Abstract
Plateepitelkarsinom i hode og hals (SCCHN) er en aggressiv sykdom med dårlig overlevelse og er den sjette vanligste kreftformen i verden. Gastroøsofageal refluks er en vanlig hendelse i SCCHN pasienter. GPR4 er en proton-sensing G-proteinkoblet reseptor, som kan aktiveres ved acidose. Målet med denne studien var å undersøke hvilken rolle GPR4 i syre eksponering og tumor angiogenese i SCCHN. I denne studien fikk vi bekreftet at overekspresjon GPR4 i SCCHN celler kan øke uttrykket og sekresjon av IL6, IL8 og VEGFA ved pH 5,9. Denne effekten kan bli inhibert av SB203580 (et p38-inhibitor). Western blot-analyse tydet på at fosforylering av p38 øket i GPR4 infiserte celler ved pH 5,9, noe som kunne bli inhibert av SB203580. I rør-analysen, ble HMEC-1-celler inkubert med kondisjonert medium (CM, pH 5,9, 6,5, 7,4) avledet fra kontroll og GPR4 infisert SCCHN celler. Rørlengde ble betydelig økt i HMEC-1 celler inkubert med CM fra GPR4 infiserte celler sammenlignet med kontrollceller på pH5.9, som indikerte den pro-angiogene effekten av GPR4 i sur pH. De nøytraliserende antistoffer av IL6, IL8 og VEGFA kunne hemme tube dannelsen av HMEC-1 celler. In vivo ble effekten av GPR4 på angiogenese undersøkt med dama chorioallantoic membran (CAM) modell. Kontroll og GPR4 infiserte SCCHN celler ble sådd ut på den øvre kamflate (n = 5 i hver gruppe) og 5 pl DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5, 7,4) ble tilsatt til overflaten av cellen hver 24 timer. Fire dager senere ble den øvre CAM høstet, og forholdet mellom den vaskulære området til CAM-området ble kvantifisert ved hjelp av Image-Pro Plus 6.0 programvare. GPR4 infiserte celler kunne rekruttere mer vaskulær enn kontrollcellene på pH5.9. I konklusjonen, foreslo vi at GPR4 induserer angiogenese via GPR4-indusert p38-mediert IL6, IL8 og VEGFA sekresjon ved sur ekstracellulære pH i SCCHN
Citation. Jing Z, Xu H, Chen X, Zhong Q, Huang J, Zhang Y, et al. (2016) Den Proton-Sensing G-proteinkoblet reseptor GPR4 Fremmer Angiogenese i hode- og halskreft. PLoS ONE 11 (4): e0152789. doi: 10,1371 /journal.pone.0152789
Redaktør: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, USA
mottatt: 29 september 2015; Godkjent: 18 mars 2016; Publisert: 14 april 2016
Copyright: © 2016 Jing et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av stipend fra Yangfan Program av Beijing Municipal Administration of Hospitals (ingen XMLX201507.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Plateepitelkarsinom i hode og hals (SCCHN) er en aggressiv sykdom med dårlig overlevelse og er den sjette vanligste kreftformen i verden [1]. Den globale forekomsten er ca 600.000 tilfeller hvert år [2]. Røyking og alkoholmisbruk er viktige risikofaktorer for SCCHN. Gastroøsofageal refluks er en vanlig hendelse i SCCHN pasienter [3], noe som indikerer at det er forbundet med en forhøyet risiko for strupekreft og svelget kreft [4]. Tjuefire timer dobbel-sonde pH-måling angir pH-verdien av den øvre esophageal sphincter som er under 4 [5]. Acid eksponering kan føre til ulike otolaryngological lidelser som kronisk laryngitt, vokal knuter, Reinke ødem, kontakt sår og granulomer, laryngeal stenose, og paroksysmal laryngospasmer [6]. I esophageal plateepitelkarsinom, fremmer kontinuerlig syreeksponering vaskulær utvikling [7], som spiller en avgjørende rolle under startfasen og ondartet progresjon [8].
proton-sensing G protein-koblede reseptorer (GPCR) inkludert GPR4, GPR65 (TDAG8), GPR68 (OGR1), og GPR132 (G2A) har nylig blitt identifisert som nye pH-sensorer som er foreslått til å bli aktivert av sure ekstracellulære pH [9]. Det har blitt demonstrert at GPR4 er overuttrykt i forskjellige typer av maligniteter [10, 11]. I epitelial ovariekarsinom, er GPR4 ekspresjon tetthet ledsaget av en høyere mikrovaskulær tetthet (MVD) [10], og dette korrelert med status av lymfeknutemetastase og klinisk stadium. Dette indikerer at GPR4 kan være involvert i kreft-relaterte angiogenese. I SCCHN, sammenhengen mellom syre eksponering, tumor angiogenese og GPR4 har ikke blitt godt undersøkt. I en tidligere studie, fikk vi bekreftet at GPR4 kunne aktivere AP1 og ERK signalveier ved sur ekstracellulære pH [12]. AP1 er en av de regulatoriske områder av IL6, IL8 og VEGFA [13-15]. GPR4 som en pH-sensor er positivt korrelert med økt mikrovaskulær tetthet, så vi antatt at det kunne øke ekspresjonen av IL6, IL8 og VEGFA og indusere angiogenese ved sur pH ekstracellulært. I denne studien har vi foreslått at GPR4 indusert angiogenese via GPR4-indusert IL6, IL8 og VEGFA sekresjon ved sur ekstracellulære pH i SCCHN.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
etisk tillatelse for denne studien ble gitt av forskningsetiske komité for Tongrenhospitalet i Beijing (Beijing, Kina).
Cell Kultur
SCCHN cellelinjer Fadu celler og Tca8113 celler, menneske mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1) ble brukt i studien. Fadu celler ble hentet fra State Key Laboratory av orale sykdommer, Sichuan University [16]. Tca8113 celler ble hentet fra Kina Infrastruktur cellelinje Resources. HMEC-1 celler, hentet fra Thermo Fisher ble generert av Ades et al [17]. Alle celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Hyclone, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco) og 1% penicillin /streptomycin. Alle celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktig atmosfære som inneholder 5% CO
2.
Generering av rekombinant adenovirus Bære GPR4 Gene
rekombinant adenovirus som uttrykker GPR4 (Ad-GPR4) ble generert i henhold til de metoder som er beskrevet tidligere [18]. Kort, GPR4 var sub-klonet inn i adenovirusvektor pAdxsi (Sinogenomax, Kina). Det rekombinante adenovirus-konstruksjonen ble transfektert inn i emballasjen HEK293 celler, og da disse celler ble fryse-tint flere ganger for å frigi intracellulære viruspartikler. De virale titere ble testet i HEK293-celler og antallet plakkdannende enheter (pfu) ble oppnådd ved anvendelse av en plaque-analysen.
Cell infeksjon og syrestimuleringen
Fadu celler og celler ble Tca8113 utsådd i seks-brønns plater, og nådde 80% konfluens ved den følgende dag. Deretter ble cellene infisert med Ad-GPR4 eller Ad-null (en blank rekombinant adenovirus som kontroll). Atten timer senere ble syrestimuleringen utført som beskrevet tidligere [12]. I korte trekk 18 timer etter infeksjon, kulturmediet ble erstattet med serum-fritt DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5 og 7,4). Cellene ble høstet etter stimulering i 6 timer. SB203580 (et p38 inhibitor, 1 uM) ble anvendt for å bestemme hvorvidt den p38-mediert sekresjon av de pro-angiogene cytokiner. For å utføre p38 hemming, GPR4 infiserte celler ble serum-sultet i 4 timer og behandlet med 1 mikrometer SB203580 for 1t før syrestimulering og deretter kulturmedier ble erstattet av serumfritt DMEM /F12 (pH 5,9). Cellene ble høstet 6t senere.
Betinget Medium
For å forberede kondisjonert medium (CM), den Fadu celler og Tca8113 celler ble infisert med Ad-GPR4 eller Ad-null i 18 timer, kulturen mediene ble erstattet med serum-fritt DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5 og 7,4), og celler uten infeksjon fungerte som en kontroll. Seks timer senere ble mediet sentrifugert (4 ° C, 1500 rpm), og supernatanten ble oppsamlet og lagret ved -80 ° C inntil bruk.
Real Time PCR (qPCR) og semikvantitativ PCR
Total RNA fra Fadu og Tca8113 celler og SCCHN vev ble isolert ved hjelp TRIzol Reagens (Life Technologies, USA). Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av en FastQuant RT Kit (TIANGEN, Kina). qPCR ble utført som anbefalt av produsenten. De følgende primere ble anvendt for qPCR: IL6 forstand 5′-TGAGAGTAGTGAGGAACAAG-3 «, antisense-5′-CGCAGAATGAGATGAGTTG-3′; IL8 forstand 5»-CCTGATTTCTGCAGCTCTGTGT-3 «, antisense-5′-GGTGGAAAGGTTTGGAGTATGTCT-3′; VEGFA forstand 5»-GCCCACTGAGGAGTCCAACATC-3 «, antisense-5′-CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3». Primerne for PCR av GPR4 var som følger: 5′-følelse AACCTCTATCGGGTGTTCGTG-3 «, antisense-5′-TTGGCTGTGCTGTTCCTCTTGG-3». GAPDH ble amplifisert som en indre standard. Den relative RNA nivå i hver prøve ble bestemt av to (-Delta Delta C (T)) -metoden.
Enzyme-Linked immunsorbent analyse (ELISA)
De kontrollceller og GPR4 infiserte celler ble stimulert i 6 timer ved anvendelse av serum-fritt DMEM /F12 (pH 5,9). Deretter ble mediet sentrifugert (4 ° C, 1500 rpm), og supernatanten ble oppsamlet. Konsentrasjonen av IL6, IL8, og VEGFA i kulturmediet ble kvantifisert med en ELISA kit i henhold til produsentens instruksjoner (Abcam).
Western Blot analyse
Celler ble lysert i RIPA buffer ( Beyotime, Kina) supplert med en 1 mM PMSF. Til sammen 100 ug proteiner ble underkastet elektroforese på 10% SDS-PAGE-geler, og elektrooverført til nitrocellulosemembraner (Invitrogen, USA). Western blot ble utført som tidligere beskrevet [12]. GPR4 antistoff ble kjøpt fra Life biovitenskap (Life, USA). Fosfor-p38 (p-p38), total p38 (p38), fosfor-VEGF reseptor 2 (Tyr1175) og VEGF reseptor 2 antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Cell Signaling, USA). GAPDH (Santa Cruz, California) ble brukt som et lysat lasting kontroll.
Tube Dannelse analysen
For å bekrefte effekten av GPR4 på tube-formasjonen i HMEC-en, vi utført en angiogenese-analyse på vekstfaktor-redusert Matrigel (BD Biosciences). En dag før røret formasjon analysen ble HMEC-1-celler utsådd på en 10-cm disk. Etter belegg 96-brønns plate med Matrigel følge produsentens instruksjoner, ble HMEC-1 celler høstet og resuspendert ved 1 x 10
5 /ml ved hjelp av CM supplert med 2% FBS. Deretter ble 0,1 ml av cellesuspensjonen ble tilsatt til den 96-brønns plate. VEGFA (1 ng /ml) ble anvendt som en positiv kontroll og DMEM tjente som en negativ kontroll. Platen ble inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 12 timer tillate dannelsen av kapillære-lignende strukturer. Bildene ble tatt ved hjelp av et lysmikroskop og slangelengden (piksler) ble regnet ved hjelp av Image-Pro Plus 6.0-programvare.
Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Modell
Befruktede Specific Pathogen Free (SPF) egg ble hentet fra Beijing Laboratory Animal Research Center. Eggene ble klekket i en fuktet inkubator ved 37,0 ° C med 60% fuktighet. På dag 10 ble store blodkar og sac merket på egget ved hjelp av kaldt lys Fountain (STORZ, Tyskland). Etter desinfeksjon med 75% alkohol, ble en rund vinduet åpnes på toppen av eggeskallet, opprettholde den ytre eggeskall membran. En nøyaktige hull ble boret ved stedet for luftsekken. Deretter ble 20 pl av normalt saltvann ble tilsatt til eggeskallet membranen. Eggeskallet membranen ble punktert ved anvendelse av en fin nål, og det lille hullet i presisere luftsekken ble suges ved hjelp av en gummi pipette pære, slik at normal salt separeres den ytre eggeskall membranen fra CAM. Eggeskallet membran ble skrellet av uten å forstyrre CAM. Vinduet var dekket med parafilm og egg ble plassert i kuvøse for en annen dag. Deretter 1 x 10
6control og GPR4 infiserte celler ble sådd ut på den øvre kamflate (n = 5 i hver gruppe). Plassen vinduet på egg ble forseglet. Deretter 5 pl DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5, 7,4) ble tilsatt til overflaten av cellen hver 24h. Fire dager senere ble den øvre CAM høstet og forholdet mellom vaskulær området til CAM området ble kvantifisert ved hjelp av Image-Pro Plus 6.0-programvare.
Bioinformatikk
Bioinformatikk metoden ble brukt som Li [ ,,,0],19] beskrevet, kort, array-data relatert til kreft fra Affymetrixhuman genomet U133 pluss 2,0 plattformen ble lastet ned fra GEO database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), og forskjellig uttrykt gener i svulster ble analysert ved hjelp TumourProfile database (https://tumour.bjmu.edu.cn/, upublisert) som Wang et al tidligere beskrevet databehandling og microarray analysemetoder [20, 21]. Uttrykket profil GPR4 i en rekke kreftformer, og det tilsvarende kontroll (normal eller ikke-tumor) vev ble undersøkt i denne database, og uttrykket nivåer var representert som et snitt av rang resultatet (ARS).
Immunhistokjemi ( IHC)
parafininnstøpte eksemplarer av laryngeal eller hypopharyngeal plateepitelkarsinom prøvene kombinert med peri-karsinom normale vevsprøver ble oppnådd fra hodet og nakken svulst prøvebank av Tongrenhospitalet i Beijing [12]. Parafin vev glass ble avvokset, rehydrert og plassert i 10 mmol /l citratbuffer (pH 6,0), og oppvarmet to ganger i en mikrobølgeovn i 5 minutter hver. Glassene ble inkubert med 3% H2O2 i 10 minutter, vasket med PBS, blokkert med 10% normalt geiteserum i 30 minutter, og deretter inkubert med anti-GPR4 (fortynnet 1: 100; sluttkonsentrasjon, 2 ug /ml, levetid, USA ) eller normalt kanin-IgG som kontroll ved 4 ° C over natten. Etter vasking ble platene farget med den katalyserte signerte forsterkersystem kit (DAKO kode k5007) og bilder ble fotografert med et Olympus IX70 mikroskop. Semikvantitativ uttrykk for GPR4 ble beregnet ved hjelp av Image-Pro Plus 6.0-programvare.
Data Analysis
Den bioinformatikk analyse av forskjellene i GPR4 uttrykk mellom kreft og kontroll vev ble evaluert ved bruk av Wilcoxon rank- sumtest i R (https://www.r-project.org/) programvare-miljøet. Bonferroni korreksjon av R-funksjonen «p.adjust» ble brukt til å justere P-verdier. De eksperimentelle data ble analysert ved anvendelse av Students t-test med SPSS19.0 programvare. En p-verdi 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
GPR4 Stimulerer Pro-angiogen cytokinutskillelse på Surt ekstracellulær pH
For å undersøke om GPR4 kan indusere. ekspresjonen av pro-angiogene cytokiner ved sur pH ekstracellulære, vi har oppdaget at ekspresjonen av IL6, IL8, og VEGFA ved forskjellige pH-verdier (pH 7,4, 6,5 og 5,9). Overekspresjon av GPR4 i GPR4 infiserte celler ble validert av qPCR og western blot (fig 1A). De mRNA nivåer av IL6, IL8, og VEGFA i Ad-GPR4 celler økt statistisk signifikant sammenlignet med Ad-null celler bare ved pH 5,9 (fig 1B). Sammenlignet med kontrollene, var det 67.8-, 118- og 12,5 ganger induksjon for IL6, IL8 og VEGFA, henholdsvis i Ad-GPR4 celler. Dette indikerte at sure ekstracellulære pH forbedret pro-angiogene cytokin ekspresjon via GPR4, noe som ble ytterligere bekreftet på proteinnivået. Konsentrasjonene av IL6, IL8, og VEGFA ble økt betydelig i supernatanten av GPR4 overuttrykt celler sammenlignet med kontrollcellene ved pH 5,9 (Fig 1 C). Inhibitoren, SB203580, kan redusere ekspresjon og sekresjon av IL6, IL8, og VEGFA (figur 2A og 2B), noe som tyder på at p38 kan være involvert i cytokininduksjon ved GPR4. Western blot ble utført for å undersøke om GPR4 kunne øke p38 fosforylering ved forskjellige pH-verdier. Fosforylering av p38 øket i GPR4 overuttrykt celler ved pH 5,9 (figur 2C), som kunne bli inhibert av SB203580 (figur 2D). Våre resultater var korrespondent med det, i SCCHN, p38 er konstitutivt aktivert og fører til økt sekresjon av cytokiner IL6 og IL8 [22].
Total RNA og protein av Ad-GPR4-Fadu celler, Ad-null- Fadu celler ble isolert etter syrestimulering i 6 timer. qPCR og western blot ble utført. (A) Overuttrykte GPR4 i Ad-GPR4-Fadu celler ble comfirmed av qPCR og western blot. (B) uttrykk for IL6, IL8, og VEGFA økt betydelig i GPR4 infiserte celler ved pH 5,9. (C) Supernatantene til cellene ble samlet og konsentrasjonene av IL6, IL8 og VEGFA ble påvist ved hjelp av ELISA. Lignende resultater ble observert i Tca8113 celler (S1 Fig).
(A) I Ad-GPR4-Fadu celler, SB203580 redusert uttrykk for IL6, IL8 og VEGFA ved pH 5,9. (B) SB203580 redusert sekresjon av IL6, IL8 og VEGFA. (C) GPR4 økt p38 fosforylering på pH5.9. (D) SB203580 inhiberer fosforylering av p38 i GPR4 overuttrykt celler. Lignende resultater ble observert i Tca8113 celler (S2 Fig).
GPR4 Fremmer Angiogenese In Vitro
For å teste om GPR4 kunne fremme tube-formasjonen, HMEC-1 celler ble inkubert med CM avledet fra kontrollceller og GPR4 overuttrykt celler. Lengden av rørene (piler) ble signifikant økt i HMEC-1-celler inkubert med CM fra GPR4 infiserte celler sammenlignet med kontrollceller ved pH 5,9 (figur 3A). Dette indikerte at overekspresjon av GPR4 i SCCHN kan indusere angiogenese in vitro ved sur pH. I SCCHN, er angiogenese utløst av IL-8, IL-6 og VEGF [23, 24]. For å teste om effekten av GPR4 angiogenese var direkte formidlet av IL6, IL8 og VEGFA sekresjon, monoklonale nøytraliserende antistoffer (R datasettet deponert i Cancer Genome Atlas (TCGA) fra totalt 72 pasienter har blitt samlet inn og brukt for analyse [25].
Vi samlet 12 SCCHN prøver (Tabell 2) og utføres RT-PCR (figur 5A og 5B) og immunhistokjemisk (IHC) farging (figur 5C og 5D). Alle pasienter som led av gastroøsofageal refluks. Som vist i figur 5, ble amplifisert i GPR4 9/12 prøver og oppregulert i tumorvev (figur 5A) sammenlignet med peri-tumor normale vev (figur 5B). Den GPR4 proteinet som blir uttrykt ved høye nivåer (røde piler) i tumorceller sammenlignet med de epiteliale celler av peri-tumor normale vev. Lignende resultater ble observert i både strupehodet og hypopharyngeal kreft.
(A) RT-PCR av GPR4 i cancervev. (B) RT-PCR av GPR4 i peri-kreft normalt vev. GAPDH ble anvendt som en indre standard. (C) Representant bilde av IHC av moderat differensiert hypopharyngeal kreft. (D) Peri-kreft normalt vev fra samme pasient som C (E) Integrert optisk tetthet (IOD) av positive uttrykk celler (piler) ble beregnet ved hjelp av Image-Pro Plus 6.0-programvare. I alt ble 12 tilfeller av SCCHN inkludert. Nivået på immunoreaktivitets ble gradert ved å beregne integrert optisk tetthet (IOD) av positive uttrykk celler.
Diskusjoner
I denne studien har vi foreslått at, når de utsettes i et surt miljø, kan GPR4, en av de proton-sensing GPCR, indusere angiogenese via pro-angiogen cytokin sekresjon i SCCHN. Cytokiner inkludert IL6, IL8, og VEGFA, og dette ble bekreftet ved qPCR og ELISA. Den pro-angiogene effekten av GPR4 ble observert av røret dannelsen analysen og CAM-modellen.
Angiogenese er en av kjennetegnene til kreft [26]. Tumorer kan ikke vokse utover en kritisk størrelse eller metastasere til et annet organ uten blodkar [27], slik at de må rekruttere nye blodårer av angiogenese. Den «angiogene bryter» er balansert med pro-angiogene og anti-angiogene molekyler [27]. En av de signaler som utløser denne bryteren er lav pH. I humane melanomceller, øker sure pH ekspresjonen av proangiogenic faktorene VEGFA og IL8 [28]. GPR4 hovedsakelig fungerer som et proton sensor og er uttrykt endogent i HMEC-en og HUVEC. Ekstracellulære acidose kan aktivere GPR4 og føre til cAMP produksjon [29]. Hyperkapni acidose kan også aktivere GPR4 å stimulere HUVEC adhesjonsmolekyl uttrykk og klebrighet [30]. I en annen studie ble det vist at GPR4 spilt sentrale roller i vekst, migrasjon, og tube dannelse av endotelceller, men pH-endringer kan ikke regulere cAMP produksjon i HMEC-en og HUVEC [31]. I HUVEC, aktiveres acidose GPR4 og øker ekspresjon av IL1, IL2, IL6 og IL8 [32]. GPR4, som en pH-sensor, er fullt aktivert ved sur pH-verdi 6,8 og partielt aktivert i det fysiologiske området (pH 7,4-6,8) [33, 34]. Gastroøsofageal refluks er en vanlig hendelse i hode og hals kreftpasienter [3], noe som betyr at slimhinner og karsinom er ofte utsatt for lav pH. Forholdet mellom lav pH og tumorangiogenese i SCCHN har ikke vært godt undersøkt. I denne studien har vi foreslått at i Ad-null-Fadu og Ad-null-Tca8113 celler, kunne lav pH ikke øke uttrykket av IL6, IL8, og VEGFA. I Ad-GPR4 celler, økt ekspresjon av IL6, IL8, og VEGFA vesentlig sammenlignet med kontroll ved pH 5,9, men ikke ved pH 6,8 og pH 7,4, noe som kan tyde på at GPR4 er fullt aktivert ved pH 5,9 i SCCHN, og dette er i samsvar med vår tidligere studie [12].
røret formasjon analysen og CAM modell bekreftet pro-angiogene effekten av GPR4. CM avledet fra Ad-GPR4-Fadu celler indusert lengre rør i HMEC-1-celler og mer vaskulær tetthet på CAM enn i de andre gruppene ved pH 5,9. De nøytraliserende antistoffer av IL6, IL8 og VEGFA redusert slangelengder av HMEC-1 celler, noe som indikerer at GPR4 indusert angiogenese via IL6, IL8 og VEGF-sekresjon. VEGFA og IL6 er anerkjent som den viktigste pro-angiogene molekyler i SCCHN og har vært knyttet til sykdom aggressivitet og dårlig pasient utfall [35-40]. IL8, et sluttprodukt av VEGF-reaksjonsveien, ble også observert ved høye nivåer i SCCHN [40]. På grunn av den viktige rollen av angiogenese i tumorprogresjon, har antiangiogene midler blitt utviklet. I Fadu SCCHN xenografter, langsiktig forvaltning av bevacizumab, en vaskulær endotelial vekstfaktor antistoff, effektivt modulert kjemoterapeutisk effekt [41]. I fase II kliniske studier i SCCHN pasienter, bevacizumab pluss cetuximab eller kjemoterapi viste lovende effektresultater [42, 43]. Overekspresjon av IL8 førte til motstand mot bevacizumab i SCCHN, så co-målretting av VEGF og IL8 kan hjelpe overvinne motstand og forbedre terapeutisk effekt.
Syrenøytraliserende medikamenter inkludert histamin 2 reseptor antagonist (H2RA) og protonpumpehemmere (PPI ) blir alltid brukt i behandlingen av SCCHN pasienter. Noen studier har vist at bruk av syrenøytraliserende medisiner kan ha betydelige terapeutiske fordeler for SCCHN pasienter [44, 45]. En av de mekanismer som kan skyldes syrenøytraliserende medikamenter kan modulere adhesjon av tumorceller til endothelium [44]. I denne studien har vi vist at GPR4 fremmer pro-angiogene faktorer sekresjon ved sur pH. Disse resultater indikerer at inhibering av GPR4 eller sur pH-verdi kan føre til hemning av tumor angiogenese. Så spekulerer i at en annen sannsynlig mekanisme er at syrenøytraliserende medikamenter kan hemme pro-angiogene faktorer sekresjon ved å øke pH-verdien, og deretter redusere angiogenese, som spiller en kritisk rolle i løpet av tumorprogresjon. Tidligere viste vi at sure ekstracellulære pH øker matriksmetalloproteinase (MMP) uttrykk via ERK signalveien i GPR4 overuttrykt celler. I denne studien viste vi at GPR4 kunne øke fosforylering av p38 ved pH 5,9, noe som kunne bli inhibert av SB203580. SB203580 kan redusere ekspresjonen av pro-angiogene cytokiner, noe som kan indikere p38 spiller en viktig rolle ved formidling av ekspresjon av cytokiner.
Som konklusjon, vi foreslo at GPR4 induserer angiogenese via GPR4-indusert p38-mediert IL6, IL8 og VEGFA sekresjon ved sur ekstracellulære pH i SCCHN.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fig. GPR4 stimulerer cytokin sekresjon ved sur pH i Tca8113 celler Total RNA og protein i Ad-GPR4-Tca8113 celler.
, Ble Ad-null-Tca8113-celler isolert etter syrestimulering i 6 timer. qPCR og western blot ble utført. (A) Overuttrykte GPR4 i Ad-GPR4-Tca8113 celler ble comfirmed av qPCR og western blot. (B) uttrykk for IL6, IL8, og VEGFA økt betydelig i GPR4 infiserte celler ved pH 5,9. (C) Supernatantene til cellene ble samlet og konsentrasjonene av IL6, IL8 og VEGFA ble påvist ved ELISA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s001 plakater (TIF)
S2 fig. SB203580 reduserer cytokinutskillelse ved å hemme p38 fosforylering i Tca8113 celler. Product: (A) I Ad-GPR4-Tca8113 celler, SB203580 redusert uttrykk for IL6, IL8 og VEGFA ved pH 5,9. (B) SB203580 redusert sekresjon av IL6, IL8 og VEGFA. (C) GPR4 økt p38 fosforylering på pH5.9. (D) SB203580 hemme fosforylering av p38 i GPR4 infiserte celler
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s002 plakater (TIF)
S3 Fig. Den nøytraliserende antistoff effektene kan bli reversert ved tilsetning av det overskytende beløp av IL6, IL8 eller VEGFA i rør-analysen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s003 plakater (TIF)
S4 Fig . Tube-analysen av Tca8113 celler.
(A) Røret lengde (piler) av HMEC-1 celler ble økt i CM avledet fra Ad-GPR4-Tca8113 celler sammenlignet med Ad-null- Tca8113 celler ved pH 5,9. (B) Den nøytraliserende antistoffer av IL6, IL8 og VEGFA hemmet tube-formasjonen i HMEC-1 celler. Isotype IgG-antistoff ble anvendt som en kontroll i nøytraliserende antistoff-test
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s004 plakater (TIF)
S5 fig. De Ad-GPR4-Tca8113 celler rekruttert mer vaskulær enn Ad-null-Tca8113 celler bare ved pH 5,9 i CAM modell
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s005 plakater (TIF)
S1 File . Excel-fil som inneholder støtte informasjon data fra denne studien
doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s006 plakater (XLSX)
Takk
Vi takker Dr. Pingzhang Wang ( Avdeling for immunologi, School of medisinske basalfag, Peking University Health Science Center, Peking University Center for menneskelig sykdom Genomics) for bioinformatikk analyse
.
