antistoff, og med anti-ICAM-1-antistoff. For å bestemme den relative bidraget av den ICAM-1-reseptoren på celle-celle-adhesjon, undersøkte vi endring av adhesjonskreftene når blokkerer denne reseptoren med et spesifikt monoklonalt antistoff. Figur 7 viser effekten av antistoff mot ICAM-1 i løpet av adhesjonen av de tre kreftcelletyper med ECS. Interessant, hemming av EC ICAM-1 resulterte i en signifikant reduksjon av bruddstyrker for kun de mer invasive cellene. For T24 cellene, gjennomsnittsstyrken varierte mellom 27,1 og 52,4 pN pN (ved forskjellige hastigheter) uten å blokkere den ICAM-1-reseptoren, men mellom 14,4 og 35,7 pN pN, når blokkering ICAM-1 (figur 7A). Denne effekten er også tydelig på box-whisker-tomten oppnådd ved en tilbaketrekking hastighet på 5 mikrometer /s (figur 7 B). Den anti-ICAM-1-antistoff induserer en signifikant reduksjon av bruddstyrken for T24 (fra 34pN til 21,8 pN, se figur 7B), og verdien på 21,8 pN (+/- 0,7) oppnådd etter bruk av antistoffet er sammenlignbar med den ruptur kraft verdien av 23.3pN (+/- 1,6) oppnådd for T24-BSA vedheft (se figur 7G). Derfor, etter hemming av ICAM-1, er bruddstyrken nivå som er typisk for et ikke-spesifikk adhesjon. Denne hemming synes å være praktisk talt fullstendig for T24 celler. For J82 celler, kraft gjennomsnitt varierer mellom 31,6 pN og 65,8 pN uten å blokkere ICAM-1 og mellom 17,7 pN og 58,1 pN når blokkering ICAM-1. Denne effekten av anti-ICAM-1 er klart synlig i den kasse whisker plottet i figur 7D: middelverdi avtar fra 44,2 til 30,4 pN pN ved en tilbaketrekkingshastighet på 5 um /s. Til slutt blir adhesjonen av cellene til RT112 ECS ikke redusert i nærvær av anti-ICAM-1-antistoff: gjennomsnittsverdiene varierer mellom 20,8 og 47,4 pN pN mens de er mellom 21,1 og 58,6 pN pN når blokkering ICAM-1. Denne ikke signifikant effekt av anti-ICAM-1-antistoff bekreftes av boks-whisker plott (figur 7F): antistoffet induserer ikke noen reduksjon i bruddstyrken. Derfor har en viktig reduksjon i bindingsstyrker for invaderende celler (for eksempel 35% for J82 og T24-celler) kvantifisert her uansett hastighet, mens det ikke er noen endring i tilfelle av mindre invasiv RT112 celle. Dette viser klart at ICAM-1 uttrykt av egenkapitalbevis spiller en avgjørende rolle i firmaet vedheft av de mer invasive celler (J82 og T24).
A) Konfokalmikroskopi bilde av en EC monolayer farget for ICAM-1 ( grønn). HUVECs ble fikset med PFA. Atomkjerner er farget i blått ved hjelp av DAPI. B) Kvantifisering av ICAM-1 nivåer ved FACS-analyse (stiplet linje) sammenlignet med et irrelevant antistoff (heltrukket linje).
Rupture kraft vs. tilbaketrekking fart etter samspillet mellom kreftceller og en EC, behandlet med et anti ICAM-1-antistoff eller ikke. Tilsvarende box-whisker plott viser bruddstyrker på en tilbaketrekking hastighet på 5 mikrometer /s. (A, B) T24-EC, (C, D) J82-EC og (E, F) RT112-EC. Som en sammenligning, er bruddstyrken boksplottet også vist for T24-BSA interaksjon (panel G). For paneler A, C og E, er linjen bare en guide for øyet. Dataene er plottet som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. Stjerner representerer p-verdi fra GLMM statistiske tester mellom parametrene beregnet på ubehandlet og anti-ICAM-1-behandlede celler (* p≤0.05).
Detaljert analyse av bruddstyrker
Siden vi brukt gjennomsnittsverdier for ruptur krefter som kan skjule kompleksiteten av limet obligasjoner, ble en mer detaljert inspeksjon av kraft hopp (som vist ved hjelp av histogrammer) gjennomføres for å få mer informasjon. Denne analysen er gitt i figur 8 hvor det TC-ECS eller TC-substrat (ICAM-1 eller BSA) kraft hopp blir registrert og presentert ved hjelp av histogrammer, ved en gitt hastighet av 5 um /s. Inspeksjon av histogrammet av T24-ECS bruddstyrker i Figur 8A (uten effekten av anti-ICAM-1) viser en gaussisk fordeling sentrert ved 32,9 pN (+/- 5,8). Interessant, denne fordelingen av krefter funnet for T24-EC interaksjonen er ganske lik den som ble oppnådd i løpet av interaksjonen mellom T24 og de ICAM-1-belagte substrat (dvs. gjennomsnittsverdi = 28,8 pN +/- 5,1) (se histogrammet i figur 8D ). På den annen side, når ECS har blitt behandlet med anti-ICAM-1-antistoff, toppen i figur 8A nesten forsvinner (arealet under kurven er delt med en faktor på ti). En ny topp sentrert ved 19 pN vises, lik den verdi av 21,5 pN funnet for T24 kommunisere med BSA-belagte overflate (figur 8E) som kan tilskrives ikke-spesifikke interaksjoner.
Effekt av et anti -ICAM-1 antistoff mot kreft-EC interaksjoner. Rupture kraft distribusjoner er Gaussian med en eller to topper avsløre tilstedeværelsen av reseptor /ligand obligasjoner eller uspesifikke interaksjoner. Sannsynlighets histogrammer av bruddstyrken (V = 5 um /s) for (A) T24-HUVEC, (B) J82-HUVEC, (C) RT112-HUVEC. Svart histogrammet representerer samspillet kreft-celle og EC uten antistoff, mens røde viser kraftfordelingen etter bruk av antistoff. Paneler D (T24-ICAM-1) og E (T24-BSA) viser bruddstyrkesannsynligheter for T24-celler i kontakt med belagte substrater. Antallet N av hendelser er angitt på histogrammet
histogram av J82-EC bruddstyrker viser en fordeling av en dobbel Gaussian distribusjon. Det er to topper i første omgang (42 PN og 70 PN) som kan ses av det store spekter av kraftverdiene. Etter inkubering med antistoffet, det siste topp (70 pN) forsvinner helt, mens den første (42 pN) senkes med en faktor på tre (figur 8B). Vi kan konkludere med at ICAM-1 er forventet å samvirke med to ligander på den J82 celleoverflaten, og at antistoffet inhiberer begge vekselvirkninger, men fortrinnsvis en. Disse obligasjonene kan være spesifikke interaksjoner med to forskjellige ligander for eksempel. I tillegg (figur 8B), vises en ny lavere topp når du bruker antistoff (≈28pN), der verdien er svært nær den som finnes for uspesifikke obligasjoner.
Ved RT112 celle er annerledes, som det kan ses i figur 8C. Det er bare en topp med og uten antistoff som ligger på samme nivå (28 pN pN og 33, ingen signifikant forskjell). Tilsetningen av anti-ICAM-1-antistoff endrer ikke den totale kurve, således ingen klar effekt blir detektert for RT112 celler, noe som indikerer at ICAM-1 er sannsynligvis ikke er involvert i denne prosessen adhesjon.
Analyse av ICAM- 1 ligander (CD43 og MUC1) uttrykk ved invasive celler T24 og J82
Blære kreft celler uttrykker ikke de vanlige ICAM-1 ligander, slik som LFA-en eller Mac-en [5]. På den annen side, ble ekspresjon av MUC1 (mucin 1) og CD43 (Leukosialin) har nylig beskrevet som ICAM-1 ligander [31], [10], [9], [32]. Derfor kvantifisert vi deres uttrykk ved flowcytometri. Resultatene i figur 9 viser at T24 celler uttrykker bare CD43 ligand mens J82 celler uttrykker både CD 43 og MUC1 ligander. Angå RT112 celler, de uttrykker bare CD43 ligand.
