Abstract
Innledning
Ataxia telangiectasia mutert og Rad3 Relaterte (ATR) protein kinase er en nøkkel sensor av enkelttrådet DNA assosiert med fastlåste replikasjonsgafler og reparasjon av mellomprodukter som genereres i løpet av DNA-reparasjon. XRCC1 er en kritisk enzym i enkelt strand pause reparasjon og basen excision reparasjon. XRCC1-LIG3 komplekset er også en viktig bidragsyter til ligation trinn i nucleotide excision reparasjon respons.
Metoder
I denne studien undersøkte vi syntetisk dødelighet i XRCC1 mangelfull og XRCC1 dyktig kinesisk hamster eggstokk (CHO) og menneske eggstokkreft celler ved hjelp av ATR-hemmere (NU6027). I tillegg har vi også undersøkt muligheten for ATR-hemmere å forsterke cisplatin cytotoksisitet i XRCC1 mangelfull og XRCC1 dyktig CHO og humane kreftceller. Klonogene analyser, alkaliske COMET analyser, γH2AX immunocytochemistry, FACS for cellesyklus samt FITC-annexin V flowcytometrisk analyse ble utført.
Resultater
ATR hemming er syntetisk dødelig i XRCC1 manglende celler som dokumentert av økt cytotoksisitet, akkumulering av dobbel tråd DNA pauser, G2 /M cellesyklus arrest og økt apoptose. Sammenlignet med cisplatin alene, kombinasjon av cisplatin og ATR inhibitor resulterer i forbedret cytotoksisitet i XRCC1 manglende celler i forhold til XRCC1 dyktige celler.
Konklusjoner
Våre data gir bevis for at ATR hemming er egnet for syntetiske dødelighet søknad og cisplatin chemopotentiation i XRCC1 mangel eggstokkreft celler
Citation. Sultana R, Abdel-Fatah T, Perry C, Moseley P, Albarakti N, Mohan V, et al. (2013) Ataxia telangiectasia mutert og Rad3 Relaterte (ATR) Protein Kinase Hemming Er Syntetisk Lethal i XRCC1 Mangel eggstokkreft celler. PLoS ONE 8 (2): e57098. doi: 10,1371 /journal.pone.0057098
Redaktør: Todd W. Miller, Dartmouth, USA
mottatt: 8 november 2012; Godkjent: 17 januar 2013; Publisert: 25 februar 2013
Copyright: © 2013 Sultana et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Targeting DNA-reparasjon for syntetisk dødelighet er et spennende nytt. strategi for personlig terapi i eggstokkreft. DNA-reparasjon er nødvendig for behandling DNA-skade indusert av kjemoterapi slik som platinating midler (carboplatin, cisplatin) [1]. Intra-trådtverrbindings DNA-addukter indusert ved platinating midler, hvis reparasjon, til syvende og sist føre til celledød [2], [3]. DNA intra-strand tverrbindinger er reparert hovedsakelig av nukleotid-excision reparasjon (NER) i celler [4], [5]. Platinating agenter kan også generere oksygen frie radikaler som induserer oksidativt grunn skader som behandles av DNA basen excision reparasjon (BER) pathway i celler [6], [7].
XRCC1 (X-ray reparasjon kryss – fallende gen 1) proteinet er en kritisk faktor i BER og enkeltstrengen pause reparasjon pathway (SSBR). XRCC1-LIG3 komplekset er også en viktig bidragsyter til ligation trinn i nucleotide excision reparasjon (NER) respons. XRCC1, et 70-kDa-proteinet, har ingen kjent enzymatisk aktivitet (oversikt i [8], [9], [10]). XRCC1 fungerer som en molekylær scaffoldprotein og koordinerer DNA-reparasjon ved å samhandle med flere komponenter av BER /SSBR som PARP-1 [Poly (ADP-ribose) polymerase 1], DNA glykosylaser, AP endonuklease (APE1) og andre (anmeldt i [ ,,,0],8], [9], [10]). XRCC1 mangel i cellene føre til opphopning av DNA enkelttrådbrudd (SSBs), indusere mutasjoner og gi forhøyede nivåer av Søsterkromatidutbytting børser. XRCC1 mangel på cellelinjer medføre overfølsomhet for ioniserende stråling og kjemoterapi [9]. I menneskelige assosiasjonsstudier, kan germline polymorfismer i XRCC1 påvirker kreftrisiko [11], [12] og innflytelse respons på platinumbasert kjemoterapi [13], [14], [15], [16]. I human ovariecancer Vi har nylig vist at tumorer ofte over-uttrykke XRCC1 (48%) og signifikant assosiert med høyere trinn (p = 0,006), serøse typen tumorer (p = 0,008), sub-optimale de-bulking (p = 0,004 ), en dobling av risiko for død (p = 0,007) og progresjon (p 0,0001) [17]. I multivariat analyse ble XRCC1 uttrykk uavhengig assosiert med overlevelse i eggstokkreft pasienter [HR 2,3, p = 0,002]. XRCC1 negative tumorer var assosiert med platina følsomhet (p 0,0001). Pre-klinisk vi også bekreftet at XRCC1 negative celler er overfølsom mot cisplatin sammenlignet XRCC1 positive celler [17]. Overfølsomhet for cisplatin i XRCC1 negative celler var assosiert med akkumulering av DNA-trådbrudd og G2 /M cellesyklus arrest [17]. Våre data antyder derfor at XRCC1 er en lovende biomarkør i eggstokkreft.
ataxia telangiectasia mutated og Rad3 Related (ATR) protein kinase er en nøkkel sensor av enkelttrådet DNA assosiert med fastlåste replikasjonsgafler, så vel som genereres i løpet av BER og dobbel tråd pause reparasjon som DNA reparasjon mellomprodukter. Aktivert ATR i sin tur fosforylerer mange substrater som er involvert i cellesyklusregulering, DNA-replikasjon, DNA-reparasjon og apoptose (oversikt i [18], [19], [20], [21], [22]). I prekliniske studier kan ATR hemming resultere i kjemoterapi har allergi [22], [23], [24]. Lavmolekylære inhibitorer av ATR er for tiden under utvikling for terapeutisk anvendelse i kreft [20], [21], [22].
Evnen PARP-inhibitorer å indusere syntetisk dødelighet i BRCA mangel eggstokkreft [25], [26], [27] tyder på at ytterligere faktorer innen BER /SSBR kan være egnet for slike personlige tilnærminger. XRCC1 er en kritisk faktor i BER, SSBR og NER. ATR er en nøkkel sensor av SSBs. I denne studien har vi undersøkt og bekreftet syntetisk dødelighet i XRCC1 manglende celler behandlet med ATR-hemmere. Videre sammenlignet med cisplatin alene, kombinasjon av cisplatin og ATR inhibitor behandlingsresultater i økt cytotoksisitet i XRCC1 manglende celler i forhold til XRCC1 dyktige celler.
Materialer og metoder
Komponenter og reagenser
lite molekyl ATR-hemmere NU6027 og VE-821 ble kjøpt fra Tocris Bioscience, UK og Tinib-Tools, Tsjekkia hhv. Forbindelsene ble oppløst i 100% DMSO og lagret ved -20 ° C. Cisplatin (1 mg /ml) ble hentet fra Institutt for farmasi, Nottingham University Hospitals, UK
cellelinjer og kultur
Tidligere godt karakteriserte kinesisk hamsterovarie (CHO).; CHO9 (Wild type), EM-C11 (XRCC1-mutant: C389Y substitusjon fører til XRCC1protein ustabilitet), EM-C12 (XRCC1-mutant: E98K substitusjon som resulterer i redusert XRCC1 protein integritet) [28] ble gitt av professor Małgorzata Z. Zdzienicka Institutt for molekylær celle genetikk, Nicolaus-Copernicus University i Torun, Bydgoszcz 85-094, Polen. Celler ble dyrket i Hams F-10 media (PAA, UK) [supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (PAA, UK) og 1% penicillin /streptomycin]. EM9-V (XRCC1 mutant) og EM9 celler stabilt transfektert med et menneskelig XRCC1 uttrykk vektor (EM9-XH celler) [29] ble gitt av professor Keith Caldicott, Genome Skader og stabilitet Centre, University of Sussex, UK. Celler ble dyrket i DMEM medier (PAA, UK) [supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (PAA, UK) og 1% penicillin /streptomycin]. Eggstokkreft celler OVCAR-3 OVCAR-4 og ble dyrket i RPMI-medium (PAA, UK) [supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (PAA, UK) og 1% penicillin /streptomycin].
XRCC1 knockdown Bruke sirnas
Tre XRCC1 siRNA konstruerer (sekvenser som er oppført i tabell 1) og en negativ egge kontroll og siRNA for glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) (positiv kontroll) ble brukt i disse studiene. SiRNA konstruksjonene ble kjøpt fra Ambion livs teknologier, UK. Transfeksjon protokoll var som tidligere beskrevet av Fan et.al [30]. Celler ble sådd ut i 6-brønns plater (2 ml medium /brønn uten antibiotika). Ved 50% konfluens, ble transfeksjon oppnådd ved anvendelse av Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. I korthet, siRNA (100 pmol) og Lipofectamine (5 mL) ble hver for seg blandet med 250 ul opti- MEM1 (GIBCO /Invitrogen) uten FBS. Etter 5 minutters inkubasjon ved værelsestemperatur ble siRNA og lipofektamin løsninger kombineres og inkuberes i ytterligere 20 min ved romtemperatur. Denne blandingen ble deretter tilsatt til belagt celler, dyrket ved 37 ° C over natten, og mediet ble senere erstattet med friskt medium pluss penicillin /streptomycin (1%). Når cellene oppnådd 100% samløpet, de ble trypsinert og senere overført til 75 cm
2 kolber for fortsatt vekst og /eller behandling. XRCC1 knockdown ble undersøkt ved western-blotting ved forskjellige tidspunkter etter transfeksjon (dag 3, 5 og 7).
Western Blot analyse
Proteinprøver ble fremstilt ved å lysere cellene i RIPA-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% Nonidet p-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 1 mMEDTA, 0,1% SDS) som inneholdt protease-inhibitor (Sigma) og fosfatase-inhibitor cocktail 2 og 3 (Sigma), og deretter bragt til western blot analyser som tidligere beskrevet [29]. Primær antistoff var en mus anti -XRCC1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og kanin anti-ATR (Novus Biologicals, USA). HRP konjugerte sekundære antistoff var en kanin henholdsvis anti-mus og geit anti-kanin (Dako, Glostrup, Danmark).
klonogene Survival analysen
To hundre celler per brønn ble sådd i seks-brønns plater. Celler ble tillatt å holde seg i 4 timer. NU6027 eller VE-821 ble tilsatt i de angitte konsentrasjoner, og platene ble igjen i inkubator i 10 dager for CHO-celler. For siRNA transfekterte OVCAR-3 og OVCAR-4-celler, tre dager etter transfeksjon, NU6027 eller VE-821 ble tilsatt ved indikerte konsentrasjoner, og platene ble igjen i inkubator i 14 dager. For cisplatin og ATR-inhibitor kombinasjonsstudier ble celler innledningsvis behandlet med cisplatin i 16 timer og deretter forsiktig vasket to ganger med 1 x fosfatbufret saltvann og inkubert i friskt medium med eller uten NU6027 (4 pM for CHO-celler og 6 pM for OVCAR-3-celler ) i 10 dager (CH celler) eller 14 dager (humane cancerceller). Etter inkubasjonen ble mediet fjernet, faste (med metanol og eddiksyre-blanding) farget med krystallfiolett og tellet. Gjenlevende Brøk = [Nei. kolonier dannet /(Nei. celler seeded x plating effektivitet)]. Alle klonogene analysene ble utført i tre eksemplarer.
Alkaline COMET analysen
Denne analysen ble utført som beskrevet tidligere [31]. Kort sagt ble sub-konfluente celler eksponert for NU6027 (4 uM). Etter 24 timer ble cellene ekstrahert og alkaliske komet analyser ble utført. Alkali elektroforese buffer besto av 200 mM NaOH, 1 mM EDTA og pH 13. Platene ble deretter farget med SYBR® grønn (1:10,000 fortynning) (Molecular Probes) i 10 minutter og bilder ble visualisert under en rhodamin filter med et Olympus BX40 mikroskop. Kometene ble analysert ved hjelp av Comet Assay III bildeanalyse programvare (Observant Instruments, Suffolk, UK). Totalt 200 komet bildene ble evaluert for oliven hale øyeblikk.
γH2AX Immunocytochemistry
Celler ble behandlet i 48 timer med NU6027 (4 mikrometer for CHO-celler og 6 mikrometer for ovčar-3 celler) og analysen ble utført som beskrevet tidligere [31]. For cisplatin og NU6027 kombinasjonsstudier, først cellene ble behandlet i 16 timer med cisplatin (1,5 pM for CHO-celler og 1 pM for OVCAR-3 eller OVCAR-4-celler) og deretter forsiktig vasket to ganger med 1 x fosfatbufret saltvann og inkubert i frisk media med eller uten NU6027 (4 pM for CHO-celler og 6 pM for OVCAR-3 OVCAR-eller 4-celler) og analysen ble utført som ovenfor. Frekvensen av celler som inneholder γH2AX foci ble bestemt i 100 celler per lysbilde i tre separate forsøk. Kjerner som inneholder mer enn seks γH2AX foci ble betraktet som positive.
flowcytometrisk Analyser (FACS) for cellecyklusprogresjonen
Celler ble behandlet i 24 timer med NU6027 (4 mikrometer for CHO-celler og 6 mikrometer for OVCAR-3 OVCAR-4 eller celler). Celler ble senere samlet opp ved trypsinering og sentrifugering (1000 rpm i 5 minutter) og FACS-analyser ble utført som tidligere beskrevet [31].
Apoptose Påvisning av FITC-annexin V flowcytometrisk analyse
cellene ble behandlet i 48 timer med NU6027 (4 pM for CHO-celler og 6 pM for OVCAR-3 OVCAR-4 eller celler). Celler ble senere samlet opp ved trypsinering og sentrifugering (1000 rpm i 5 minutter) og ble vasket to ganger med kald PBS og deretter resuspendert celler i 1 x bindingsbuffer ved en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /ml. Deretter ble 100 ul av den oppløsning (1 x 10
5-celler) ble overført til en 5 ml dyrkningsrør og 5 ul av FITC Annexin V og 5 ul PI ble tilsatt. Cellene ble deretter forsiktig vortex og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur (25 ° C) i mørket. Etter inkubering ble 400 ul bindingsbuffer tilsatt til hvert rør og analysert ved flowcytometri innen 1 time. For cisplatin og NU6027 kombinasjonsstudier ble cellene innledningsvis behandlet i 16 timer med cisplatin (1,5 pM for CHO-celler og 1 pM for OVCAR-3 eller OVCAR-4-celler) og deretter forsiktig vasket to ganger med 1 x fosfatbufret saltvann og inkubert i frisk media med eller uten NU6027 (4 pM for CHO-celler og 6 pM for OVCAR-3 OVCAR-eller 4-celler) og analysen ble utført som tidligere beskrevet. Data ble analysert ved hjelp av FlowJo7.6.1 programvare.
Evaluering av legemiddelinteraksjon (kombinasjon Index)
For å undersøke synergistisk og additiv aktivitet, kombinert indeksen ble beregnet som beskrevet tidligere [30]. Dose-responskurver for cisplatin eller NU6027 alene ble først generert. Effekten av den kombinerte behandling ble deretter analysert med hensyn til kombinasjonen av legemiddel A (cisplatin) og B (NU6027), ved å anvende den følgende ligning: Ac /Ae + Bc /Be = D, hvor Ac og Bc tilsvarer de konsentrasjoner av narkotika brukes i kombinasjonsbehandling, og Ae og Vær tilsvarer konsentrasjonene av narkotika i stand til, av seg selv, produserer det samme omfanget av effekt. Dersom D (kombinert indeks) er mindre enn 1 virkningen av kombinasjonen er synergistisk, mens dersom D = 1 eller D er en effekt er additiv eller antagonistisk henholdsvis [32]
Resultater
.
syntetisk dødelighet
for å evaluere syntetisk dødelighet pre-klinisk, et panel av XRCC1 mangelfull og XRCC1 dyktig kinesiske hamstere og menneske eggstokkreft cellelinjer ble behandlet med små molekyl hemmere av ATR (NU6027 og VE-821 ).
kinesiske hamstere (CHO) celler.
CHO9 (Wild type), ble EM-C11 (XRCC1 mangelfull) og EM-C12 (XRCC1 mangel) undersøkt i klonogene overlevelsesanalyser. Vi vurderte opprinnelig XRCC1 og ATR uttrykk status i CHO9, EM-C11 og EM-C12 celler. Western blot-analyse i Figur 1A viser at EM-C11 og EM-C12 ikke har noen målbar XRCC1 proteinekspresjon i forhold til CHO9. EM-C11, EM-C12 og CHO9 er dyktig i ATR uttrykk. Figur 1B viser at EM-C11 og EM-C12-celler er sensitive overfor NU6027 behandling sammenlignet med CHO9 celler. På samme måte, EM-C11 og EM-C12-celler er også følsomme for VE-821 sammenlignet med CHO9 celler (figur 1C). For å undersøke om følsomheten XRCC1 manglende celler til ATR-hemmere kan rettes opp ved uttrykk for villtype XRCC1 protein i XRCC1 mangel CHO-celler, utførte vi klonogene analyser i EM9-V (XRCC1 mutant) og EM9-XH (celler stabilt transfektert med et menneske XRCC1 uttrykk vektor). Figur 1D viser at EM9-V-celler er sensitive overfor NU6027 i forhold til EM9-XH.
klonogene overlevelsesanalyser for CH-celler behandlet med NU6027 (B) og VE-821 (C) ved indikerte konsentrasjoner (se metoder for detaljer). D. klonogene overlevelsesanalyser for EM9-V og EM9-XH celler behandlet med NU6027. E. Alkaline COMET analysen i CH celler behandlet med NU6027. EM-C11 og EM-C12 viste en høyere gjennomsnittlig hale øyeblikk i forhold til CHO9 celler. F. EM-C11 og EM-C12 celler akkumulere betydelig høyere γH2AX foci i forhold til CHO9 celler ved NU6027 behandling. Data representerer gjennomsnittsverdier ± SEM (n = 6). Resultatene ble analysert ved hjelp av Students t-test. * P. 0,05
Vi så gjennomført funksjonsanalyse i cellene. ATR inhibering fører til DNA-enkelttråd pause (SSB) akkumulering. Derfor Alkaline COMET-analysen ble utført. Figur 1E oppsummerer resultatene for CHO9, EM-C11 og EM-C12 celler behandlet med 4 uM NU6027. Sammenlignet med før behandling prøver, etter 24 timers eksponering for ATR-hemmer, EM-C11 og EM-C12 celler demonstrere en signifikant høyere gjennomsnittlig hale øyeblikk i forhold til CHO9 (p 0,01). Dataene bekrefter SSB akkumulering etter ATR hemming i XRCC1 manglende celler.
DNA-dobbelttrådbrudd (DSB sin) indusere fosforylering av H2AX på serin 139 (γH2AX). Opphopning av γH2AX foci i kjernen er en markør for DSB sin. Derfor γH2AX immunocytochemistry ble utført i EM-C11, EM-C12 og CHO9 celler behandlet med 4 μΜ av NU6027. Kjerner som inneholder mer enn seks γH2AX foci ble betraktet som positive. γH2AX immunocytochemistry bekreftet at XRCC1 mangelfull EM-C11 og EM-C12 celler akkumulert mer γH2AX foci på 48 timer (p = 0,02 og p = 0,05) sammenlignet med CHO9 celler (figur 1D).
Opphopning av DSB sin kan forsinke cellesyklusprogresjon. FACS-analyser ble derfor utført på EM-C11, EM-C12 og CHO9 celler behandlet med NU6027 (4 uM). Cellesyklusprogresjon ble evaluert og sammenlignet med kontrollprøver. Etter 24 timer, EM-C11 og EM-C12 ble vist til å bli arrestert i G2 /M-fasen av cellesyklusen (p = 0,01 og p = 0,03) sammenlignet med CHO9 celler (figur 2A og 2B).
B. Kvantifisering av ulike faser av cellesyklusen er vist for CH celle behandlet med NU6027. Data representerer gjennomsnittsverdier ± SEM (n = 6). Resultatene ble analysert ved hjelp av Students t-test. * P 0,05. C. FITC-Annexin V apoptose-analysen er vist her. Andelen av celler i tidlig fase apoptose er høyere i XRCC1 manglende celler behandlet med NU6027 sammenlignet med villtype celler.
Opphopning av DSB sin, hvis ikke er reparert, induserer apoptose i celler. Derfor FITC-annexin V flowcytometrisk analyse ble utført for å kvantifisere apoptose i celler behandlet med 4 uM NU6027 og apoptotiske celler kvantifiseres ved 48 timer. I EM-C11-celler andelen av cellen i begynnelsen av apoptose økt til 7,5% etter 48 timers behandling med NU6027 sammenlignet med 1,73% i ubehandlede celler. Tilsvarende i EM-C12 celler, prosentandel av tidlig apoptotiske celler økte fra 2,62% til 9,88%. På den annen side i CHO9 celler, var det ingen endring i prosentandelen av tidlige apoptotiske celler (3,22% i ubehandlet og 3,38% etter 48 timer NU6027 behandling (figur 2C).
Dataene presentert i kinesisk hamster- celler antyder at XRCC1 manglende celler er følsomme for ATR-hemmere. ATR hemming fører til økt DSB akkumulering, G2 /M cellesyklus og apoptose. dette tyder på en syntetisk dødelighet forholdet mellom XRCC1 og ATR. for å bekrefte denne informasjonen videre vi undersøkt i menneskelig eggstokkreft kreft cellelinjer.
menneske~~POS=TRUNC eggstokkreft celler.
Vi ga XRCC1 knockdown menneske eggstokkreft cellelinjer ved hjelp av tre siRNA konstruksjoner (tabell 1). Etter transfeksjon, cellelysater ble samplet på dag 3, 5 og 7 for XRCC1 slå ned ved western blot-analyse. 3A bekrefter at alle de tre konstruksjonene (siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3) indusere effektiv knockdown (mer enn 80%) av XRCC1 i OVCAR-3-celler på dag 3 sammenlignet med egge negativ kontroll og GAPDH positiv kontroll. I klonogene overlevelsesanalyser, NU6027 behandling redusert overlevelse i XRCC1 manglende celler i forhold til dyktige celler (Figur 3B). Lignende resultater ble også sett i OVCAR-4-celler (figur S1 A). γH2AX immunocytokjemi bekreftet at XRCC1 manglende celler samlet mer γH2AX foci ved 48 timer (p = 0,05, p = 0,01 og p = 0,007) sammenlignet med egge kontroll (figur 3C). Dessuten, ved 24 timer, ble XRCC1 manglende celler vist å bli arrestert i G2 /M-fasen av cellesyklusen (p = 0,05, p = 0,04 og p = 0,05) sammenlignet med CHO9 celler (Figur 3D). I XRCC1 manglende celler andelen celler i apoptose økte betydelig sammenliknet egge kontroller ved NU6027 behandling (Figur 3E).
B. Klonogene overlevelse analyser for siRNA transfekterte ovčar-3 celler behandlet med NU6027 på angitte konsentrasjoner vises her (se metoder for detaljer). C. XRCC1 manglende celler akkumulere betydelig høyere γH2AX foci i forhold til eggekontrollceller ved NU6027 behandling. Data representerer gjennomsnittsverdier ± SEM (n = 6). Resultatene ble analysert ved hjelp av Students t-test. * P 0,05, ** p 0,01. D. Kvantifisering av ulike faser av cellesyklusen er vist for siRNA transfektert OVCAR-3 celle behandlet med NU6027 er vist her. Data representerer gjennomsnittsverdier ± SEM (n = 3). Resultatene ble analysert ved hjelp av Students t-test. * P 0,05. E. FITC-Annexin V apoptose assay for siRNA transfektert OVCAR-3-celler er vist her. Andelen av celler i sen fase apoptose er høyere i XRCC1 manglende celler behandlet med NU6027 i forhold til eggekontrollceller.
Tatt sammen data fra CHO-celler og humane cellelinjer gir overbevisende bevis for at ATR-inhibitorer indusere syntetisk dødelighet i XRCC1 manglende celler.
cisplatin Chemopotentiation
Vi har tidligere vist at XRCC1 manglende celler er følsomme for cisplatin [17]. I denne studien, må vi først bekreftet denne observasjonen i XRCC1 mangelfull EM-C11 og EM-C12 celler i forhold til CHO9 villtype celler (figur 4A). Vi vurderte deretter kombinasjonsstrategier. Den cytotoksisitet av cisplatin ble forsterket av NU6027 i XRCC1 mangel CH celler sammenlignet med XRCC1 dyktige celler. For å evaluere interaksjonen mellom NU6027 og cisplatin, ble kombinert indeks beregnet som tidligere beskrevet [32]. Celler ble dyrket i nærvær av økende doser av cisplatin (variasjons 0,5-3 uM) i kombinasjon med en konsentrasjon av NU6027 stand til å indusere et veksthem 50%. NU6027 forsterket den cytotoksiske effekt av cisplatin på XRCC1 manglende celler (tabell 2). Dersom kombinasjonsindeks (D) er mindre enn 1 virkningen av kombinasjonen er synergistisk, mens dersom D = 1 eller D er en effekt er additiv eller antagonistisk henholdsvis [32]. I denne studien, kombinasjonen indeksen var en i EM-C11 og EM-C12 celler. Vi konkluderte med at forbedring av cisplatin cytotoksisitet av NU6027 i CHO-celler var additiv snarere enn synergistisk. Vi fortsatte deretter å foreta funksjonelle analyser i cellene. Cisplatin alene behandlingen økte DSB akkumulering i XRCC1 manglende celler som ble ytterligere øket ved NU6027 (p = 0,01 og p = 0,02) (figur 4B). DSB akkumulering sees i XRCC1 manglende celler ble også assosiert med akkumulering av apoptotiske celler som vist i figur 4C.
X-aksen betegner økende konsentrasjon av cisplatin bare. NU6027 ble fastsatt til 4 mikrometer. B. XRCC1 mangel CH-celler akkumulerer vesentlig høyere γH2AX foci i forhold til XRCC1 dyktige CH-celler ved behandling med cisplatin alene eller en kombinasjon av cisplatin og NU6027. Data representerer gjennomsnittsverdier ± SEM (n = 6). Resultatene ble analysert ved hjelp av Students t-test. * P 0,05, ** p 0,01. C. FITC-Annexin V apoptose-analysen er vist her. Andelen av celler i tidlig fase, samt sen fase apoptose er høyere i XRCC1 manglende celler behandlet med cisplatin alene eller en kombinasjon av cisplatin og NU6027 sammenlignet med villtypeceller.
Vi deretter gjennomført tilsvarende undersøkelser i siRNA transfekterte humane OVCAR-3 eller OVCAR-4 celler. I likhet med resultatene sett i CH-celler, som mangler XRCC1 OVCAR-3 OVCAR-4 eller celler som var følsomme for cisplatin. NU6027 forbedret cytotoksisitet av cisplatin i XRCC1 mangel ovčar-3 celler i forhold til XRCC1 dyktige celler (figur 5A). Lignende resultater ble også sett i OVCAR-4-celler (figur S1 B). Kombinasjonen indeks studier (tabell 2) viste at i de fleste celler som var en, med unntak av OVCAR-3-celler behandlet med Si RNA_3 (D = 0,93) og OVCAR-4-celler SiRNA_1 (D = 0,99). Til sammen har vi konkludert med at menneske eggstokkreft celler den forsterkende virkningen er sannsynlig å være additiv. Cisplatin alene behandlingen økte DSB akkumulering i celler som ble ytterligere økning av NU6027 (p = 0,02, p = 0,007 og p = 004) (figur 5B). DSB akkumulering sees i XRCC1 manglende celler var assosiert med akkumulering av betydelige apoptotiske celler som vist i figur 5C.
B. XRCC1 manglende celler å akkumulere betydelig større γH2AX foci i forhold til XRCC1 dyktige celler ved behandling cisplatin alene eller en kombinasjon av cisplatin og NU6027. Data representerer gjennomsnittsverdier ± SEM (n = 6). Resultatene ble analysert ved hjelp av Students t-test. * P 0,05, ** p 0,01. C. FITC-Annexin V apoptose-analysen er vist her. Andelen av celler i sen fase apoptose er høyere i XRCC1 manglende celler behandlet med cisplatin alene eller en kombinasjon av cisplatin og NU6027 sammenlignet med villtypeceller.
Data presentert her ikke bare gir ytterligere bevis på at XRCC1 manglende celler er følsomme for cisplatin kjemoterapi, men antyder også at ATR hemming additivt øker cisplatin toksisitet i XRCC1 manglende celler i forhold til XRCC1 dyktige celler.
Konklusjoner
ATR protein kinase er en viktig sensor av enkelt -stranded DNA assosiert med fastlåste replikering gafler og reparasjon mellom genereres under BER og DSB reparasjon. ATR aktivering regulerer flere cellulære prosesser, inkludert cellesyklusregulering, DNA replikasjon, DNA-reparasjon og apoptose. XRCC1 er avgjørende for BER og SSBR og bidrar til ligation trinn i NER respons. Vi hypotese at ATR hemming kan være syntetisk dødelig i XRCC1 manglende celler.
I denne studien har vi bekreftet at ATR-hemmere er syntetisk dødelig i XRCC1 manglende celler. Vi har konkludert med syntetisk dødelighet av følgende grunner. Først, CHO-celler, så vel humane kreftceller som mangler XRCC1 var svært følsom for ATR-inhibitorer. For det andre, funksjonelle analyser viste at ATR hemming i XRCC1 manglende celler førte til en opphopning av DNA DSB sin, G2 /M cellesyklus arrest og økt apoptose. Disse dataene er i overensstemmelse med en studie av Peasland et al [22] som viste at NU6027 er syntetisk dødelig i celle behandlet med en PARP-inhibitor som blokkerer BER. Videre forfatterne har også vist at EM9 kinesiske hamster-celler som mangler XRCC1 er også følsomme for NU6027 [22]. Dataene, inkludert vår, gir derfor overbevisende bevis for at ATR hemming er syntetisk dødelig i BER manglende celler. Vi presenterer en arbeidsmodell for ATR hemming som en syntetisk dødelighet strategi i XRCC1 manglende celler. I korte trekk, fører ATR hemming til SSB opphopning. Celler som mangler XRCC1 kan ikke behandle SSBs som til slutt omdannes til giftige DSB sin på replikering gafler. Overveldende DSB kan ikke bare mette DSB reparasjon, men ATR-inhibering er også kjent å modulere DSB reparasjon direkte [33], [34] som bidrar til syntetisk dødelighet observert i celler.
Vi fant også at XRCC1 manglende celler er følsomme til cisplatin. Den cisplatin følsomhet i XRCC1 manglende celler observert i vår studie er i samsvar med en fersk studie i HepG2 cellene der cisplatin følsomhet ble demonstrert følgende XRCC1 uttømming [35]. Vi observerte ikke noen forsterkning av cisplatin cytotoksisitet av ATR-hemmer i XRCC1 villtype celler. Dette er i motsetning til tidligere prekliniske studier hvor ATR inaktivering (genetisk eller med inhibitorer) har vist økt følsomhet platina i et panel av cellelinjer [22]. Men en begrensning av vår studie er at undersøkelsen ble begrenset til noen få celle eneste typer. Ikke desto mindre tyder våre data på at genetisk bakgrunn (for eksempel XRCC1 status) kan påvirke platina følsomhet. Avslutningsvis har vi vist et syntetisk dødelighet søknad om ATR-hemmere i XRCC1 manglende celler. ATR hemming kan også påvirke platina følsomhet i XRCC1 manglende celler.
