Abstract
Som prostata kreft utvikler seg til kastrering-resistent sykdom, det er en økning i signaltransduksjon aktivitet. De fleste kastrerings motstandsdyktig prostatakreft fortsetter å uttrykke androgenreseptoren (AR) samt androgen-responsive gener, til tross for den nesten fravær av sirkulerende androgen i disse pasientene. AR reguleres ikke bare av sin beslektet steroid hormon, men også av interaksjoner med en konstellasjon av co-regulatoriske og signalmolekyler. Således kan den forhøyede signaleringsaktivitet som oppstår under progresjonen til kastrering motstand påvirke prostatacancer cellevekst enten gjennom AR eller uavhengig av AR. For å identifisere signalveier som regulerer prostate cancer cellevekst, vist vi et panel av shRNAs rettet mot 673 humane kinaser mot LNCaP prostatakreftceller dyrket i nærvær og fravær av hormon. Skjermen identifisert flere shRNA kloner mot kjente og nye genet mål som regulerer prostatakreft cellevekst. Basert på omfanget av effekt på vekst, valgte vi seks kinaser for videre studier: MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, og PSKH1. Knockdown av disse kinaser redusert cellevekst i både androgen-avhengige og kastreringsresistent prostatakreft celler. Men disse kinaser hadde ulike effekter på basal eller androgen-indusert transkripsjonen aktivitet av AR målgener. MAP3K11 knockdown mest konsekvent endret transkripsjon av AR målgener, noe som tyder på at MAP3K11 påvirket veksten hemmende effekt ved å modulere AR transkripsjonen programmet. I samsvar med MAP3K11 handler på AR, knockdown av MAP3K11 hemmet AR Ser 650 fosforylering, ytterligere støtte stresset kinase regulering av AR fosforylering. Denne studien viser anvendelsen av lentiviral baserte shRNA for å gjennomføre fenotypiske skjermer og identifiserer MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, og PSKH1 som regulatorer av prostatakreft cellevekst. Den grundige evalueringen av disse kinase målene vil bane vei for å utvikle mer effektive behandlinger for kastrering resistent prostatakreft
Citation. Whitworth H, Bhadel S, Ivey M, Conaway M, Spencer A, Hernan R, et al. (2012) Identifisering av kinaser Regulerings Prostate Cancer Cell Vekst Bruke en RNAi Fenotypisk Screen. PLoS ONE 7 (6): e38950. doi: 10,1371 /journal.pone.0038950
Redaktør: Jindan Yu, Northwestern University, USA
mottatt: 11 januar 2012; Godkjent: 15 mai 2012; Publisert: 27 juni 2012
Copyright: © 2012 Whitworth et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health Grant R01 CA124706 til DG og Paul Mellon Urologiske Cancer Institute ved University of Virginia. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Andrea Spencer, Ronald Hernan, og Heather Holemon ble ansatt i Sigma-Aldrich Bioteknologi under RNAi skjermen. Sigma-Aldrich selger MISSION bibliotek som ble brukt i denne studien. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
androgen reseptor (AR) er en kritisk regulator av prostatakreft progresjon og det er stadig klarere at AR reguleres ikke bare ved sin beslektet steroid hormon, men også ved interaksjoner med en konstellasjon av co-regulatoriske og signalmolekyler [1] – [3]. For pasienter med disseminert prostatakreft, er vanligvis avhengig av androgen for vekst og derfor i utgangspunktet lydhør overfor kirurgisk og /eller farmakologisk uttømming av sirkulerende tumor androgener [4]. Imidlertid er terapeutisk suksess midlertidig. Kreften nesten alltid gjentar seg og utvikler seg til en metastatisk og dødelig sykdom. Den omfattende krysstale mellom signalveier som androgen og peptid signalveier, flere genetiske mutasjoner og genetisk plastisitet av kreft, bidrar til den iboende og ervervet resistens mot androgen ablasjon [5].
Tidligere studier har vist at polypeptid-vekstfaktor signaltransduksjonsveier kan stimulere AR aktivering, noe som tyder på at økningen i vekstfaktor og reseptorekspresjon kan være kausal i prostata cancer progresjon til kastrering motstand. Vekstfaktor stimulering har vært rapportert å gjengi AR-responsive promotorer følsomme til androgen [6] – [14], og tvunget i forhold til ekspresjon av HER2 /neu i androgen-avhengig prostata kreftceller er blitt vist å drive kastrering-resistente vekst [15] [16]. Videre kan inhibering av EGFR /HER2 signale inhiberer prostatacancer-cellevekst
in vitro
og
in vivo product: [17], [18] samt AR transkripsjonen aktivitet, proteinstabilitet, DNA-bindende og Ser 81 fosforylering [19]. Evnen til signalkaskader å påvirke AR-funksjonen kan spille en betydelig rolle i utvikling og progresjon av prostatakreft hvor økningen i signaltransduksjon aktivitet har vært forbundet med oppkjøpet av kastrering-resistent sykdom. Dette tyder på at terapeutiske strategier rettet mot kinasekaskader kan overvinne de kompenserende signalmekanismer som begrenser effekten av androgen ablasjon.
For å identifisere signalveier som regulerer prostatakreft cellevekst, vi skjermet et panel av shRNAs som er rettet mot den humane kinome mot LnCap prostata kreft celler dyrket i nærvær og fravær av androgen. Vi søkte etter kinaser som hadde generelle vekst effekter og kinaser som kompenserte for androgen ablasjon. Skjermen identifisert flere kloner shRNA mot gen mål som regulerer androgen både følsomhet og cellevekst. Vi rapporterer her resultatene av vår skjerm og detaljert evaluering av en undergruppe av kinaser identifisert som regulatorer av prostatakreft cellevekst.
Resultater
Før screening et panel av shRNAs som er rettet mot den menneskelige kinome mot LNCaP prostatakreftceller, utførte vi forsiktig optimalisering av parametrene, inkludert cellevekstvilkår, multiplisitet av infeksjon, puromycin utvalg, androgen behandling, og cellenes levedyktighet målinger (data ikke vist). Vi identifiserte shRNA kloner som ble redusert og økt LNCaP cellevekst både i nærvær og fravær av androgen (figur 1). Skjermen brukes MISSION® bibliotek med tre til fem shRNAs for hver av 673 kinase mål; tre uavhengige biologiske replikater ble utført på forskjellige dager. Etter knockdown, ble endringer i LNCaP cellemetabolisme bestemmes ved anvendelse av AlamarBlue som et surrogat for celleproliferasjon. Flere shRNA kloner mot genet målene som påvirker cellevekst ble identifisert.
LNCaP celler ble transduced i tre eksemplarer med tre til fem shRNAs målrettet mot 673 mennesker kinaser. Celleveksten ble målt ved alamarBlue på dag 7. plottet er celleveksten i forhold til pLKO tom vektorkontroll, som reaksjon på hver shRNA i nærvær og fravær av hormon (0,05 nM R1881). De røde og grønne linjer avgrense avskåret poeng basert på kontroller inkludert pLKO, NTC, media alene, og AR shRNA. Den røde linjen viser veksthemming og den grønne linjen vekst.
Det var ingen forskjell i vekst når man sammenligner pLKO tom vektor til en ikke-target-kontroll (NTC) (n = 82, data ikke vist) . Androgen-behandlede celler vokste til 3,2 ganger større enn bærer-behandlede celler (n = 82). AR knockdown ved hjelp shRNA ble anvendt som en positiv kontroll på skjermen, inhibere vekst av mer enn 60% i celler dyrket i nærvær av androgen (n = 41, data ikke vist), men som har minimal effekt på LNCaP-celler dyrket i fravær av androgen (n = 41, data ikke vist). I nærvær av androgen, scoret vi shRNAs som hemmet vekst med minst 75%, noe som representerer mindre enn toppen 1% av shRNAs hemme vekst, som shRNAs målretting kinaser som positivt regulerer LNCaP cellevekst. I fravær av androgen, mottok vi shRNAs som hemmet veksten med 50% eller mer, noe som representerer mindre enn toppen 2% av shRNAs hemme vekst, som shRNAs målretting kinaser som positivt regulerer LNCaP-cellevekst. Ved hjelp av disse kriteriene, shRNA knockdown av 46 kinaser hemmet cellevekst. Interessant nok viste svært få shRNAs en virkning som var avhengig av tilstedeværelse eller fravær av androgen. De fleste shRNAs hemmet vekst under begge betingelser, selv om omfanget av inhibering varieres, noe som indikerer at denne skjermen ikke avsløre kinaser som spesifikt regulerer androgen-indusert LNCaP cellevekst. Ribosomalt protein S6-kinase (RPS6KA3), som har vært implisert i regulering av AR-aktivitet og prostatacancer cellevekst [20] – [24], ble identifisert i denne skjerm, som støtter en RNAi screening tilnærming for å identifisere kinaser som regulerer prostatacancer-cellevekst. Vi har også observert 34 kinaser som representerer toppen 1%, som knockdown økt LNCaP cellevekst (figur 1)
Vi valgte seks hemmende kinaser for videre studier basert på omfanget av effekten av shRNA knockdown:. Mitogen-aktivert protein kinase kinase kinase 11 (MAP3K11), diacylglycerol kinase delta (DGKD), intestinal celle kinase (ICK), citron rho samspill kinase (CIT), galactokinase2 (GALK2), og protein serin kinase H1 (PSKH1). En forutsigelse postulerer at dersom kinaser som reduserer veksten når slått ned er kausal i prostata cancer progresjon, da aktiviteten til disse kinaser bør øke i løpet av progresjon av kreft. Som et mellomtrinn for å undersøke aktivering tilstand av kinaser, vi undersøkte kinase beskjed nivåer i Oncomine database. Vi har funnet at i det minste to uavhengige studier av mRNA-nivåer for de seks kinaser økes enten ved at primær prostatakreft blir sammenlignet med normal prostata eller når metastatisk prostata kreft er i forhold til primær sykdom eller normal prostata (figur S1).
Vi validert veksteffekt og knockdown av de seks utvalgte kinaser ved hjelp av CyQuant-analysen, som måler DNA-innhold som et surrogat for celle nummer, og brukte denne teknikken til også å forlenge analysen til kastrering-resistent cellelinje, C4-2B. Cellene ble transduced med lentiviral partikler uttrykker to shRNAs spesifikk for hver kinase av interesse eller pLKO tom vektor kontroll i nærvær (0,05 nM R1881) eller fravær av androgen. Som observert i figur 2, ble veksten redusert i begge cellelinjene som reaksjon på hver shRNA. Generelt kinase knockdown hemmet vekst i nærvær og fravær av androgen. Videre kinase knockdown påvirket vekst ekvivalent både i androgen-avhengige LNCaP og kastrering bestandig C4-2B cellelinje.
Den relative virkning av to uavhengige shRNAs pr kinase på cellevekst i LNCaP (A) og C4- 2B (B-celler). CyQuant analysen måles DNA innhold som et surrogat for celle nummer 7 dager etter shRNA transduksjon. Forsøket ble utført i nærvær og fravær av hormon (0,05 nM R1881), n = 3 til 7 avhengig kinase. Celleveksten ble sammenlignet med ubehandlede kontroll pLKO, og verdiene ble beregnet på tvers av biologiske replikater. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. * Angir statistisk signifikans.
qPCR ble benyttet for å bestemme kinase knockdown av shRNA i LNCaP og C4-2B celler (figur 3). Hormon ble tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner (kjøretøy, 0,05, 0,5, og 1 nM R1881) og RNA ble isolert ved 2 og 24 timer etter hormon behandling. Disse hormonbehandlinger var de samme som de som ble brukt for å vurdere effekten av kinase knockdown på AR transkripsjonen aktivitet, som er beskrevet nedenfor og vist i tabell 1. Hver kinase ble slått ned i begge cellelinjer med to forskjellige shRNAs og sammenlignet med pLKO tom vektor kontroll. Vi observerte ikke en effekt av hormondose på effektiviteten av kinase knockdown (figur S2); således, at data som er vist i figur 3 er de qPCR verdier fordelt på tvers av biologiske replikater og hormonkonsentrasjoner for hver shRNA eller pLKO kontrollen ved 24 timer etter hormonstimulering. De shRNA virus fremkaller mer enn 50% knockdown av mål-mRNA-kinase i forhold til pLKO, med de fleste knock-out større enn 70% ved begge tidspunkter og i begge cellelinjer. I hovedsak identiske observasjoner ble gjort for kinase knockdown etter 2 timer etter hormonstimulering (data ikke vist).
Kinase-transkripsjonsnivåer i LNCaP (A) og C4-2B (B) celler etter knockdown med to uavhengige shRNAs pr kinase . Transkripsjonsnivåer ble målt ved qPCR på dag 4 etter transduksjon og 2 timer etter behandling R1881 hormon (kjøretøy, 0,05, 0,5, og 1 nM). Transkripsjonsnivåer ble sammenlignet med ubehandlede kontroll pLKO og normalisert til husholdningsgenet, PSMB6. Verdier ble i gjennomsnitt over hormonkonsentrasjoner og biologiske replikat. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet. * Angir statistisk signifikans.
Det var noen differensial knockdown av kinase mRNA ved shRNA, noe som kan forklare differensialknockdown av vekst. For eksempel, i LNCaP-celler, CIT shRNA-2 fremkalte en større veksthemming enn CIT shRNA-1, som er en parallell til effekten på kinase mRNA knockdown, hvor CIT shRNA-2 redusert CIT mRNA-nivåer mer enn CIT shRNA-1. Imidlertid parallellene mellom veksthemming og mRNA knockdown ikke er tydelig for alle kinaser målrettede.
For å bestemme om inhiberingen av veksten indusert av kinase knockdown var spesifikk for prostata kreftceller, målte vi veksten av LHS og MCF10A celler i respons til shRNA rettet mot de syv kinaser (figur 4). LHS-celler er ikke-tumorigene udødeliggjorte humane prostata epitelceller som genereres av ektopisk ekspresjon av SV40 stort, lite T antigen og human telomerase [25]. MCF10A er en ikke-tumorigen, spontant udødelig bryst epiteliale cellelinje [26]. LNCaP-celler tjente som en kontroll, med parallelle eksperimenter demonstrerer inhibering av LNCaP cellevekst og ekspresjon kinase (data ikke vist). Generelt, shRNA rettet mot kinaser hadde minimal effekt på LHS og MCF10A cellevekst, noe som tyder på selektivitet mot prostatakreftceller (figur 4). Knockdown av kinase melding i LHS og MCF10A celler var variabel (data ikke vist). I LHS celler, ble MAP3K11 effektivt slått ned (75 til 90% hemming) og PSKH1 (50% hemming); men knockdown var ineffektiv for de andre kinaser. I MCF10A celler, ble CIT hemmet (80%) og PSKH1, DGKD, og GALK2 ble hver inhibert med omtrent 50%. Den manglende evne til å inhibere kinase uttrykk i en lignende grad som i LNCaP, C4-2B, (figur 3) og CWR22Rv1 celler (data ikke vist), kompliserer tolke betydningen av disse kinaser i normal cellevekst og overlevelse. Imidlertid ble alle seks kinaser slått ned i det minste i en av de normale cellelinjer som ble testet. Således er disse resultatene er i overensstemmelse med det foreligger selektivitet for målretting av disse kinaser i kreftceller enn normale celler.
Den relative virkning av to uavhengige shRNAs pr kinase på cellevekst i LHS (A) og (B) MCF10A celler . CyQuant analysen måles DNA innhold som et surrogat for celle nummer 7 dager etter shRNA transduksjon. n = 2 for LHS celler og n = 3 for MCF10A celler. Celleveksten ble sammenlignet med pLKO kontroll, og verdiene ble beregnet på tvers av biologiske replikater. Feilstolpene representerer standardfeil av gjennomsnittet.
Siden AR er en viktig regulator av prostatacancer cellevekst, vi ønsket å finne ut om noen av de seks utvalgte kinaser kan påvirke vekst gjennom regulering av AR transcriptome . For å undersøke effekten av kinase knockdown på AR mål gentranskripsjon, ble qPCR anvendt for å måle transkripsjonsnivåer av to AR målgener, TMPRSS2 og SGK, i LNCaP-celler og C4-2B med to uavhengige shRNAs som brukes til å inhibere kinase ekspresjon (Tabell 1) . Vi undersøkte transkripsjon av disse gener ved 2 og 24 timer for å evaluere effekten av kinase knockdown på den umiddelbare-tidlig respons og steady-state nivået av AR transkripsjonen aktivitet. Statistisk analyse viser at det ikke var noen effekt av hormondose på evnen av kinase knockdown til å påvirke transkripsjon AR; kinase knockdown forandret transkripsjon ekvivalent, eller hadde ingen effekt, ved hver androgen dose. Vedlikehold av androgen induksjon i pLKO ble observert i alle analyserte eksperimenter. Gjengitt i tabell 1 er den statistisk signifikante endringer i AR transkripsjon av TMPRSS2 og SGK som reaksjon på kinase knockdown etter to uavhengige shRNAs ved 2 og 24 timer etter tre forskjellige androgen dosebehandlinger. Begge shRNAs måtte endre gentranskripsjon vesentlig i samme retning som meldte i tabellen.
Det var ingen konsistent reduksjon i AR transkripsjonen aktivitet i respons til knockdown av de seks kinaser på tvers av begge cellelinjer, AR målgener undersøkt og de to tidspunkter som ble testet (tabell 1). Knockdown av MAP3K11 redusert transkripsjon av TMPRSS2 i LNCaP-celler etter 24 timer og på C4-2B cellene ved 2 timer etter tilsetningen av androgen. Imidlertid MAP3K11 knockdown økt transkripsjon av SGK i C4-2B celler 2 timer etter at tilsetningen eller hormon. Knockdown av DGKD redusert transkripsjon av TMPRSS2 i C4-2B celler og SGK i LNCaP celler på 24 timer. Det var ingen endring i TMPRSS2 eller SGK transkripsjon i begge cellelinje som et resultat av den knockdown av ICK eller PSKH1. CIT knockdown har ulike effekter på AR transkripsjon. Interessant nok den mest konsekvente effekt på AR transkripsjon var fra GALK2 knockdown, som forårsaket en økning i SGK ved 24 timer etter hormontilsettingen i begge cellelinjer og ved 2 timer i C4-2B celler. Men undersøke bare TMPRSS2 og SGK som representant AR målgener kan skape bias i utvalget; Derfor utvidet vi vår analyse av AR-regulerte gener.
Vi analyserte 14 flere gener, inkludert AR-aktiverte gener PSA, FKBP51, ORM1, STAG, Nkx3.1, FASN, AQP3, KLK2, og UGT2B ; AR-trykt gener DKK og FST; og kastrering-resistent prostatakreft AR-regulert gener CDC20, Cdk1, og UBE2C. Transkripsjon i LNCaP celler etter MAP3K11 knockdown ble undersøkt på 24 timer etter androgen behandling. Som forventet, androgen indusert eller undertrykt transkripsjon av alle AR målgener i pLKO kontrollceller. Effekten av MAP3K11 knockdown på AR transkripsjon er målet avhengig. Androgen-stimulert transkribering av TMPRSS2, SGK, og ORM1 ble redusert som svar på MAP3K11 knockdown (figur 5A). Den inverse var sant for androgen-trykt gener DKK og FST. MAP3K11 knockdown stimulert genekspresjon og redusert mengden av androgen-indusert undertrykkelse (figur 5B). PSA, FKBP51, STAG, Nkx3.1, FASN, AQP3, KLK2, og UGT2B ikke endre seg i takt MAP3K11 knockdown. I den grad denne undergruppe av AR målgener representerer AR transkriptomet Disse data tyder på at inhibisjon av cellevekst som respons på MAP3K11 kinase knockdown kan skyldes reguleringen av AR transkripsjonen aktivitet på en undergruppe av AR-regulerte gener. AR selektivt regulerer cellesyklus-regulerte gener som CDC20, CDK1, og UBE2C å fremme cellevekst [27]. Vi fant ut at MAP3K11 knockdown førte til en liten, men statistisk signifikant reduksjon i transkripsjon av disse M-fase AR-regulerte gener (figur 5C).
(A) Transcript nivåer av androgen-indusert AR målgener som endret i respons til MAP3K11 knockdown i LNCaP-celler transdusert med to uavhengige shRNAs og pLKO kontroll. RNA ble isolert 24 timer etter tilsetning av R1881 ved 1 nM. Transkripsjonsnivåer ble målt ved qPCR, sammenlignet med pLKO og normalisert til husholdningsgenet, GUS. (B) transkripsjonsnivåer av androgen-AR undertrykte målgener og (C) transkripsjonsnivåer av AR-regulerte M-fase-genene er beskrevet i [27]. (B) og (C) ble behandlet som beskrevet for (A). Verdier ble gjennomsnitts tvers biologiske replikater, n = 3. Feilstolper representerer standardfeil av gjennomsnittet. * Angir statistisk signifikans.
Tidligere viste vi at stress kinaser kunne regulere AR Ser 650 fosforylering [28]. Følgelig, for ytterligere å utforske mekanismen for MAP3K11 regulering av prostatakreft-cellevekst og AR transkripsjon, testet vi om MAP3K11 knockdown regulert AR Ser 650 fosforylering siden MAP3K11 er et oppstrøms regulator av JNK-aktivitet. PMA indusert AR Ser 650 fosforylering i LNCaP-celler og C4-2B mer enn tre ganger (figur 6). I disse eksperimentene, ble redusert både shRNAs MAP3K11 proteinekspresjon, med MAP3K11 shRNA-en avtagende ekspresjon i større grad enn MAP3K11 shRNA-2. Lignende endringer i c-Jun fosforylering ble observert, noe som tyder på at MAP3K11 shRNAs hemmet PMA-indusert spenning kinase signalering. Under disse betingelser ble AR Ser 650 fosforylering redusert i begge LnCap og C4-2B celler. En parallell reduksjon i total AR ble observert. Kvantifisering av den relative mengde av Ser 650 fosforylering til total AR viste en reduksjon i fosfo-Ser 650 (figur 6 histogram), noe som tyder på en endring i støkiometrisk AR Ser 650 fosforylering som respons på MAPK3K11 knockdown. MAP3K11 shRNA-1 hadde størst innvirkning på AR Ser 650 fosforylering, parallelt med effekt på MAP3K11 protein uttrykk og c-Jun fosforylering. Disse observasjonene stemmer overens med våre tidligere resultater som tyder på at stress kinase signal regulerer AR Ser 650 fosforylering [28] og videre foreslå at MAP3K11 knockdown kan utløse veksthemming gjennom avbrudd av AR.
LNCaP og C4-2B celler ble transduced med to uavhengige shRNAs målretting MAP3K11 eller pLKO kontroll. Celler ble behandlet med enten bærer eller PMA. Total AR ble immunopresipitert og blottet for fosfor-S650 og total AR nivåer. Cellelysat ble blottet for total MAP3K11, total JNK, fosfor-JNK, og tubulin. Plottet er fosfor-S650 signal normalisert til total AR, n = 3. Kvantifisering ble utført på Odyssey licor imaging system. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet.
Diskusjoner
Vår studie viser anvendelsen av lentiviral baserte shRNA for å gjennomføre fenotypiske skjermer for å identifisere mål som er involvert i prostata kreft vekst. De signalbaner som regulerer prostate cancer cellevekst og AR-aktivitet spiller en sentral rolle i overgangen fra androgen-avhengig prostata kreft til kastrering-resistent sykdom [29]. For å identifisere kinaser innenfor disse nettverkene, undersøkte vi hvordan RNAi knockdown av kinaser påvirker LNCaP prostatakreft cellevekst. Vi spådde finne både nye og kjente regulatorer av vekst. Skjermen identifisert kinaser tidligere vist å regulere prostatakreft cellevekst og AR aktivitet, herunder ribosomalt S6 kinase (RPS6KA3 eller RSK) [30]. RSK er nedstrøms MAPK og forbedrer PSA transkripsjon. Kjemisk hemming av RSK redusert PSA uttrykk og prostatakreft cellevekst [30]. RSK ser ut til å mekle AR transcriptional aktivisering gjennom sin egen kinase funksjon samt interaksjoner med P300, en AR co-regulator med HAT aktivitet. Identifisere RSK i vår skjerm støtter hypomorphic genetiske skjermer for å identifisere kinaser regulerer prostatakreft cellevekst.
Flere mål ble identifisert i vår RNAi skjermen, noe som tyder på at flere kinase signalveier regulere prostatakreft cellevekst. Vi valgte seks kinaser for videre studier, inkludert MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, og PSKH1. Knockdown av alle seks kinaser ble funnet å redusere cellevekst i begge androgen-avhengige og kastreringsresistent prostatacancerceller. For å avgjøre om veksten effekten ble formidlet gjennom AR, vi først undersøkte transkripsjon av to godt karakterisert AR responsive gener, TMPRSS2 og SGK. Vi observerte ikke en konsistent effekt over tidspunkter og cellelinjer testet på AR transkripsjon av TMPRSS2 og SGK når de seks kinaser ble slått ned. Men når vi utvidet vår analyse til 16 totalt AR-regulert gener som svar på MAP3K11 knockdown, fant vi at en undergruppe av AR målgener ble endret. Dette tyder på at MAP3K11 knockdown kan modulere AR transkripsjonen aktivitet og kan formidle sine veksteffekter gjennom AR. I tillegg er disse dataene legger til bevis for at AR kan reguleres på en promoter selektiv måte, slik at den kan fungere som en integrator for flere ekstracellulære signaler. Vår lab og andre har rapportert dette i tidligere studier [31], [32]. Videre forsøk med flere AR målgener vil være nødvendig å fullt evaluere effektene av knockdown av disse seks kinaser på AR transkripsjon.
MAP3K11, også kalt Blandet Lineage kinase (MLK3), er medlem av serin /treonin kinasefamilien som fortrinnsvis aktiverer MAPK8 /JNK-kinase og fungerer som en positiv regulator av JNK-signal [33]. I tillegg kan denne kinase direkte fosforylere og aktivere IkappaB kinase og er involvert i transkripsjonen aktivitet av NF-kappaB mediert av Rho familien GTPases. MAP3K11 er nødvendig for serum-stimulert celle-proliferasjon og for mitogen og cytokin aktivering av p38, ERK, og JNK1. MAP3K11 spiller også en rolle i mitogen-stimulerte fosforylering og aktivering av BRAF, uten å fosforylere BRAF direkte. Således MAP3K11 fungerer som en node i mitogen og stress signalveier. Vi har tidligere vist at aktivering av MAP kinase veien korrelerer med prostatakreft progresjon i en rekke innstillinger og bestemt at stress kinase signal regulerer AR Ser 650 fosforylering [28], [34]. I denne studien fikk vi bekreftet at stress kinase signal regulerer AR Ser 650 fosforylering; knockdown av MAP3K11 stoichiometrically redusert PMA-indusert AR Ser 650 fosforylering. Modulering av Ser 650 fosforylering kan regulere AR transkripsjonen aktivitet av AR målgener som ble endret på MAP3K11 knockdown, inkludert TMPRSS2, SGK, ORM1, DKK og FST. Vi har også funnet at kastrering resistent prostatakreft AR regulerte M-fase gener CDC20, CDK1, og UBE2C [27], ble redusert som svar på MAP3K11 knockdown, selv om reduksjonen i transkripsjon av disse gener kan gjenspeile inhibering av vekst utløst etter MAP3K11 knockdown og representerer ikke endret AR transkripsjonen aktivitet. Vår skjermen også identifisert andre stress kinaser, inkludert MAP3K7, MAP4K3, og MAPKAPK5 (data ikke vist), noe som understreker den kritiske natur stress kinase signal i regulering av prostatakreft cellevekst.
DGKD er et enzym som fosforylerer diacylglycerol (DAG) for å fremstille fosfatidinsyre (PA). DGK katalyserer fosforyleringen av DAG ved å omdanne det til PA, og dermed utveksling av en andre budbringer til en annen og aktivering av proteinkinase C (PKC) [35]. Det er økende bevis som tyder på at DGKD er involvert i regulering DAG og PA nivåer i respons på ulike vekstfaktorer og hormoner [35]. DGKD ble rapportert å samhandle med RACK1, et protein som vi tidligere hadde vist som en AR samspill protein som regulerer AR fosforylering og transkripsjonen aktivitet [36], [37]. Dermed kan DGKD bidra til AR regulering gjennom RACK1. Men knockdown av DGKD ikke har en signifikant effekt på AR transkripsjonen aktivitet. Tidligere forskning har vist at i fravær av DGKD er EGFR signale redusert fordi både uttrykk og kinase aktivitet hemmes [38]. Denne effekten på EGFR er et resultat av en reduksjon i et deubiquitinase, USP-8, og derfor øker ubiquitinering og nedbrytning av EGFR [38]. Vekstfaktor signalering er en kjent regulator av prostatakreft cellevekst [29]. Det er derfor mulig at den veksteffekt som tilsvarer DGKD knockdown er et resultat av endrede reseptor-tyrosin-kinase-signalering.
ICK er en serin /treonin kinase inneholdende en dobbel fosforylering område funnet i mitogenaktiverende proteinkinaser hvis aktivitet reguleres av cellesyklusrelaterte kinase (CCRK) og humant protein fosfatase 5 (PP5) [39]. ICK er relatert til mannlig bakterie celle-assosiert protein kinase (MAK). MAK er en AR co-regulator som direkte binder AR i samarbeid immunoutfellingsstudier eksperimenter og forbedrer AR-avhengig transkripsjon i en kinase-avhengig måte [40]. Hemming av MAK med enten RNAi eller en kinase-dead skjema redusert LNCaP cellevekst. Effekten av MAK knockdown på vekst paralleller våre observasjoner med ICK selv om vi ikke har observert en effekt av ICK på AR transkripsjon foreslå en alternativ mekanisme for vekstregulering. ICK kan fosforylere ljå, en antiapoptotic protein og kan således regulere celleoverlevelse [39], [41].
CIT er en dobbel spesifisitet protein kinase som er et antatt RHO og RAC effektor, som kan spille en rolle i cytokinese [42]. CIT knockdown kan forstyrre cytokinese og derfor cellevekst. GALK2 er et N-acetylgalaktosamin (GalNAc) kinase, som også har galaktokinase aktivitet ved høye konsentrasjoner galaktose [43]. Regulering av karbohydratmetabolismen som er nødvendig for cellevekst og GalNAc er kritisk for O-bundet glykosylering og tilsvarende regulering av cellesignalisering [44]; GALK2 knockdown kan forstyrre disse grunnleggende cellulære prosesser. PSKH1 er en studerte kinase som kan være en skjøte faktor kupé-assosiert kinase serin med en rolle i intranuclear ikke-snRNP skjøting faktor handel og pre-mRNA prosessering [45]. Fraværet av en stor effekt på den ikke-tumorigene LHS prostataceller og MCF10A bryst celler kan skyldes forskjeller i den relative effektiviteten av knockdown og /eller behov for disse kinaser i disse grunnleggende cellulære prosesser. Det er sannsynlig at kravet til CIT, GALK2, og PSKH1 varierer avhengig av tumorgene tilstand ettersom mRNA-nivåer av disse kinaser øke som prostata kreft utvikler seg (figur S1). Videre studier er nødvendig for å bestemme mekanismen for vekstregulering for disse kinaser i prostata kreft.
I denne studien vi vist et panel av shRNAs målretting av den humane kinome mot LNCaP prostatakreftceller dyrket i nærvær og fravær av androgen å identifisere de signalveier som regulerer prostatakreft cellevekst. Det ble identifisert flere kloner shRNA mot kinaser som regulerer både androgen-avhengige og kastrering-motstandsdyktig prostatakreft cellevekst. Denne studien viser videre anvendelsen av lentiviral basert shRNA for å gjennomføre fenotypiske skjermer for å identifisere mål som er involvert i en rekke biologiske prosesser, og etablerer MAP3K11, DGKD, ICK, CIT, GALK2, og PSKH1 som regulatorer av prostatakreft cellevekst.
