Abstract
tyrosinkinasehemmere (TKI) mot EGFR og c-Met er innledningsvis effektive når de administreres hver for seg eller i kombinasjon med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter. Imidlertid er den samlede efficacies av TKI begrenset på grunn av utvikling av medikamentresistens. Derfor er det viktig å belyse mekanismer for EGFR og c-Met-TKI motstand for å utvikle mer effektive terapier. Modell NSCLC cellelinjer H1975 og H2170 ble brukt til å studere likheter og forskjeller i mekanismene for EGFR /c-Met TKI motstand. H1975 cellene er positive for T790M EGFR mutasjon, som gir resistens til dagens EGFR TKI terapier, mens H2170 celler er EGFR vill-type. Tidligere ble H2170-celler gjort motstandsdyktige mot EGFR TKI erlotinib og c-Met-TKI SU11274 ved å utsettes for progressivt økende konsentrasjoner av TKI. I H2170 og H1975 TKI-resistente celler, ble viktige Wnt og mTOR proteiner funnet å være forskjellig modulert. Wnt signal svinger, aktiv β-catenin ble oppregulert i TKI-resistente H2170 celler i forhold til foreldre celler. Gata-6, en transkripsjonen aktivator av Wnt, ble også funnet å være oppregulert ved resistente H2170 celler. I H2170 erlotinib-resistente celler, oppregulering av inaktive GSK3P (p-GSK3P) ble observert, noe som indikerer aktivering av wnt og mTOR trasé som ellers inhiberes av dets aktive form. Men i H1975 celler, Wnt modulatorer som aktiv β-catenin, GATA-6 og p-GSK3p ble nedregulert. Andre resultater fra MTT Celleviabilitet analyser viste at H1975 celleproliferasjon ikke ble signifikant redusert etter Wnt hemming av XAV939, men kombinasjonsbehandling med everolimus (mTOR-hemmer) og erlotinib resulterte i synergistisk celleveksthemming. Derfor, i H2170 celler og H1975 celler, samtidig hemmer utskillelsen av nøkkel Wnt eller mTOR pathway proteiner i tillegg til EGFR og c-Met kan være en lovende strategi for å overvinne EGFR og c-Met TKI motstand i NSCLC.
Citation: Botting GM, Rastogi jeg, Chhabra G, Nlend M, Puri N (2015) Mechanism of Resistance og Novel Targets medier Motstand mot EGFR og c-Met tyrosinkinasehemmere i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 10 (8): e0136155. doi: 10,1371 /journal.pone.0136155
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 19 september 2014; Godkjent: 31 juli 2015; Publisert: 24 august 2015
Copyright: © 2015 Botting et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold award nummer R21CA158965-01A1 (http: //www.nih .gov) til Neelu Puri. Dette arbeidet ble også finansiert delvis av en fellesskaps Grant fra Community Foundation of Norther Illinois til Neelu Puri den. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Dr. Marie Nlend er ansatt av Thermo Fisher Scientific . Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
EGFR og c-Met er reseptor tyrosin kinaser (RTK) som er høyt uttrykt i NSCLC og letter tumorigent signalering gjennom felles trasé når dysregulerte [1,2]. Flere tyrosinkinasehemmer (TKI) terapi mot EGFR og c-Met er for tiden administreres og er opprinnelig effektive i NSCLC pasienter som har visse somatiske EGFR-aktive mutasjoner som L858R [3-5]. Imidlertid er utviklingen av resistens TKI vanlig og resulterer i gjentakelse av tumorer [6,7]. Større enn 50% av alle ervervet sekundær motstand mot EGFR TKI er knyttet til utviklingen av T790M sekundære «gatekeeper mutasjon «[8-12]. Denne mutasjon kan også føre til primær EGFR TKI motstand hvis til stede før behandlingen [10]. En annen 20% av ervervet resistens mot EGFR TKI er knyttet til amplifikasjon av c-Met-reseptoren [2,13,14].
MET
genamplifikasjon og tilstedeværelsen av T790M er ikke gjensidig utelukkende, som studier har vist at mange NSCLC pasienter er positive for både endringer [2,15].
Tidligere studier av vår gruppe og andre har vist at EGFR og c-Met har betydelig krysstale som bidrar til økt aktivering av deres felles nedstrøms trasé [16]. Også det foreligger bevis på at det er en synergistisk effekt mellom EGF og HGF på tumorigenicity [1], og at EGFR og c-Met TKI kan synergi hemme NSCLC celleproliferasjon [17].
Forskning har antydet at feilregulering av Wnt veien kan være en viktig faktor som bidrar til økt vedlikehold og spredning signalisering i ulike kreft [18,19]. Andre studier tyder på at crosstalk mellom EGFR og Wnt kan forbedre lungekreft tumorigenesis [17,18,20]. XAV939, er en tankyrase hemmer en lovende små-molekyl Wnt inhibitor for tiden i prekliniske studier. XAV939 aktiverer Axin1, fremme β-catenin degradering [21], og dermed hemming av kanoniske Wnt signalering. Videre mammalian target of rapamycin (mTOR), en serin /treonin kinase som er en sentral aktør i PI3K /Akt vei, handler både opp og nedstrøms Akt [22-25] har også blitt koblet med en rekke kreftformer når dysregulerte . Dermed mTOR har også blitt en potensiell terapeutisk mål i anti-kreft terapi [26]. Rapamycin og dens deriverte, everolimus, er to lovende mTOR-hemmere for tiden i kliniske studier for lungekreft [27-30]. Kanoniske Wnt og mTOR veier kan bli negativt regulert av serin /treonin kinase GSK3p [31-33]. Hos mennesker har GSK3p to isoformer, GSK3α og GSK3P [34], med det sistnevnte er kjent for å fungere som en del av β-catenin ødeleggelse kompleks [33,35,36]. Undersøkelsen sammenligner disse alternative signalveier, spesielt viktige proteiner av Wnt og mTOR trasé, i modellen NSCLC cellelinjer positiv eller negativ for EGFR aktiverende mutasjon T790M.
Nyere studier i vårt laboratorium som involverer TKI-resistente H2170 celler har demonstrert en oppregulering av p-ERK, et protein som er kjent for å aktivere Gata-6 [17]. Gata-6 er en transkripsjonsfaktor antas å være essensiell for utviklingen av lunge epitelceller og andre embryo prosesser [37,38], ved å regulere Wnt veien [37]. Gata-6 er også kjent å lette Wnt aktivering ved å fremme transkripsjon av viktige wnt ligander [37,39-43]. Stimulering av den kanoniske Wnt reaksjonsveien til slutt resulterer i aktivering av β-catenin (defosforylerte på Ser37 og Thr41), som fremmer transkripsjon av proteiner involvert i celle proliferasjon [44,45].
Denne undersøkelse viser at å kombinere wnt eller mTOR-hemmere med gjeldende EGFR og c-Met TKI kan lykkes hemme celleproliferasjon og overlevelse i villtype EGFR NSCLC celler. Imidlertid, i tilfelle av T790M-positive celler, kan det være mulig å bryte motstand, gjennom å kombinere mTOR-inhibitorer med EGFR og c-Met TKI. Denne studien tyder på at mekanismen av resistens mot EGFR /c-Met TKI s er forskjellig i mutert (T790M) og villtype EGFR NSCLC celler. Dette indikerer at selektiv kombinatorisk behandling bør brukes for celler med villtype EGFR og T790M mutert EGFR, for å forbedre lungekreft pasienten prognose.
Materialer og metoder
Reagenser og antistoffer
Erlotinib [
N Anmeldelser – (3-Ethynylphenyl) -6,7-bis (2-metoksyetoksy) kinazolin-4-amin]. (. Cat No. E-4007) og everolimus (Cat No. E -4040) ble kjøpt fra LC Laboratories (Woburn, MA), SU11274 [[(3Z) -N- (3-klorfenyl) -3 – ({3,5-dimetyl-4 – [(4-metylpiperazin-1 -yl ) karbonyl] 1 H-pyrrol-2-yl} metylen) -N-metyl-2-okso-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonamid]] (katalog nr. S-9820) og XAV939 [3- , 5,7,8-tetrahydro-2- [4- (trifluormetyl) fenyl] -4H-thiopyrano [4,3-d] pyrimidin-4-on] (katalog nr. 53113) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich ( St. Louis, MO). Alle inhibitorer ble suspendert i DMSO og lagres som alikvoter ved -20 ° C. EGF (Cat. No. AF-100-15) og HGF (katalog nr. 100-39) ble anskaffet fra Peprotech (Rocky Hill, NJ) og ble suspendert i PBS og lagret som alikvoter ved -20 ° C.
Phosphospecific kanin monoklonale antistoffer for p-mTOR (Ser 2448, Clone D9C2), p-4E-BP1 (Thr37 /46, Clone 2855), p-GSK3p (Ser 9), Total GSK3p, Axin1 (C76H11) og p-LRP6 (C5C7), phosphospecific kanin polyklonale antistoffer for p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) og p-p70SK (T389), kanin og mus IgG sekundære antistoffer ble erholdt fra Cell Signaling Technology. Kanin polyklonalt ufosforylerte Gata-6 (sc-9055) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Et mus monoklonalt antistoff for aktiv β-catenin (05-665) ble oppnådd fra Millipore (Billerica, Massachusetts). Et mus monoklonalt antistoff for β-actin ble oppnådd fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Alle antistoffer ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner.
Cellelinjer og cellekultur
H2170 og H1975 NSCLC cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA, CRL-5928, CRL-5807 og CRL-5908, henholdsvis). De H2170 celler har villtype EGFR, mens H1975 cellene er positive for to EGFR kinase domene mutasjoner: L858R og T790M (dokumentert ved ATCC). Alle cellelinjer ble lagret i kuvøser ved 37 ° C med 7% CO
2 og ble dyrket i henhold til ATCC instruksjoner (atcc.org) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) media (Thermo Fisher Scientific, Pittsburg, Pennsylvania, Cat No: SH3002701) supplert med 10% (v /v) Fetal Bovine Serum (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, Cat No: S11050), 1% (v /v) Antibiotika Anti-fungal Solution (Life Technologies, Carlsbad, CA, Cat No: 15070-063), 1% (v /v) Sodium Pyruvate (Life Technologies, Carlsbad, CA, Cat No: 11360) og 1% (v /v) Hepes (Life Technologies, Carlsbad, CA, Cat No: 11360).
effekt av EGF /HGF og TKI på fosforylering av EGFR, c-Met og andre signalveier
Celler ble behandlet før lyse for å bestemme effekten av vekstfaktor ligander og TKI på protein uttrykk. Parentale celler ble sådd ut og tillatt å overholde og vokse i 24 til 48 timer inntil retter var omtrent 40% sammenflytende. Cellene ble så sultet i 24 timer med serumfritt RPMI (med 0,5% BSA). Etter 24 timers sult, ble cellene behandlet med eller uten respektive TKI (erlotinib eller SU11274) i 24 timer. Etter 24 timers TKI behandling ble cellene behandlet med eller uten vekstfaktor-ligander (15 ng /ml EGF i 2,5 minutter eller 40 ng /ml HGF i 7,5 minutter ved 37 ° C). Umiddelbart etter ligand behandling ble cellene lysert og oppsamlet for immunblotting.
Cell Lysis og Immunoblotting
Ved å følge alle celleforhåndsbehandlinger (som beskrevet ovenfor), ble cellene lysert i buffer (20 mM Tris , 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% NP-40, 0,42% NaF, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 nM natrium orthovanidate, og 10 mM protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich). Cellelysater ble deretter underkastet elektroforese for separasjon på 7,5 % eller 10% SDS-PAGE. Separert proteiner ble deretter overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad Laboatories, Hercules, CA) og analysert med antistoffer for wnt eller mTOR pathway relaterte proteiner. immunoblotter ble utviklet ved hjelp av Pierce ECL Substrat chemiluminescence kit (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, 32109) og modulasjoner av ulike proteiner ble beregnet ved densitometrisk analyse ved hjelp av NIH ImageJ programvare.
MTT celleviabilitet analysen
effekten av ulike TKI på H2170 og H1975 celle levedyktighet ble målt ved hjelp av MTT kolorimetrisk analyse ved bruk av fargestoff reduksjon MTT 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid fargestoff i henhold til produsentens instruksjoner. Celler ble platet ut ved 3000 celler per brønn i 96-brønners plater, og etter 24 timer ble cellene behandlet med inhibitorer i 72 timer. MTT-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, katalog nr. M5655) ble deretter tilsatt, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer, hvoretter formazankrystaller ble oppløst, og absorbans ble målt ved en bølgelengde på 570 nm. Prosentandel levedyktighet av legemiddelbehandlede celler ble beregnet i forhold til ubehandlede kontrollceller. Alle Celleviabilitet forsøkene ble utført tre ganger i replikater av seks for hver behandling tilstand.
immunfluorescens
20000 celler ble sådd ut i 8-brønns glass kammer lysbilder per brønn (Lab-Tek II Chamber Slide system, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) som var pre-belagt med poly-L-lysin (0,01% løsning) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Celler ble tillatt å holde seg i 24 timer, hvoretter cellene ble sultet over natten i serumfritt medium (med 0,5% BSA). Cellene ble deretter behandlet med EGF /HGF (15 ng /ml EGF i 2,5 minutter eller 40 ng /ml HGF i 7,5 minutter ved 37 ° C), og festes ved hjelp av 4% paraformaldehydløsning i 1X PBS. Cellene ble deretter permeabilisert (0,1% Triton X-100 oppløsning i 1 x PBS) og blokkert (buffer inneholdende 5% normalt geiteserum i 1 x PBS). Celler ble inkubert over natten med aktiv β-catenin primære antistoff (1: 400) ved 4 ° C og deretter inkubert i 1 time ved romtemperatur med IgG DyLight 488 anti-muse-sekundært antistoff (1: 250) (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) (Product # 35502) fortynnet i 1 x PBS med 1% BSA og Hoechst fargestoff nukleær farging (blå). Celler ble observert ved bruk av et Zeiss Axio Observer Z1 mikroskop. Gjennomsnittlig atom fluorescens intensitet aktive β-catenin farging ble målt ved hjelp av NIH ImageJ programvare over 10 mikroskopiske felt per behandling tilstand og verdier ble i gjennomsnitt.
qPCR analyse
200.000 celler ble sådd ut i en 35 mm tallerken og fikk lov til å følge i 24 timer. Sultende medier (RPMI med 0,5% BSA) ble deretter tilsatt til cellene i 24 timer, hvoretter total-RNA ble oppsamlet under anvendelse av Invitrogen RNA Mini Kit. RNA ble kvantifisert ved bruk av Ta 3 Nanodrop og deretter like konsentrasjoner av RNA ble anvendt for syntese av cDNA. Primersekvensene brukes for β-catenin er F: TGGATGGGCTGCCTCCAGGTGAC og R: ACCAGCCCACCCCTCGAGCCC og for GAPDH er F: TTGCCAATGACCCCTTCA og R: CGCCCCACTTGATTTTGGA. qPCR ble utført ved hjelp av Super III Platinum Two-Step QRT-PCR Kit (Life Technologies, Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoll. Ekspresjonen av hvert gen ble analysert i tre paralleller, og Ct-verdier ble normalisert til GAPDH. Dataene ble deretter analysert ved anvendelse av ΔΔCt fremgangsmåte og et brett endringer ble beregnet ved bruk av 2
(- ΔΔCt).
Statistisk analyse
Alle forsøkene ble utført i tre til fem ganger. Den t-test eller ANOVA ble brukt til å analysere den statistiske signifikans til dataene. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant gjennom hele studien.
Resultater
Sammenligning av IC
50 av foreldre og resistente H2170 cellelinjer med H1975 cellelinje
H2170-cellene ble opprinnelig moderat sensitiv til TKI erlotinib og SU11274 på grunn av deres EGFR villtype-status (tabell 1). Som beskrevet i vår tidligere studie [17], foreldre (naive) H2170-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av erlotinib (0,5 til 14 pM) og SU11274 (2,5 til 17 uM) i løpet av flere måneder for å oppnå celler med stabil motstand ved høye konsentrasjoner av disse TKI. Disse cellene viste stabil motstand etter 12 passasjer i rusfri medier. MTT-cellelevedyktighetsanalyse ble utført for å bestemme den IC
50 for erlotinib og SU11274. IC
50 verdier ble beregnet ved hjelp av Sigma Plot 12,5 programvare og resultatene er vist i tabell 1. IC
50 av erlotinib og SU11274 i H2170 erlotinib motstandsdyktig (H2170-er) og SU11274 motstandsdyktig (H2170-SR) celler ble funnet å bli 11 til 22-ganger og 4 til 5 ganger større henholdsvis [17], sammenlignet med foreldre H2170 H2170 (-P) celler. Imidlertid IC
50 av erlotinib og SU11274 ble funnet å være omtrent 15 ganger og 2 ganger høyere, henholdsvis i H1975-celler, sammenlignet med H2170 parentale celler. I denne studien ble H2170-TKI-resistente celler opprettholdt i media inneholdende 10 uM erlotinib eller 10 pM SU11274. H1975 cellene er naturlig resistente mot erlotinib, på grunn av tilstedeværelsen av den T790M-mutasjonen, og for hensikten med denne studien H1975-celler ble dyrket i medikamentfritt medium.
dual inhibering av EGFR og c- møtte TKI på H1975 celleformering
Siden den T790M EGFR mutasjonen er kjent for å gi erlotinib motstand (tabell 1) i NSCLC, er det viktig å identifisere potensielle resistens forårsaket av denne mutasjon. Derfor har vi testet for narkotika synergi på H1975 celler (positive for L858R og T790M EGFR mutasjoner) ved hjelp av erlotinib og SU11274 via MTT celleviabilitet analysen. Synergistiske virkninger på H1975 cellevekst inhibering ble observert med erlotinib og SU11274 i kombinasjon ved konsentrasjoner på 1 pM (1: 1 forhold av hvert legemiddel) og 3 um (1: 1 forhold av hvert legemiddel) (Fig 1). Men deres kombinatoriske effektene var ikke synergistisk ovenfor konsentrasjon på 5 pM av hvert medikament (1: 1 forhold) (data ikke vist). Synergisme ble bestemt ved bruk Calcusyn programvare v2.0 og kombinatorisk indeks (CI) verdier under 1 ble oppnådd (CI-verdier mindre enn 1 indikerer synergisme) [46]
H1975-celler ble sådd ut ved 3000 celler per brønn i en. 96 brønners plate og etter 24 timer ble behandlet med varierende kombinasjoner av EGFR-hemmer erlotinib og c-Met inhibitor SU11274. Etter 72 timers medikamenteksponering MTT-cellelevedyktighet Analysen ble utført. Synergistiske inhiberende virkninger på H1975 hemming av cellevekst ble observert etter kombinasjonsbehandling av erlotinib og SU11274 ved konsentrasjoner på 1 uM og 3 um (1: 1 forhold av hvert medikament). Drug synergisme ble beregnet ved hjelp Calcusyn v2.0 programvare og CI verdiene var under 1. ANOVA analyse ble brukt for å bestemme statistisk signifikante forskjeller mellom behandlingene (n = 3, p 0,01).
Rolle wnt og mTOR trasé i EGFR /c-Met TKI-motstand
for å belyse mekanismen av resistens mot erlotinib og SU11274 i H2170 celler, ble uttrykk nivåer av viktige proteiner involvert i wnt /mTOR vei bestemmes av immunoblotting. Vi har observert at aktiv β-catenin ble oppregulert 1,5 ganger og 2,0 ganger i nærvær av EGF og erlotinib henholdsvis i H2170-ER-celler, sammenlignet med samme behandlinger i H2170 parentale celler. Vi observerte også at Gata-6 ble oppregulert 2,0 til 3,0 ganger i nærvær og fravær av EGF og erlotinib på H2170-ER-celler når sammenlignet med samme behandlingene på H2170-P-celler. Videre p-GSK3p (Ser9) ble funnet å være oppregulert ca. 2 ganger i H2170-ER-celler i nærvær av erlotinib i forhold til erlotinib behandlede H2170-P-celler (figur 2).
H2170 -P, H2170-er og H2170-SR celler ble sådd ut i 35 mm retter på 125.000 celler per tallerken og sultet (RPMI 1640 med 0,5% BSA) i 24 timer før ligand (EGF og HGF) og /eller narkotika (erlotinib og SU11274 ) behandlinger. Etter western blot analyse øket ekspresjon av wnt og mTOR pathway relaterte proteiner i H2170-H2170 og ER-SR-celler ble observert i forhold til H2170-P-celler med unntak av p-GSK-3β i H2170 SR-celler. Brette endringer ble beregnet ved bruk ImageJ programvare. (N = 3, p 0,05).
På samme måte i H2170-SR celler, observerte vi aktive β-catenin ble oppregulert 2,0 til 4,0 ganger i nærvær og fravær av HGF og SU11274 ; p-GSK-3b ble oppregulert 1,5 til 2,0 ganger i nærvær og fravær av HGF og SU11274; og Gata-6 var også oppregulert 3,0 til 4,0 ganger i nærvær av HGF og SU11274, sammenlignet med samme behandlingene på H2170-P-celler (p 0,01) (Fig 2). Ingen signifikant modulasjon i uttrykket av totale proteiner ble observert mellom H2170-P, H2170-ER og H2170-SR celler (figur 2).
Økt atom akkumulering av aktive β-catenin i H2170-ER og H2170 -SR celler
på grunn av det faktum at aktive β-catenin er en nøkkel nedstrøms effektor i kanonisk Wnt signalveien og er observert å være signifikant oppregulert i H2170-H2170 og eR-SR-celler (Fig 2). Vi analyserte lokalisering av aktive β-catenin i H2170-P, H2170-ER og H2170-SR celler ved hjelp av immunfluorescens. Ved aktivering, akkumulerer β-catenin inn i kjernen, og virker sammen med TCF /LEF for å innlede transkripsjon. Det ble observert at i H2170-H2170 og ER-SR-celler, ble det øket lokalisering av β-catenin i kjernen i forhold til H2170-P-celler. Gjennomsnittlige fluorescerende intensitet av aktiv β-catenin farging i kjernen ble funnet å være 1,9 og 2,5 ganger høyere i H2170-ER-celler i forhold til H2170-P, i EGF behandlede og ubehandlede celler, henholdsvis (p 0,01) (Figur 3) . På lignende måte ble den gjennomsnittlige fluorescens-intensiteten av aktiv β-catenin farging i kjernen funnet å være 2,9 og 3,1 ganger høyere i H2170-SR-celler, sammenlignet med H2170-P-celler, i HGF behandlede og ubehandlede celler, henholdsvis (p 0,01 ) (figur 3).
H2170-P, H2170-er og H2170-SR celler ble sådd ut i 8-brønns kammermusikk lysbilder på 20.000 celler per brønn og deretter sultet over natten. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd, permeabilisert med 0,1% Triton X-100, og deretter blokkert med 5% normalt geiteserum og 0,3% Triton X-100 før inkubering med primært antistoff. Cellene ble deretter inkubert med 488 Dylight konjugert sekundært antistoff og deretter ble observert under fluorescens mikroskop. Den grønne fargen i bildet representerer aktive β-catenin flekker i cellen, og den lilla fargen representerer DAPI atom farging. Gjennomsnittlig intensitet av aktiv β-catenin farging ble kvantitativt målt ved hjelp ImageJ programvare. Vi har observert større atom akkumulering av aktiv β-catenin på H2170-H2170 og ER-SR-celler, sammenlignet med H2170-P-celler (n = 3, p 0,01).
Aktivering av mTOR sti i H1975 celler
for å belyse modus for motstand mot erlotinib og SU11274 i H1975 cellelinje (T790M-positive), ble immunoblotting utført for å analysere modulasjoner i uttrykket nivåer av viktige wnt og mTOR proteiner. Aktiv β-catenin ble funnet å bli nedregulert 1,5 ganger på H1975-celler i nærvær av erlotinib og EGF i forhold til H2170-P-celler med samme behandlinger. Gata-6 ble funnet å bli nedregulert 1/5 til 6/5 ganger in H1975-celler i nærvær og fravær av EGF og erlotinib behandling sammenlignet med samme behandlingene på H2170-P-celler. Videre ble negativ Wnt regulator Axin1 funnet å være oppregulert 1,5 ganger og 2,5 ganger på H1975-celler, sammenlignet med H2170-P-celler, i nærvær av EGF og erlotinib, respektivt (figur 4A). De modulasjoner i uttrykk av viktige Wnt veien relaterte proteiner, etter EGF og erlotinib behandling tyder på at i H1975 celler, Wnt /β-catenin veien er ikke direkte involvert i utviklingen av erlotinib motstand.
H1975 og H2170-P cellene ble platet på 125.000 celler pr tallerken i 35 mm skåler og sultet (RPMI 1640 med 0,5% BSA) i 24 timer før ligand (EGF og HGF) eller /og stoff (erlotinib og SU11274) behandlinger og analysert ved hjelp av western blot. (A) Aktiv β-catenin og Gata-6 ble observert til å bli nedregulert og p-ERK, p-mTOR, p-p70S6K, ble det observert p-LRP5 /6 og Axin1 å være oppregulert ved H1975-celler når sammenlignet med de samme behandlingene i H2170-P-celler (n≥3, p 0,05). (B) På tilsvarende måte aktiv β-catenin og Gata-6 ble observert til å bli nedregulert stund, ble p-GSK3P ikke signifikant modulert på H1975-celler sammenlignet med H2170-P-celler med samme behandlinger. Vi har også observert p-ERK, p-LRP5 /6, p-mTOR, p-p70S6K, p-4E-BP1 og Axin1 ble alle oppregulert i H1975 celler sammenlignet med H2170-P-celler med samme behandlinger (n≥3, p 0,05) (Fig. 4B)
i tillegg, p-ERK og ble observert p-LRP5 /6 blir oppregulert opp til 2,0-fold i H1975-celler, sammenlignet med H2170-p-celler i nærvær av SU11274. Også, ble p-mTOR oppregulert 1,5 ganger i fravær av EGF og erlotinib, og i nærvær av erlotinib bare, mens p-p70S6K ble oppregulert 1,5 til 3 ganger i nærvær og fravær av HGF og SU11274 på H1975-celler sammenlignet samme behandlinger i H2170-P-celler (p 0,05) (figur 4b). Vi observerte ikke noen betydelig modulasjon i uttrykket av sentrale forvaltnings proteiner i H1975 celler sammenlignet med H2170-P-celler (S1 Fig).
oppregulering av mTOR banen i H1975 celler sammenlignet med erlotinib bestandig og SU11274 motstandsdyktig H2170 celler
for å belyse likheter og forskjeller i modus for motstand som erlotinib skjer i H1975 og H2170-eR celler, immunoblotting ble utført etter EGF og erlotinib behandling. p-LRP5 /6 ble nedregulert 1/5 til 2/2 ganger in H1975-celler i nærvær og fravær av EGF og erlotinib i forhold til samme behandlingene på H2170-ER-celler. Gata-6 ble funnet å bli nedregulert 3,6 ganger og 2,9 ganger på H1975-celler i forhold til H2170-ER-celler i nærvær av EGF og erlotinib, henholdsvis og p-ERK ble funnet å være oppregulert 2,0 til 70,0 ganger hos H1975 -celler i nærvær og fravær av erlotinib og EGF i forhold til samme behandlingene til H2170-ER-celler. Også, ble p-mTOR funnet å være oppregulert opp til 1,6 ganger i nærvær av EGF bare og i fravær av både EGF og erlotinib i H1975 i forhold til H2170-ER-celler med de samme behandlinger. Videre ble p-p70S6K funnet å være oppregulert opp til 2,0-fold i H1975-celler i forhold til H2170-ER-celler i fravær og nærvær av EGF og erlotinib begge (p 0,05). (Fig 5A)
H1975, H2170-er og H2170-SR-celler ble sådd på 125.000 celler per fatet i 35 mm retter og sultet (RPMI 1640 med 0,5% BSA) i 24 timer før ligand (EGF og HGF) og /eller narkotika (erlotinib og SU11274 ) behandlinger og ble analysert ved hjelp av western blot. (A) Gata-6 og p-LRP5 /6 ble observert til å bli nedregulert på H1975-celler i forhold til H2170 ER-celler i samme behandlinger. Imidlertid ble p-ERK, p-mTOR og p-p70S6K oppregulert i H1975 celler sammenlignet med H2170-ER celler i lignende behandlinger (n≥3, p 0,05). (B) Aktiv β-catenin og GATA-6 ble observert å bli nedregulert i H1975 celler sammenlignet med samme behandlingene i H2170-SR celler. Vi observerte også at p-ERK, p-mTOR og p-p70S6K ble oppregulert i H1975 celler sammenlignet med H2170-SR celler i samme behandlingene. De fold endringene ble beregnet ved hjelp ImageJ programvare (n≥3, p 0,05).
På samme måte, for å belyse likheter og forskjeller i modus for TKI motstand forekommer i H1975 og H2170-SR celler, immunoblotting ble utført etter HGF og SU11274 behandling. Aktiv β-catenin ble observert å bli nedregulert 2,0-fold i H1975-celler, sammenlignet med H2170-SR-celler i nærvær og fravær av HGF og SU11274. Gata-6 ble nedregulert 1,5 til 6,0 ganger i H1975-celler i forhold til H2170-SR-celler i nærvær og fravær av HGF og SU11274. p-ERK ble funnet å være oppregulert 2 ganger og 6,0 ganger på H1975-celler, sammenlignet med H2170-SR-celler, i fravær av HGF og SU11274 både og i nærvær av SU11274 alene, respektivt. p-mTOR er oppregulert 5,5 ganger og 1,5 ganger i fravær av både HGF og SU11274; og i nærvær av SU11274 alene, henholdsvis i H1975-celler, sammenlignet med samme behandlinger i H2170-SR-celler. Videre p-p70S6K ble også funnet å være oppregulert 2,0 til 6,0-ganger i H1975-celler i forhold til H2170-SR-celler i nærvær og fravær av HGF og SU11274 (p 0,05). (Fig 5B)
økt aktiv β-catenin uttrykk i H2170-ER og H2170-SR celler
for ytterligere analyse av genuttrykk av β-catenin i H2170 celler vi har utført qPCR eksperimenter som beskrevet i metodedelen. Resultatene indikerer at i H2170-ER-celler ekspresjon av β-catenin ved mRNA-nivåer var ca. 3,4 ganger høyere sammenlignet med H2170-P-celler (p 0,01). Tilsvarende β-catenin ekspresjon i H2170-SR-celler var 3,2-ganger høyere i forhold til H2170-P-celler (p 0,01). Imidlertid, ingen signifikant endring ble observert i β-catenin genekspresjon i H1975-celler i forhold til H2170-P-celler. (Figur 6).
H2170 og H1975 celler ble platet på 125.000 celler per 35 mm skåler og fikk lov til å følge og vokse i 24 timer. Hvoretter cellene ble sultet (RPMI med 0,5% BSA) i 24 timer og deretter ble bearbeidet for RNA-samling. Real-Time PCR-resultatene viser at β-catenin er oppregulert i H2170-er og H2170-SR celler sammenlignet med H2170-P-celler. Mens i H1975 (T790M EGFR muterte) celler vi ikke observere noen betydelig modulering av β-catenin sammenlignet med H2170-P-celler. Uttrykk av hvert gen ble analysert i tre eksemplarer (n = 2, p 0,01).
Effekt av Wnt og mTOR-hemmere alene og i kombinasjon med erlotinib på H1975 celler
MTT celle
