Abstract
feilregulering av tett veikryss (TJs) er ofte forbundet med menneskelige sykdommer, inkludert kreftutvikling og nyere studier støtter rollen TJ integrerte proteiner i reguleringen av epithelial-til-Mesenchymale Transition (EMT). I denne forbindelse, blir ekspresjon av claudin-1, en viktig bestanddel av TJs, sterkt økt i tykktarmskreft og er årsaksmessig forbundet med tumorvekst og progresjon. Imidlertid mekanisme /s underliggende regulering av claudin-1-ekspresjon i intestinale epitelceller forblir dårlig forstått. I våre undersøkelser har vi identifisert antatte bindingsseter for transkripsjonsfaktorene tarm Cdx1, -2 og GATA4 i den 5′-flankerende region av claudin-1-genet. Våre videre studier med full lengde og /eller sletting mutant konstruerer i to forskjellige humane tykktarmskreft cellelinjer, SW480 og HCT116, viste nøkkelrolle Cdx1, Cdx2 og GATA4 i reguleringen av claudin-1 mRNA uttrykk. Men overekspresjon av Cdx2 hadde mest potente effekt på claudin-1 mRNA uttrykk og promoter aktivitet. Også i tykktarm kreft pasientprøver, observerte vi en betydelig og parallell sammenheng mellom claudin-en og Cdx2 uttrykk. Chromatin immunoprecipitation (chip) analysen bekreftet Cdx2 binding med claudin-en promoter
in vivo
. Bruke Cdx2 sletting mutant konstruerer, vi videre kartlagt Cdx2 C-terminale domenet til å være viktig i reguleringen av claudin-en promoter aktivitet. Interessant, co-uttrykk av aktivert β-catenin ytterligere indusert Cdx2 avhengige oppregulering av claudin-en promoter aktivitet mens uttrykk for dominant negativ (dn) -TCF-4 avskaffet denne aktiveringen. Tatt sammen, konkluderer vi at homeodomain transkripsjon faktorer Cdx1, Cdx2 og GATA4 regulere claudin-en genekspresjon i humane tykktarmskreftceller. Videre er en funksjonell krysstale mellom Wnt-signalisering og transkripsjonen aktivering relatert til kaudal-relaterte homeobox (CDX) proteiner og Gata-proteiner er demonstrert i reguleringen av claudin-1 promoter-aktivering
relasjon:. Bhat AA, Sharma A, pave J, Krishnan M, Washington MK, Singh AB, et al. (2012) Caudal Homeobox Protein CDX-2 Samarbeider med Wnt Pathway å regulere claudin-1 Expression i tykktarm kreft celler. PLoS ONE 7 (6): e37174. doi: 10,1371 /journal.pone.0037174
Redaktør: Frederic Andre, Aix-Marseille Universitet, Frankrike
mottatt: 06.01.2012; Godkjent: 17 april 2012; Publisert: 15 juni 2012
Copyright: © 2012 Bhat et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd CA124977 (P. Dhawan) og DK088902 (AB Singh). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tett veikryss (TJs), den mest apikale celle-celle adhesjon, bidra til å regulere polariteten og differensiert tilstand av epitelceller. Forstyrrelse av celle-celle veikryss sammen med samtidige endringer i uttrykket av tilhørende proteiner hjelper indusere invasjon og metastatisk progresjon i kreft. Claudinet familie av proteiner er integrert i struktur og funksjon av tett veikryss, og endret uttrykk for claudin familiemedlemmer; Selv om i en vevsspesifikk måte, er blitt påvist i flere krefttyper. Flere bevislinjer antyder at claudin-1 er en viktig bestanddel av TJS [1], [2], og er direkte involvert i barriere og gjerdet funksjoner av TJS [3], [4]. Videre har studier inkludert vår vist at claudin-1-ekspresjon er dysregulerte i en rekke kreftformer, inkludert kolorektal kreft [3], [5]. Vi har videre vist ved hjelp av en stor kohort av tykktarmskreftpasienter som claudin-1 mRNA uttrykk er også sterkt økt i tykktarm kreft [25]. Det som videre er her å merke seg at i tykktarmskreft, feilregulert claudin-1-ekspresjonen forbinder med tumorprogresjon og metastase [5]. Også, claudin-1 er et mål for β-catenin /Tcf signalering, en nøkkel regulator av colonic homeostase og neoplastisk vekst /progresjon [6]. Men detaljer om transcriptional regulering av tarm claudin-1 uttrykk er ikke klart forstått.
A. Western blot-analyse av Cdx1, Cdx2, GATA4, claudin-1 og claudin-4-protein ekspresjon i SW480 celler. SW480-celler ble transient transfektert med Cdx1, Cdx2 og /eller GATA4 ekspresjonsvektorer, og 20 ug av fullcelle-ekstrakter ble analysert. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. B. Densitometry for claudin-en og claudin-fire uttrykk. C. Kvantitativ Real-Time PCR-analyse. SW480-celler ble ko-transfektert med Cdx1, Cdx2 og GATA4 ekspresjonsvektorer i nærvær av de angitte reporter konstruksjoner, og kvantitativ RT-PCR ble utført. Førtiåtte timer senere ble totalt RNA isolert og utsatt for real-time PCR ved hjelp av gen-spesifikke primere. Resultatene ble nedtegnet som middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter og presentert som gangers endring. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med kontroll. Forskjeller mellom to gruppene ble analysert av den tosidige t-test og med mer enn to grupper av enveis ANOVA med post-hoc Bonferroni multiple sammenligningstest.
homeodomain proteiner Cdx1 og Cdx2 er medlemmene av halerelaterte homeobox genfamilien [7] – [9]. Studier støtter rollen til Cdx1 og Cdx2 i reguleringen av tidlig differensiering og vedlikehold av intestinale epitelceller. Studier som bruker epitelceller tarm opprinnelse har vist at modulering av ekspresjonen av Cdx1 og /eller Cdx2 har betydelige funksjonelle effekter på tarm differensiering [10], [11], proliferasjon [10], [12], og tarm-spesifikk gentranskripsjon programmet [13] – [16]. Det bør bemerkes at Cdx1 og Cdx2 binder seg til flere tarm-spesifikke promotorer for å regulere tarm-spesifikk gentranskripsjon [13] – [15], [17], [18]. Også GATA4, en sink finger transkripsjonsfaktor er involvert i regulering av proliferasjon og differensiering av intestinale epitelceller og bidrar til å regulere embryoutvikling av mage-tarmkanalen [19]. Studier har videre vist at interaksjoner av GATA4 med Cdx2 og HNF-1α hjelp regulere uttrykk av flere celle-celle adhesjon gener inkludert E-cadherin og claudin-2 [19], [20].
I denne rapporten, vi demonstrert at colonic claudin-1-genekspresjon er også et mål for den transkripsjonelle regulering av Cdx1, Cdx2 og GATA4 hvor Cdx2 viste seg å ha mest potent effekt som induserer colonic claudin-1-ekspresjon. Vi gir ytterligere data som støtter parallell sammenheng mellom claudin-en og Cdx2 uttrykk i tykktarm kreft pasientprøver. Viktigst, våre data antydet at Cdx2 regulerer claudin-1 uttrykk i samarbeid med Wnt-signalering, en kjent regulator av claudin-1 uttrykk.
Sekvensen av claudin-en promoter og identifisering av transcription- initieringssete er tidligere blitt beskrevet [21]. Antatte store konsensus bindingsseter er understreket. B. Cdx1, Cdx2 og GATA4 regulering av claudin-1 luciferase reporter-genet. SW480 (B), HCT116 (C), MCF-7 (D) og (E) MDCK-celler ble transient transfektert med et 1,2-kb claudin-1-luciferase reporter plasmid sammen med Cdx1, Cdx2 og /eller GATA4 ekspresjonsvektorer. Empty pGL3-basisvektoren ble brukt til kontrollformål. Uspesifikk plasmid-DNA ble anvendt for å opprettholde like store mengder av DNA i alle transfeksjonsmidler prøver. Resultatene er uttrykt i fold-aktivering av relativ luciferaseaktivitet etter normalisering med
Renilla
aktivitet fra 3 uavhengige eksperimenter, og verdiene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med kontroll. Forskjeller mellom to gruppene ble analysert av den tosidige t-test og med mer enn to grupper av enveis ANOVA med post-hoc Bonferroni multiple sammenligningstest.
Resultater
Tvungen Expression of Cdx1, Cdx2 eller GATA4 Induserer claudin-1 Expression i tykktarm kreft celler
for å undersøke om Cdx1, Cdx2 og /eller GATA4 bidra til å regulere tarm claudin-1 uttrykk, bestemt vi effekten av overuttrykk på over transkripsjonsfaktorer ved endogen claudin-1 uttrykk. For dette formål har vi brukt SW480 kolon kreftceller som uttrykker lave nivåer av endogen claudin-1 [5]. Pattedyr uttrykk plasmid konstruksjoner som inneholder full-lengde Cdx1, Cdx2 eller GATA4 ble transient transfektert i SW480 celler. Tomme ekspresjonsplasmider tjente som kontroll. Førti-åtte timer etter transfeksjon, ble prøver oppsamlet og ble utsatt for fremstilling av lysatet eller total-RNA-ekstrakt. Immunoblotting ved bruk av antigen-spesifikt antistoff ble gjort for å bekrefte overekspresjon og tilsvarende nivåer av overekspresjon av antigener under studie (figur 1A). Som vist i figur 1B, observerte vi robust oppregulering av claudin-en i celler som overuttrykker Cdx1 (3,8 gangers ± 0,451), Cdx2 (6,5 gangers ± 0,854) eller GATA4 (3,3 gangers ± 0,115) på proteinnivå. Kvantitativ RT-PCR viste lignende induksjon av claudin-1-mRNA-ekspresjon ved overekspresjon av alle de ovennevnte transkripsjonsfaktorer og nok en gang denne induksjon var maksimal i celler overuttrykkende Cdx2 (figur 1C). Denne effekten av Cdx1, Cdx2 eller GATA4 ved claudin-1-ekspresjon ble bestemt på grunn ekspresjon av claudin-4, enda et claudin familiemedlem, ikke ble påvirket av den tvungne ekspresjon av enhver av de ovennevnte transkripsjonsfaktorer (figur 1A og amp; B).
SW480-celler ble ko-transfektert med forskjellige kombinasjoner av Cdx1, Cdx2 og GATA4 ekspresjonsvektorer i nærvær av angitte reporter-konstruksjoner, og luciferase-analyser ble utført. Førti-åtte timer senere ble cellene lysert og luciferaseaktivitet ble målt. Resultatene ble nedtegnet som middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter og normalisert luciferaseaktiviteten i hver cellelinje ble presentert som relativ luciferaseaktivitet. Middelverdien av celler transfektert med pGL3-basisvektor i fravær av ekspresjonsvektorer ble satt til 1. B og C. Western blot-analyse av claudin-1-protein ekspresjon i SW480 celler. SW480-celler ble transfektert med forskjellige kombinasjoner av Cdx1, Cdx2 og GATA4 ekspresjonsvektorer og 20 ug av proteiner ble analysert. ** P 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 sammenlignet med kontroll. Forskjeller mellom to gruppene ble analysert av den tosidige t-test og med mer enn to grupper av enveis ANOVA med post-hoc Bonferroni multiple sammenligningstest.
A. Rapportør konstrukter inneholdende sekvensielt slettet 5′-flankerende fragmenter ved 1,2 kb claudin-1 (-1160 /-260) ble fremstilt og transfektert inn i SW480 (B) og HCT116 (C) celler som beskrevet under «Eksperimentelle metoder». Resultatene er uttrykt som relativ luciferaseaktivitet av tre forskjellige eksperimenter utført i triplikat (gjennomsnitt ± S.D.). Forskjeller mellom to gruppene ble analysert av den tosidige t-test og med mer enn to grupper av enveis ANOVA med post-hoc Bonferroni multiple sammenligningstest.
Cdx1, Cdx2 og GATA4 Reguler claudin-en gentranskripsjon i tykktarm kreft celler
i ovennevnte studiene, tvunget uttrykk for Cdx1, Cdx2 eller GATA4 resulterte i en økning i claudin-1 protein og mRNA-uttrykk. Derfor vi videre fastslått om Cdx1, Cdx2 og /eller GATA4 bidra til å regulere claudin-en transkripsjon. I denne forbindelse, utførte vi luciferase reporter-analyse ved anvendelse av en human claudin-1-promoteren (-1160 /+ 160) -luciferase reporter-konstruksjonen beskrevet tidligere [21] betegnet som pGL3 /-1.2Cld-1 (figur 2A) gjennom manuskriptet. Den -1160 til 160 bp region av menneskelig claudin-en promoter inneholder antatte CDX, HNF og Gata bindingssteder sammen med de antatte bindingsseter for TCF /Lef-en (figur 2A). SW480-celler ble transient transfektert med pGL3 /-1.2Cld-1 eller pGL3-basis (vektor alene) sammen med en referanse reporter plasmid. Luciferaseaktiviteten av pGL3 /-1.2Cld-1 ble normalisert til den av pGL3-basis i tillegg til referansevektor. Ektopisk uttrykk for Cdx1 eller GATA4 endret ikke uttrykket nivået av Cdx2, heller ikke Cdx2 overekspresjon ha en merkbar effekt på Cdx1 eller GATA4 protein uttrykk (Figur 1a). Over-uttrykk for enten Cdx1 eller GATA4 resulterte i en ~3-dobling i promoter aktivitet pGL3 /-1.2Cld-en. Imidlertid lignende over-ekspresjon av Cdx2 resulterte i en 6-ganger økning i aktiviteten av den samme konstruksjon (figur 2B). Vi observerte en lignende trend med induksjon av pGL3 /-1.2Cld-en-drevet luciferase aktivitet i HCT116 tykktarmskreft, som var 2,5-3 ganger ved overekspresjon av Cdx1 og GATA4 og ~4-fold ved overekspresjon av Cdx2 (figur 2C). Vi har fått lignende resultat ved å bruke en lengre 3,3 Kb (-3140-160) claudin-en promoter reporter analysen, som ikke var signifikant forskjellig i forhold til 1,2 Kb claudin-en promoter (Figur S1). Derfor fortsatte vi bruken av 1,2 Kb claudin-en promoter for videre studier. Våre videre studier støttet spesifisitet av våre ovennevnte funn som over-uttrykk for enda en transkripsjonsfaktor HNF-1α påvirket ikke claudin-en promoter aktivitet i enten SW480 celler (Figur S2). Vi ytterligere bekreftet spesifisitet av våre funn til colonic claudin-1 uttrykk som ligner forbigående overekspresjon av Cdx1, Cdx2 eller GATA4 i menneskelig brystkreft celler (MCF-7) eller nyre epitelceller (MDCK II-celler) økte ikke claudin-en promoter aktivitet (figur 2D E)
HD. homeodomain; A, B, C: konserverte domener. B. Luciferase aktivitet etter kotransfeksjonen med Cdx2 villtype og trunkeringstegn mutanter. Sletting av Cdx2 C-terminalen (Cdx2CD) signifikant (***
p
0,001) redusert claudin-en reporter aktivitet. C. Western blot analyse ved hjelp av anti-Flag antistoff for å sjekke tilsvarende uttrykk for Cdx2 trunkeringstegn mutanter i SW480 celler transient transfektert med Cdx2 trunkeringstegn mutant ekspresjonsvektorer. p-aktin ble brukt som lasting kontroll. D. Cdx2 binding til den 5′-flankerende region av claudin-1-genpromoteren er vist av Chip-analyse. Formaldehyd tverrbundet kromatin fremstilt fra 5 x 10
7 SW480-celler ble inkubert med antistoffer mot Cdx2 eller med IgG (negativ kontroll). Tverrbinding av immunopresipitatene ble reversert, og DNA renset og analysert ved bruk av primere som var spesifikke for enten claudin-1 promoter region eller for glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase. Resultatene viser at induksjonen av claudin-1 promoter-aktivitet ved Cdx2 krever Cdx2-C-ende domene.
Cdx1, Cdx2 og GATA4 transkripsjonsfaktorer virker synergistisk for å regulere ekspresjon av forskjellige gener [19]. Derfor fant vi ut om en lignende synergisme eksisterte blant Cdx1, Cdx2 og GATA4 i reguleringen av claudin-1 genet transkripsjon. For å teste, vi co-transfektert Cdx1 med Cdx2, Cdx1 med GATA4 og Cdx2 med GATA4 i SW480 celler. Faktisk, co-uttrykk for Cdx1 med Cdx2, Cdx1 med GATA4 eller Cdx2 med GATA4, alt resultert i betydelig økning (9-13 ganger) i claudin-en promoter aktivitet (figur 3A). Denne synergisme i reguleringen av claudin-1-ekspresjon ble ytterligere bekreftet på protein nivåer hvor claudin-1-ekspresjon ble indusert (8-10 ganger) sammenlignet med (3-6 ganger) med Cdx1, Cdx2 eller GATA4 alene (figur 3B C)
claudin-1 promoter-aktivitet i SW480 (A) og HCT 116-celler (B).. Cellene ble transient ko-transfektert med uttrykk vektorkonstruksjoner for aktivert β-catenin (S33Y) sammen med Cdx1, Cdx2 eller GATA4 ekspresjonsvektorer. Claudin-en promoter aktivitet ble opphevet ved co-transfeksjon av dnTcf-4 med Cdx1, Cdx2 eller GATA4 ekspresjonsvektorer SW480 (C) og HCT116 (D) celler.
claudin-en Arrangøren Inneholder bindingsseter for CDX og GATA transkripsjonsfaktorer
Basert på vår over funn, vi videre undersøkt mulige bindingssteder for Cdx1, Cdx2 og GATA4 i claudin-en promoter. Vi brukte beregnings analyse ved hjelp MatInspector programvare (Oxford Molecular Group) for å identifisere mulige bindingsseter for konsensus Cdx- og GATA-bindende elementer (Figur 2A). For å bekrefte den funksjonelle effekten av disse antatte bindingsseter, og også for å identifisere regioner som er involvert i reguleringen av claudin-1 gentranskripsjon, genererte vi claudin-1-promoteren sletting konstrukter som starter fra 5′-flankerende region som tidligere beskrevet [21]. Figur 4A viser full lengde promoter konstruksjon (-1160 /+ 160) og ni sletting konstruksjoner (-850 /+ 160, -740 /+ 160, -665 /+ 160, -550 /+ 160, -490 /+ 160, -420 /+ 160, -350 /+ 160 og -260 /+ 160). Reporteren konstruerer generert ovenfor ble deretter co-transfektert med Cdx1, Cdx2 eller GATA4 uttrykk konstruerer inn SW480 og HCT116-celler. The full-lengde promoter konstruksjon inneholdt konsensus bindingsseter for CDX og GATA4, sammen med bindingssetet for Tcf /Lef-en, og indusert claudin-en promoter aktivitet 5-6 ganger i SW480 celler (figur 4B). Men dette induksjon ble tapt ved sletting av den proksimale 310 bp (-1160 til -850), som foreslo at denne 310 bp regionen har områder som er viktige for claudin-en promoter induksjon av transkripsjonsfaktorer som er under etterforskning. Lignende funn fra HCT116 cellene støttet denne oppfatningen (Figur 4C). Begge cellelinjer utstilt lignende mønstre av promoter aktivitet selv om signalene var generelt sterkere i SW480 celler. Dette 310 bp regionen inneholdt en CDX, to Gata konsensusbindingsseter og en Tcf /Lef-en bindingsstedet tyder potensielle betydning av disse områdene i reguleringen av claudin-en genuttrykk.
A. Sammenheng mellom claudin-en og Cdx2 uttrykk i tykktarmskreft. Data fra tilpasset kolorektal kreft vev arrays (microarray utviklet ved Vanderbilt) som inneholder kirurgiske prøver fra 50 grunnskoler og sammenkoblede metastatisk fersk frosne menneskelige kolorektal kreft prøvene er vist. En betydelig direkte sammenheng mellom claudin-en og Cdx2 uttrykk ble observert (** P 0,01) med Yates khikvadrattest. B. representant farging for claudin-1 (a) og Cdx2 (b) i tykktarm kreft pasientprøver. Seksjoner ble kontra med hematoksylin for å bestemme de strukturelle detaljer.
Den C-terminale domenet er nødvendig for Cdx2 formidlet aktivering av claudin-en transkripsjonen aktivitet
Over studier antydet en rolle Cdx1 , Cdx2 og GATA4 i reguleringen av claudin-en promoter. Men Cdx2 syntes å ha den mest potente effekt på claudin-en promoter aktivitet. Derfor, i videre studier, bestemt vi Cdx2 domene som er nødvendig for den transkripsjonelle aktivering av claudin-1-promoteren. I denne forbindelse har vi testet effekten av Cdx2 delesjonsmutant konstrukter for deres evne til å indusere claudin-1 promoter-aktivitet (figur 5A) [22]. Immunoblot analyse ved hjelp av anti-flag antistoff bekreftet lignende uttrykk nivåer av Cdx2 sletting mutant konstruksjoner (figur 5C). Resultatene viste at sletting av den kanoniske transkripsjon aktiveringsdomene (Cdx2 δ55-136), N-terminale områder (Cdx2 δ15 eller Cdx2 δ50) eller regionen mellom aminosyrene 140 og 180 (Cdx2 δ140-180) hadde ingen signifikant effekt på claudin -1 promoter aktivitet. I motsetning til dette, delesjon av Cdx2 C-terminale 244-311 (Cdx2CD) redusert claudin-1 promoter-aktivitet ved 5-ganger sammenlignet med villtype Cdx2 (figur 5B). Samlet utgjør disse studiene tyder på at Cdx2 C-terminale domenet er nødvendig for Cdx2 avhengige induksjon av claudin-en promoter aktivering.
For å kunne fastslå om Cdx2 bindes til claudin-en promoter
in vivo
utførte vi ChIP analyse og sammenlignet SW480 celler som overuttrykker Cdx2 med SW480 celler transfektert med tom uttrykk plasmid vektor. Den Figur 5D viser den resulterende DNA trukket ned ved hjelp av anti-Cdx2 antistoff som inneholder sekvensen som flankerer CDX-bindingssetet. Dette antydet at Cdx2 bindes til CDX-sekvenselementer innenfor 310 bp av claudin-1-promoteren, og dette øker bindings ved overekspresjon av Cdx2 i SW480 celler, som i sin tur øker claudin-1 promoter-aktivitet. For å kunne fastslå om C-terminal er viktig for Cdx2 binding til claudin-1-promoteren, vi overuttrykt Cdx2CD (C-terminal delesjonsmutant) eller en N-terminal delesjonsmutant som ikke påvirker den claudin-1 transkripsjonen aktivitet (Cdx2 δ50 ) i SW480 celler og utført ChIP analyse. Brikken analyse viste at den økte bindingen på grunn av full-lengde Cdx2 overekspresjon ble opphevet ved overekspresjon av Cdx2CD men ikke den N-terminale delesjon (Cdx2 δ50) mutant (figur 5D). Disse resultatene antydet at Cdx2 C-terminale domene er viktig for bindingen av Cdx2 til claudin-1 promoter og Cdx2-avhengig induksjon av claudin-1 promoter-aktivitet.
En funksjonell krysstale av Wnt signalisering og CDX-relaterte Transkripsjonell aktivering regulerer claudin-en promoteraktivitet
claudin-1 er et kjent mål TCF /Lef-en signale [6] og TCF /Lef-1 elementer som er til stede i -1160 til -850 region av claudin- en promoter. For å teste effekten av β-catenin /Tcf /Lef-1, claudin-1-promoteren ble underkastet ko-transfeksjon i nærvær eller fravær av aktivert β-catenin (S33Y) sammen med Cdx1, 2 eller GATA4. Transiente transfeksjoner ble utført i SW480 og HCT116-celler og luciferaseaktiviteten av pGL3 /-1.2Cld-1 ble normalisert til pGL3-Basic i tillegg til referansevektor. Overekspresjon av aktivert β-catenin (S33Y) med Cdx1, Cdx2 eller GATA4 resulterte i atleast to fold ytterligere induksjon av claudin-en promoter-mediert genuttrykk i forhold til Cdx1, Cdx2 eller GATA4 alene (Figur 6A B). Motsatt, når vi overuttrykt Cdx1, Cdx2 eller GATA4 med dnTcf-4, ble induksjon av claudin-1-promoteren opphevet antyder potensiell krysstale mellom disse faktorene (figur 6C & D). Til sammen våre data antydet at modulering av β-catenin /Tcf /Lef aktivitet spiller sentral rolle i CDX, GATA4 mediert regulering av claudin-1 uttrykk.
claudin-en og Cdx2 Uttrykk er korrelert i Human tykktarms karsinom Prøver
Cdx2 protein uttrykk er assosiert med avanserte stadier av tykktarms tumorigenesis [23]. Claudin-1 uttrykk positivt korrelerer med tumorprogresjon og metastase i tykktarmskreft [5]. Derfor undersøkte vi en mulig sammenheng mellom Cdx2 og claudin-1 uttrykk i tykktarmskreft. Vi undersøkte mulighetene korrelasjon mellom claudin-en og Cdx2 uttrykk i en stor bestand av menneskelige vevsprøver. Immunhistokjemisk analyse for claudin-en og Cdx2 i tilpassede kolorektal kreft vev arrays (microarray utviklet ved Vanderbilt University av Dr. M.K. Washington, som inneholder kirurgiske prøver fra 50 primære og paret metastatisk Dypfryst menneskelige tykktarmskreft prøve) ble utført. Resultatene viste dominerende atom farging for Cdx2 mens claudin-en farging var overveiende cytosolic om noen punktformet membran farging ble også observert (figur 7B). Viktigere, videre analyse viser en signifikant korrelasjon (p 0,01) mellom claudin-1 og Cdx2 uttrykk i 36:50 (72%) tarmkreft prøver (figur 7A.). Samlet utgjør disse data tyder på en direkte sammenheng mellom de uttrykk for Cdx2 og claudin-en i kolorektal karsinom.
Diskusjoner
feilregulering av colonocyte differensiering ligger i kjernen av tykktarmskreftutvikling. Claudin-1-ekspresjonen er sterkt øket i tykktarmskreft og er årsaksmessig forbundet med tumorvekst og progresjon [5]. Av interesse, i tillegg til den feilregulert proteinekspresjon og lokalisasjon, øker claudin-1 mRNA-ekspresjon også i tykktarmskreft [25]. Det er også verdt å merke seg at genetisk manipulering av claudin-1 uttrykk i tykktarm kreft celler resulterte i skarpe og inverse endringer i deres differensiering status inkludert E-cadherin uttrykk [5], [24]. Også induksjon av epitelial differensiering i tykktarm kreft celler ved hjelp Histone deacetylase (HDAC) hemmere forbundet med en bestemt reduksjon i claudin-1 uttrykk blant claudin familiemedlemmer [25]. Tatt sammen, vises claudin-1-ekspresjonen for å påvirke colon carcinogenesis gjennom modulering av colonic epithelial celledifferensiering. Derfor, undersøkte vi rollen til transkripsjonsfaktorer viktige i regulering av tarm epitelial differensiering, så vel som kolon karsinogenese i reguleringen av claudin-1 mRNA-transkripsjon. Nøkkelen utfallet av våre studier ved hjelp av to ulike og mye brukt tykktarmskreft cellelinjer var (i) Cdx1, Cdx2 og GATA4 hjelp regulere claudin-en gentranskripsjon og denne forskriften var bestemt til cellene i tarm opprinnelse, (ii) Cdx2 er mest potent induser av claudin-en promoter aktivitet blant Cdx1, Cdx2 og GATA4, og fysisk binder seg til CDX-konsensus bindingssetet /s på claudin-en promoter, som bestemmes av chip-analyse, (iii) Cdx1, Cdx2 og GATA4 regulere colonic claudin-1 uttrykk gjennom potensiell synergi mellom hver-andre og gjennom den potensielle krysstale med Wnt-signalveien. Til sammen i denne rapporten gir vi de første innsikt i de komplekse transkripsjonen aktiverings hendelser som regulerer tarm claudin-1 uttrykk.
hale homeobox protein Cdx1 uttrykkes hovedsakelig i krypten rommet, mens Cdx2 protein er påvist i både krypten og Haug avdelinger [26]. Viktigere, utfall av flere studier antyder at rollen Cdx1 og Cdx2 i reguleringen av intestinal homeostase er ofte komplementære og kan avhenge av modningen av intestinale epitelceller [27]. Disse funnene er supplert med demonstrasjonen av en ganske diskret rolle Cdx1 i regulering av tarm epitelcelleproliferasjon, mens Cdx2 spiller viktig rolle i regulering av differensieringen status for de intestinale epitelceller [28]. GATA4 også tilhører en familie av transkripsjonsfaktorer som spiller viktig rolle i reguleringen av embryogenese og muligens tidlige modning av intestinale epitelceller [29]. GATA4 sammen med GATA5 /6 har vært assosiert med celleoverlevelse, celleproliferasjon, og neoplastisk transformasjon av forskjellige celletyper [8] – [15]. Spesielt blant gastrointestinal kreft, er GATA4 forsterket i -10% av esophageal adenokarsinomer og Barrett metaplasi [30]. Role of GATA4 i reguleringen av tykktarmen karsinogenese er ikke godt undersøkt skjønt begrenset studier antydet at det kan fungere som en tumor suppressor i tykktarmskreft [31]. Men man trenger ikke å være advarte i den spesifikke funksjonelle utformingen av slike transkripsjonsfaktorer som sin funksjon /s er ofte kontekstavhengig og samspill med andre transkripsjons regulatorer er også viktig.
Av interesse, rollen Cdx2 transkripsjonsfaktor i reguleringen av tykktarmskreft fortsatt kontroversielle og studier tyder på sin rolle som en positiv eller negativ tumor modulator «. I denne forbindelse mus som er heterozygote-null for Cdx2 gen utvikle colonic hamartomas etter den gjenværende Cdx2 allelet er tapt [32], [33]. Disse heterozygote-null Cdx2 mus er også følsom for azoxymethane (AOM) indusert colonic adenokarsinom [34]. Også sammensatte heterozygoter for Cdx2 og adenomatøs polypose coli (APC) gener utvikle flere adenomatøse polypper i tykktarmen i forhold til deres heterozygot
Apc
kullsøsken [35]. Sammen vil ovennevnte funn tyder funksjon av Cdx2 som et kolon tumor suppressor. Imidlertid har immunhistokjemisk analyse påvist sterk Cdx2 uttrykk i ~90% av de menneskelige tykktarmskreftprøver [38], [39]. Videre Cdx2-overekspresjon i tykktarm kreft celler induserer forankringsuavhengig vekst og celle overlevelse [36]. Av interesse, fremmer Cdx2 forankringsuavhengig vekst gjennom transkripsjons undertrykkelse av IGFBP-3 [37]. Dermed kan en svulst fremmende rolle Cdx2 i tykktarmskreft tenkes. Tatt sammen, kan det bli postulert at rollen til Cdx2 i reguleringen av tykktarmskreft kan avhenge av differensiering status for tykktarmskreftceller og interaksjon med andre transkripsjonsfaktorer.
Resultater fra flere studier har avslørt eksistensen av et komplekst samspill mellom Cdx1, Cdx2, GATA4 og HNF-1α i induksjon av intestinal genuttrykk inklusive claudin familiemedlem, claudin-2 [40], [41]. Det er viktig å merke seg at i likhet med claudin-1, claudin-2 ekspresjon også oppregulert i colon carcinogenesis [42]. Cdx2 er blitt demonstrert å spille rolle i reguleringen av andre celle-celle adhesjon proteiner, inkludert LI-cadherin, claudin-3 og claudin-4 [20]. I vår nåværende studie har vi identifisert konsensus CDX-bindingssetet samt GATA-bindingssetet i den menneskelige claudin-en promoter. Det faktum at tvangs ekspresjon av Cdx1, Cdx2 eller GATA4 induserte ikke bare claudin-1-protein og mRNA-ekspresjon, men også indusert luciferase-rapportøraktivitet avhengig av full-lengde human claudin-1-promoteren (-1160 til 160) bærer en kausal rolle av ovennevnte transkripsjonsfaktorer i reguleringen av claudin-1-ekspresjon. Spesielt, delesjon av claudin-en promotorsekvens -1160 til -840 bp (310 bp delesjon) av den 5′-flankerende område som inneholder Cdx- og GATA4 bindingssteder avskaffet økning i luciferase-aktivitet observert ved bruk av full-lengde promoter konstruere. Videre våre funn at Cdx1, Cdx2 eller GATA4 avhengig induksjon av claudin-en promoter aktivitet kan bli ytterligere forbedret ved ovenfor transkripsjonsfaktorer var co-uttrykt støtter en kompleks inter-avhengighet blant disse transkripsjonsfaktorene i reguleringen av claudin-1 uttrykk . Det faktum at lignende tvangs uttrykk for HNF-1α ikke påvirker claudin-1 uttrykk gjengir spesifisitet til våre funn (figur S2). Videre våre funn at lignende overekspresjon av Cdx1, Cdx2 eller GATA4 i renale epiteliale og brystcancerceller hadde ingen tydelig effekt på claudin-1-ekspresjonen tyder på at dette ikke er en universell mekanisme av claudin-1-ekspresjonen, og er heller tykktarm spesifikk. Det er mulig at disse faktorene kan kreve andre co-faktorer for å være aktiv, som er til stede bare i kolon kreftceller.
Våre data videre foreslått at blant de transkripsjonsfaktorer som undersøkes, er Cdx2 de mest potent induser av claudin-1 uttrykk. Ja, våre studier med ChIP analyse viste en direkte sammenheng av Cdx2 med claudin-en promoter og dermed antydet at claudin-en er et direkte mål for Cdx2 avhengig transkripsjonsregulering. Det er videre bemerkelsesverdig at observerte binding av Cdx2 med claudin-1-promoteren var ikke avhengig av Cdx2-transkripsjonsaktiveringsdomenet som delesjon av Cdx2 N-terminus (Cdx2ND) hadde ingen virkning på bindingen Cdx2 med claudin-1-promoteren.
