Abstract
Benign prostatahyperplasi (BPH) og prostata carcinom (CAP) er knyttet til aldring og tilstedeværelsen av androgener, som tyder på at androgen regulert gener spiller en stor rolle i disse vanlige sykdommer. Androgen regulering av prostata vekst og utvikling avhenger av tilstedeværelsen av intakt epitel-stroma interaksjoner. Videre er prostatisk stroma innblandet i BPH. Dette tyder på at epiteliale cellelinjer er utilstrekkelig for å identifisere androgen regulerte gener som kan bidra til BPH og cap og som kan tjene som potensielle kliniske biomarkører. I denne studien brukte vi en human prostata xenograft modell for å definere en profil av gener reguleres
in vivo
av androgener, med vekt på å identifisere kandidat biomarkører. Godartet overgangssone (TZ) humant prostatavev fra radikale prostatectomies ble podet til sub-nyrekapselen stedet for intakte eller kastrerte hann-mus med immunsvikt, etterfulgt av fjerning eller tilsetning av androgener, respektivt. Microarray analyse av RNA fra disse vev ble anvendt for å identifisere gener som var; 1) høyt uttrykt i prostata, 2) hadde signifikant ekspresjon endres som reaksjon på androgener, og, 3) koder for ekstracellulære proteiner. Totalt 95 gener som oppfyller disse kriteriene ble valgt ut for analyse og validering av uttrykk i pasient prostata vev ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. Expression nivåer av disse genene ble målt i sammenslåtte RNA fra menneskelige prostata vev med varierende alvorlighetsgrad av BPH patologiske forandringer og lue av varierende Gleason score. En rekke av androgen-regulerte gener ble identifisert. I tillegg er et delsett av disse genene ble overuttrykt i RNA fra kliniske BPH vev, og nivåene av mange ble funnet å korrelere med sykdomsstatus. Våre resultater viser gjennomførbarheten, og noen av problemene, ved å bruke en mus xenograft modell for å karakterisere de androgen reguleres ekspresjonsprofiler av intakte humane prostatavevet
relasjon:. Kjærlighet HD, Booton SE, Boone BE, Breyer JP , Koyama T, Revelo MP, et al. (2009) Androgen regulerte gener i human prostata xenografter i Mus: Forholdet til BPH og prostatakreft. PLoS ONE 4 (12): e8384. doi: 10,1371 /journal.pone.0008384
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 18. august 2009: Godkjent: 18 november 2009; Publisert: 21.12.2009
Copyright: © 2009 Google et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttet av The National Institute of Diabetes og Digestive og nyre sykdommer (NIDDK) MPSA Consortium tilskuddet UO1-DK63587, National Institutes of Health (NIH) tilskudd DK067049 og The Vanderbilt Microarray delt ressurs, støttet av Vanderbilt Ingram Cancer Center, stipend P30 CA68485, og Vanderbilt Digestive Disease Center, gi P30 DK58404, og Vanderbilt Vision Center, gi P30 EY08126. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Benign prostatahyperplasi (BPH) er svært vanlig i aldring menn, bidrar til mønsteret av sykelighet kjent som nedre urinveissymptomer (LUTS) og resulterer i betydelige årlige helsekostnader [1]. Til tross for tilgjengeligheten av medisinsk og kirurgisk behandling for BPH er det fortsatt utilstrekkelig forståelse av de involverte i godartet patologisk veksten av den humane prostata prosesser
in vivo product: [2]. Slik informasjon kan bidra til å bedre forutsi hvilke pasienter kan ha nytte av gjeldende medisinsk behandling eller er mer sannsynlig å utvikle seg til å kreve kirurgisk inngrep, samt informere om valg av nye medisinske tilnærminger rettet mot nye veier.
BPH oppstår som menn alder, og androgener er nødvendig for utviklingen av tilstanden [3], [4]. BPH er karakterisert ved patologisk kjertel og stromal hyperplasi i prostata overgangssonen (TZ) [5]. Oppvåkning av den embryoniske induktive potensialet i prostata stroma har vært foreslått som en årsak til BPH [3], [5], [6], [7]. Dette er basert på ideen om at prostata vekstresultater fra den lokale samspill av vekstfaktorer mellom de epiteliale og stromale elementer av organet under påvirkning av testikler androgener, tyder på at androgen regulerte gener spiller en viktig rolle i sykdommen. Denne hypotese støttes av betydelig eksperimentelle bevis spesielt fra vev rekombinasjon modeller [8], [9], [10].
Prostatic inflammasjon er også blitt implisert i patogenesen av BPH [11], [12] , [13], [14]. Betennelse er knyttet til alvorlighetsgraden av BPH, og MTOPS (medisinsk behandling av prostata symptomer) studie tyder på at risikoen for BPH progresjon og akutt urinretensjon er større hos menn med prostata betennelse [13], [15]. Økt prostata betennelse kan også føre til avbrudd av epitel struktur og arkitektur, noe som resulterer i økte serumnivåer av prostataspesifikt antigen (PSA).
prostatavekst, differensiering og voksen funksjon er avhengig av tilstedeværelsen av androgener. Det er godt etablert at androgener kontroll vekst og differensiering via mesenchymale-epitelial interaksjoner. I den voksne prostata, er androgener antas å virke gjennom den stromal androgenreseptoren (AR) for å opprettholde en veksthvile kjertel [16], [17] og gjennom epiteliale AR for å fremkalle den sekretoriske differensiert funksjon av prostata epitelet [18] . I motsetning til normal vekst-quiescence, hyperplastisk vekst av kjertel-epitel og stroma i overgangssonen i BPH representerer endringer i balansen mellom celledeling og død. BPH kan dermed feilaktig rekapitulere viktige hendelser i prostatautviklingsbiologi. De mesenchymale og epitelceller gener reguleres av androgener som er viktige i unormal prostatavekst BPH gjenstår å bli fullstendig definert. Studier med høy gjennomstrømning cDNA mikromatriser med androgen stimulert carcinoma cellelinjer er neppe være aktuelt å enten prostata utvikling eller BPH. Transform epitelceller i kultur har en vesentlig forskjellig fenotype, og tilhørende proteom, fra sine
in vivo
kolleger. I tillegg er slike metoder ikke tillater samtidig påvisning av nøkkel stromale cellegener eller gener som kan bli modulert som en konsekvens av avgjørende epitel-stroma interaksjoner.
Mer biologisk relevante studier som anvender cDNA microarray analyse av BPH-vev har blitt rapportert. Luo et al. analysert ekspresjonen av 6500 humane gener i prostata kreft og BPH vev fra pasienter som gjennomgår radikal prostatektomi eller transuretral reseksjon av prostata (TURP) [19], [20]. Et antall gener ble funnet å være konsistent oppregulert i BPH sammenlignet med normal prostata. Disse inkluderte
IGF1
,
IGF2
,
TGFB3
,
BMP5
,
MMP2
,
COX2
, og
GSTM5
. Men disse studiene ble det brukt vev anriket for epitelceller. Som et resultat, kan analysene har gått glipp av potensielt viktige gener uttrykkes hovedsakelig i stromale celler. Disse studiene tok ikke stilling til om noen av pasientene hadde gjennomgått tidligere androgen-ablasjon terapi. Tilnærminger basert på RNA ekstrahert fra vev tillater heller ikke for direkte manipulasjon av hormonell stimulering, noe som begrenser muligheten for mer direkte påvise gener reguleres av androgener, som kan tjene som predikator for respons på behandling rettet mot androgene stimulering eller som nye mål for alternativ medikamentell behandling i dette androgen drevet sykdomsprosessen.
i en annen relevant studie ble genuttrykk profiler i prostata stromale celler fra forskjellige prostata soner analysert, sammenligner normale og syke vev [21]. Et antall gener ble funnet å bli uttrykt forskjellig mellom BPH stroma og normal overgangssone (TZ) stroma. Mens mange potensielt viktige stromale gener ble identifisert som kan spille en rolle i BPH, disse studiene benyttet isolerte stromaceller dyrket
in vitro
, noe som sannsynligvis vil resultere i endrede genuttrykksmønster fra dem som ville bli sett
in vivo
.
i denne studien brukte vi oligonukleotid mikromatriser å undersøke uttrykket av androgen regulert gener i benign menneskelige prostata vev vokser som xenotransplantater i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus [22]. Denne fremgangsmåten bevarer de biologisk relevant vekselvirkninger mellom epitel og stroma som oppstår
in vivo
og gir mulighet for direkte manipulering av androgener, enten ved kastrering eller hormon supplering av verten. Den resulterende datasettet ble deretter analysert for å identifisere forholdsvis høyt uttrykte gener, som ble regulert androgen. I et forsøk på å identifisere potensielle biomarkører mottagelig for fremtidig blodbasert test, ble det lagt vekt på gener som har produkter var kjent eller forventet å være ekstracellulært. Uttrykk av disse genene ble deretter analysert ved hjelp QRT-PCR med cDNA bassenger avledet fra vev fra pasienter med minimale, milde, moderate og alvorlige BPH patologi endringer, eller med lokk, for å avgjøre om uttrykket korrelert med sykdomsstatus.
materialer og metoder
Etikk erklæringen
de identifiserte menneskelige prostata vevsprøver ble hentet fra Vanderbilt Tissue Acquisition Kjerne via Avdeling for patologi i samsvar med Vanderbilt IRB protokoller. Alle pasienter signert informert samtykke godkjenne bruk av sine vev for uspesifiserte forskningsformål. Alle forsøk med dyr ble utført i henhold til dyrevernloven og godkjent av Vanderbilt Institutional Animal Care og bruk komité. Dyr omsorg /velferd og veterinær tilsyn ble gitt av Vanderbilt Divison av Animal Care.
Histopatologisk analyse og utvalgs
For å fastslå alvorlighetsgraden av BPH patologi endringer for tilfeller benyttes for RNA ekstraksjon, TZ områder berørt av kjertel og stromal hyperplasi ble skissert i hele mount seksjoner fra radikal prostatektomi (RP) prøver innhentet via Avdeling for patologi i samsvar med Vanderbilt IRB protokoller. TZ volumer ble bestemt ved planimetri med en digitalisert tegnebrett, på en måte som er identisk til vår rutine bestemmelse av totaltumorvolum i RPs [23], [24], [25]. Preferanse ble gitt til tilfeller med lite volum omkretssone (PZ) tumorer, slik at en hvilken som helst generell prostataforstørrelse vil skyldes TZ utvidelse og for å redusere sannsynligheten for at hormonelle metabolisme potensielt relevant for BPH ville bli forandret ved stort volum prostatakreft [26] . BPH ble kategorisert fra 37 saker som minimal (min), mild, moderat eller alvorlig, basert på følgende kriterier. Min /kontroll: TZ volum 4,5 cm
3, prostata vekt 34 g, No BPH knuter; Mild BPH: TZ volum 4.5-8.99 cm
3 eller prostata vekt 34-44.99 g eller BPH knuter; Moderat BPH: TZ volum 9 til 16,99 cm
3 eller prostata vekt 45-59.99 g og BPH knuter; Alvorlig BPH: TZ volum ≥17 cm
3 eller prostata vekt ≥60 g og BPH knuter. Prostata kreft vev ble klassifisert som moderat differensiert (Gleason score 5-6) eller dårlig differensierte (Gleason score 8-9). Snap frosne friske vev kjerner anskaffes som beskrevet nedenfor ble behandlet for RNA og histologi [27].
Under Nedsatt Xenografting av Fresh Menneskelig TZ Samples og hormon Ablation strategier
De identifiserte menneskelige prostata vev prøvene ble hentet fra Vanderbilt Tissue Acquisition Kjerne via Avdeling for patologi i samsvar med Vanderbilt IRB protokoller. 6 mm diameter kjerner hentet intraoperativt ferske RP prøver ble anskaffet fra høyre og venstre TZ og PZ fra midten til bunnen og fra midten til apex som beskrevet [27] og histologisk analyse ble utført på frosne deler av fulle tykkelse tverrsnitt. Kjerner fast bestemt på å inneholde normal TZ vev ble kuttet i biter ca 2-3 mm i tykkelse og 4-6 stykker ble deretter xenopodet under nyre kapsler med alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus voksen hann [CB-17 /IcrHsd-SCID-mus ( Harlan, Indianapolis, IN)]. TZ vev fra hver av seks pasienter ble xenopodet i sett av 10 kastrerte SCID mus med noen grupper av mus som fikk vev fra to ulike pasienter når det er tilgjengelig, podet på kontralaterale nyrer. Fem mus fra hver gruppe ble gitt subkutan implantater bestående av en 2,5 cm lengde av silastinrør (ID 1,98 mm x 3,18 mm OD, Dow Corning, Midland, MI) inneholdende 25 mg testosteron (PCCA, Houston, TX). Endene av silastinrør ble forseglet med silikontypen En medisinsk klebemiddel (Dow Corning). En liten mengde av maisolje ble tilsatt før forsegling av slangen for å lette oppløsning av testosteron. Etter at de xenografter å etablere for en måned, ble implantatene fjernet fra testosteron supplert mus, og 25 mg testosteron pellets (produsert med en Parr Pellet Press, modell 2816 med 4,5 mm dø, Parr Instrument Company, Moline, IL) ble implantert subkutant i mus som ikke hadde fått testosteron. Kontrollmus ble avlivet ved tidspunktet for androgen tilsetning eller fjerning, og de gjenværende mus fra hver gruppe ble avlivet ved 1, 3, 7 og 14 dager etter androgen tilsetning eller fjerning. Høstet xenotransplantater ble raskt dissekert under forstørrelse og hurtigfrosset i flytende nitrogen. Frosne vev ble lagret ved -80 ° C.
RNA-ekstraksjon og cDNA-Mikromatriser
RNA-ekstraksjon av hurtigfrosset TZ vev og høstet xenotransplantater ble utført ved anvendelse av en modifikasjon av tidligere beskrevne metoder [27] , [28]. I korthet, RNA ble ekstrahert ved bruk av TRIzol (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), etterfulgt av en andre RNA isolert ved bruk av RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, California) med DNase-behandling. RNA-prøvene ble lagret ved -80 ° C. RNA kvalitet ble analysert ved Vanderbilt Microarray Shared Resource (VMSR) ved hjelp av spektrofotometri (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) og bioanalyse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). RNA prøver av xenotransplantater ble sendt til VMSR for forsterkning (Nugen Systems, Inc., Traverse City, Michigan) og merking, etterfulgt av hybridisering til mikromatriser skrevet ut fra menneskelige versjonen 2.0 OligoLibrary, (Compugen, San Jose, CA), som inneholder 28 830 unike gener fra totalt 29,134 oligos. Referanse RNA ble opprettet ved å samle RNA prøver fra både kastrat og androgen behandlet vev fra dag null kontroll mus.
Statistisk analyse av mikroarray data
På grunn av stor variasjon iboende hos enkelte pasienter, er tid 0 for hver vevsprøve ble anvendt som kontroll eller referanseprøven, snarere enn en standard referanseprøve over hele eksperimentet. Data ble normalisert ved Lowess hjelp GeneTraffic programvare (Iobion Informatikk, La Hoya, CA) og importert til GeneSpring (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) for nærmere analyse. Opprinnelig ble bare dag 0 og dag 14 tidspunkter i betraktning, sammen med gener som hadde minst 1,5 ganger oppregulering på dag 14 sammenlignet med prøven dag 0 er valgt, noe som ga 5,679 gener /prober. En ANOVA-analyse ble brukt for å identifisere gener med betydelige forskjeller i ekspresjon, med en
P
-verdi cut-off på 0,05, noe som indikerer forventet 284 falske positive gener. En Welch t-test ble deretter brukt til å identifisere gener med signifikante forskjeller (
P
-verdi mindre enn 0,05) i ekspresjon mellom dagene 0 og 14 på tvers av alle vevsprøver. Denne listen ble så filtrert av signal uttrykk verdi, beholder den øverste 95% av signal dynamisk område, noe som ga 784 gener /sonder. Denne metoden for analyse ble utført for uavhengig både for kastrering og testosteron supplert datasett. Alle statistiske analyser av microarray data ble utført av VMSR
Identifikasjon av søker biomarkør Targets
potensiell kandidat gener ble systematisk valgt med overlappende bioinformatikk kriterier, syssels WebGestalt. 1) androgen regulerte (1,5 fold eller
P
≤0.05 innenfor våre microarray data), 2) uttrykt ved betydelig høyere nivåer i prostata forhold til andre vev (
P
≤0.05 av hypergeometrisk test), og 3) ekstracellulære rom eller celleoverflaten (Gene ontogeny kategorier). Disse kriteriene gitt et sett av gener som inkluderte tidligere validerte biomarkører, inkludert
KLK3
,
ACPP
, og
MSMB
. Flere andre gener kjent eller mistenkt for å være involvert i BPH basert på tidligere studier ble «manuelt» inkludert for videre studier:
IGF1
,
IGF1R
,
TGFB1
,
TGFB3
,
TGFBR1
, og
TGFBR2
. Totalt 84 genet mål (og
18S
rRNA housekeeping kontroll genet) ble valgt for bekreftelse av uttrykk i pasientprøver, flere vurderes med redundante sonder.
Real-Time QRT-PCR Bekreftelse
en TaqMan lav tetthet microfluidic array-kort, format 96a (Applied Biosystems, Foster City, California) er designet for å analysere kandidat gener fra microarray analyse og kontroll gener, for totalt 96 mål. 1 mikrogram total RNA ble revers transkribert til enkelt cDNA ved hjelp av High-Capacity cDNA Arkiv kit (Applied Biosystems). Etter cDNA-syntese, ble RNA degradert ved alkalisk hydrolyse, justert til nøytral pH-verdi, og cDNA ble renset ved adsorpsjon på silikagel (QIAquick PCR Purification kit, Qiagen Inc.) og eluert i 64 ul 10 mmol /liter Tris HCl (pH 8,5) . cDNA mengder ble målt spektrofotometrisk (Nanodrop ND-1000, Nanodrop Technologies). cDNA ble fortynnet til 0,25 ng /pl i 1 x TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems), som er lagt inn i mikrofluid kortet, forseglet og sentrifugert. Kortene ble deretter syklet på en ABI Prism 7900HT sekvens deteksjonssystem, og data analysert med SDS 2.1-programvaren (Applied Biosystems). Etter normalisering til den endogene kontroll, 18S rRNA, nivåer ble uttrykt i forhold til kontrollen RNA pool kalibrator (endring). RNA fremstilt fra hver kategori av BPH vev ble samlet fra 5-10 pasienter. Kontroll RNA ble samlet fra pasienter med ikke nevneverdig TZ ekspansjon. Analysen inkluderte fire gjentak for milde og alvorlige BPH bassenger, samt moderat differensierte og dårlig differensiert prostatakreft bassenger, og åtte replikater for kontroll og moderate BPH bassenger.
immunhistokjemisk farging
menneske~~POS=TRUNC prostata vevsprøver fra parafin integrert hele mount kvartaler fra de 43 pasientene som opprinnelig kjennetegnet for BPH patologi alvorlighetsgrad og benyttes for tilsvarende TZ avledet RNA ble hentet fra Vanderbilt Tissue Acquisition Kjerne via Avdeling for patologi og microarray ble generert av en av forfatterne (MPR). De mikromatriser inneholdt tre 0,6 mm kjerneprøver, to fra TZ og en fra PZ bort fra kreft involvert området. Farging av vevssnitt ble utført ved anvendelse av en tidligere beskrevet protokoll [29]. Seksjoner (5 um) ble kuttet og montert på ladede glassplater. Etter deparaffinization og rehydrering ble vevssnitt utsatt for antigen gjenfinning ved oppvarming i mikrobølgeovn i 10 minutter i Vector H-3300 antigen avsløring løsning (1:100, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, California). Objektglass ble deretter inkubert i 0,3% hydrogenperoksid i metanol i 30 minutter ved romtemperatur (RT), etterfulgt av en 1 timers inkubering i 5% geiteserum i PBS ved romtemperatur. Glassene ble inkubert med primære antistoffer over natten ved 4 ° C i 5% geiteserum i PBS. Antistoffer som ble brukt var en mus monoklonalt mot TIMP2 (1:300, sc-21735, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), og kanin polyclonals mot FGF2 (1:500, sc-79, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) og SMOC1 (1:100, Atlas Antistoffer, Stockholm, Sverige). Objektglassene ble deretter vasket og inkubert i en biotinylert sekundært antistoff (kanin-anti-mus eller svin-anti-kanin, 1:300, DAKO, Carpinteria, CA) ved RT i 60 min, vasket i PBS i stor utstrekning, og deretter inkubert i ABC-HRP kompleks (Vector Laboratories) i 30 min. Bundede antistoffer ble deretter synliggjort ved inkubering med flytende 3,3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAKO). Slides ble deretter skylles grundig i vann fra springen, kontra med hematoksylin og montert. Stained vevssnitt ble fotografert og behandlet ved hjelp av en Zeiss AX10 Imager.M1 mikroskop og AxioVision versjonen 4.6 software.
De immun lysbilder ble anmeldt av en patolog (MPR) blindet til BPH patologi alvorlighetsgraden i saken og resultatene uttrykt på en semikvantitativ måte. Prosentvis farging ble scoret på en skala fra 0 til 4, hvor 0 = ingen flekker, 1 = mindre enn 25%, 2 = 25% til 50%, 3 = 50% til 75%, og 4 = 75% til 100%. Intensiteten av farging ble scoret på en skala fra 1-3, der 1 = mild, 2 = moderat, og 3 = markert. For en prøve som ga ingen farging, intensiteten stillingen ble også 0. Når både stromale og epiteliale farging var tilstede, ble scoring gjøres separat. For å beregne en proteinekspresjon indeks, ble den prosentvise resultatet summert med intensiteten stillingen. De kombinerte score ble plottet for hver BPH patologi kategori (minimale, milde, moderate, alvorlige BPH endringer), og Kruskal-Wallis tester ble brukt for å sammenligne de samlede score på tvers av ulike sykdomsgrad status.
Resultater
androgen regulert genekspresjon Profiler i human prostata overgangen sone
Vi profilert genuttrykksmønster fra menneskelige prostata TZ xenografter, etter tillegg eller subtraksjon av testosteron. Figur 1 illustrerer det generelle skjema som brukes for manipulering av androgennivåer i SCID-mus som bærer sub-nyrekapselen prostata xenografter. Totalt RNA ble fremstilt fra innhøstet xenografter med eller uten eksponering for testosteron for 0, 1, 3, 7 og 14 dager. Et basseng er laget av like mengder av RNA fra dag 0 kastrering og intakte mus xenotransplantater ble anvendt som en standard referanse. Totalt 58 hybridiseringer ble gjennomført, som inkluderte prøver fra seks pasienter. Innledende analyse indikerte et høyt nivå (opp til 10 ganger) av pasient-til-pasient variasjon i uttrykk nivåer i kjente androgen regulert gener som
KLK3 plakater (PSA). For å tillate dette forventes biologisk variabilitet mellom individuelle pasient vev, hver enkelt pasients vev avledet RNA prøver ble re-sentrert til at pasientens tid 0 kontroller. For den primære analysen, ble to tidspunkter i betraktning, dagene 0 og 14, noe som ga 5,679 gener med en 1,5 gangers eller større økning i ekspresjon. En ANOVA analyse ble utført på følgende 5,679 genene, med en
P
-verdi cut-off på 0,05, som spår 284 falske positiver. Gener som hadde minst et 1,5-ganger økning eller reduksjon i ekspresjon på dag 14 sammenlignet med prøven dag 0 ble deretter filtrert ved hjelp av signaluttrykk verdi, beholdt den øverste 95% av signal dynamisk område, hvilket ga 784 gener. Microarray data har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus [30] og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE17862 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE17862) .
TZ vev fra seks pasienter var xenopodet under nyre kapsler med kastrerte hann SCID mus (10 mus per pasient). Fem mus fra hver gruppe ble deretter gitt sub-kutan implantater inneholdende 25 mg testosteron. Etter at xenographs å etablere for en måned, ble implantatene fjernet fra testosteron supplert mus, og 25 mg testosteron pelletene ble implantert i mus som ikke hadde mottatt testosteron. Kontrollmus ble avlivet ved tidspunktet for androgen tilsetning eller fjerning, og de gjenværende mus fra hver gruppe ble avlivet på 1, 3, 7 og 14 dager.
Genes oppregulert ved Androgener i Human TZ xenografter
Tabell 1 viser de beste 45 gener som ble oppregulert i respons til androgen, sortert etter ganger endring (i synkende rekkefølge). De tre beste genene,
KLK3 plakater (PSA),
MSMB plakater (beta-microseminoprotein), og
TMEPAI plakater (trans prostata androgen-indusert protein) var alle tidligere godt kjent reguleres av androgener hos human prostata [31], [32], [33]. Flere andre gener identifisert som oppregulert på humane TZ xenotransplantater hos testosteron har også tidligere blitt vist å være regulert av androgener. Disse inkluderer
TRPM8 plakater (transient receptor potensielle melastatin medlem 8), en antatt prognostisk markør og terapeutisk mål i prostata kreft [34], [35],
ACPP plakater (prostata syre fosfatase) [36 ],
SCGB1A1 plakater (uteroglobin) [37],
NDRG1 product: (N-myc nedstrøms regulert gen 1) [38], og
CREB3L4 plakater (cAMP responsive element bindende protein 3-lignende 4) [39].
RNAseL
har blitt rapportert som en kandidat arvelig prostatakreft genet [40]. Andre gener identifisert som har blitt rapportert som androgen-regulert eller involvert i BPH eller prostatakreft inkludert
PTGDS plakater (prostaglandin D2 syntase),
FGFBP1 plakater (fibroblast vekstfaktor bindende protein 1),
KLK11 product: (kallikrein 11),
CXCL5 plakater (chemokine (CXC motiv) ligand 5),
FKBP11 plakater (FK506-bindende protein 11) og
TIMP1 product: ( vev hemmer av metalloproteinase 1).
TMEPAI plakater (trans prostata androgen-indusert protein) var den mest høyt uttrykt androgen-regulert gen identifisert. Ekstra sterkt uttrykt, androgen-regulerte gener inkludert
KLK3 plakater (PSA),
MSMB plakater (beta-microseminoprotein),
ACPP plakater (prostata syre fosfatase) og
SCGB1A1 product: (uteroglobin).
Genes oppregulert i Response til androgen tilbaketrekking
Tabell 2 lister de beste 45 gener som var oppregulert i respons til tilbaketrekking av androgen i 14 dager , sortert etter ganger endring (i synkende rekkefølge). En av de genene som er identifisert,
GLI1
er oppregulert i mus prostata etter kastrering [41]. Et annet gen identifisert med økt uttrykk var
ANNAT1 plakater (annexin 1), som har blitt rapportert å avta i androgen stimulerte prostatakreft sammenlignet med benign prostata epitel [42].
Kvantitativ RT -PCR analyse av Prostate RNA pools
for ytterligere å undersøke uttrykket nivåer av androgen regulert gener identifisert ved microarray analyse ble utført kvantitativ RT-PCR-analyse på utvalgte mål ved hjelp av RNA bassenger som stammer fra menneskelige prostata vev. En stor klinisk behov er å identifisere biomarkører som gir prognostisk informasjon om BPH progresjon eller som kan forutsi respons på behandling, inkludert 5 alfa reduktase hemmere. Utskilte proteiner som lett kan måles i blodet er spesielt attraktive kliniske mål. Fra genuttrykk profiler i hormon manipulert TZ xenografter, ble potensielle biomarkører systematisk valgt med overlappende bioinformatikk kriterier, syssels WebGestalt. Gene mål valgt var 1) androgen-regulert innenfor vår microarray data, 2) uttrykt ved betydelig høyere nivåer i prostata i forhold til andre vev, og 3) som er kjent eller anslått til å uttrykke utskilte eller celleoverflateproteiner. Disse kriteriene gitt et sett av kandidatgener (tabell 3) som inkluderte noen tidligere kjente biomarkører, inkludert
KLK3
,
ACPP
, og
MSMB
, ytterligere validering av vår eksperimentell tilnærming . Andre gener av interesse lagt til «manuelt» for RT-PCR-analyse var
IGF1
,
IGF1R
,
TGFB1
,
TGFB3
,
TGFBR1
, og
TGFBR2
. Uttrykket nivåer av disse målgener ble målt i RNA bassenger fremstilt fra TZ vev som er utpekt til å ha mild, moderat og alvorlig BPH forandringer, samt moderat og dårlig differensiert prostatakreft. RNA for hver kategori av BPH eller prostata kreft vev ble samlet fra 5-10 pasientprøver. Kontroll RNA ble samlet fra TZ prøver fra pasienter uten noen nevneverdig TZ ekspansjon fra kjertel og stromal hyperplasi.
Resultatene av QRT-PCR-analyser er vist i tabell 4. RNA-ekspresjonsnivåer ble bestemt for 86 kandidaten biomarkør gener. Av disse 72 gener ble bestemt til å ha en større enn 6 ganger høyere nivå enn det normale styrings bassenget i det minste en av de BPH eller prostatakreft bassenger. I forhold til kontroll prostata RNA basseng, gjennomsnittsnivåene i BPH eller prostata kreft RNA bassenger med uttrykk nivåer ble en ganger utpekt som «lav», 1 til 6 ganger ble utpekt som «moderat», og 6 ganger ble betegnet som «høy». Basert på disse kriteriene, ble hvert gen tilordnet en av seks kategorier (tabell 4). Femten gener var høy i begge BPH og prostatakreft, 41 gener var høy i BPH og moderat i prostatakreft, to gener var høy i BPH og lavt i prostatakreft, og fem gener var moderat i BPH og høy i prostatakreft. Ingen gener ble funnet som var klassifisert som «lavt» i BPH.
Kandidat BPH biomarkør Gener
En rekke gener hadde uttrykk nivåer i BPH bassenger som økte med alvorlighetsgraden av sykdommen . Noen av genene hadde uttrykk nivåer som var spesielt forhøyet i BPH, men relativt lavere i prostatakreft bassenger. Disse genene kan forventes å ha de beste mulighetene som kandidat BPH biomarkører, inkludert spesifisitet i forhold til prostata kreft. De uttrykte ekstracellulært og med en gjennomsnittlig uttrykk nivå på minst tre ganger større i BPH RNA bassenger enn i prostatakreft RNA bassenger inkludert:
CDH13
,
CHRNB1
,
COL4A5
,
EFEMP2
,
EMP3
,
F10 plakater (16 ganger),
FGF2
,
FGFBP1 plakater (10 ganger ),
IGF1
,
IGF2 plakater (18 ganger),
LIPG
,
R R
,
SGCA
,
SGCD
,
TGFB1
,
TGFB3 plakater (14 ganger),
TGFBR2 Hotell og
TIMP2
av «høy i BPH, moderat prostatakreft «gruppe;
SMOC1 plakater (26 ganger) i «høy i BPH, lite prostatakreft» gruppe; og
SCGB3A1 plakater (15 ganger) og
SCGB1A1 plakater (14 ganger) i «moderate i BPH, lite prostatakreft» gruppe.
immunhistokjemisk farging for Select Gene Targets i patologi-Preget BPH vev
for å finne ut om forskjellene i RNA uttrykk nivåer observert i BPH vev var også til stede på proteinnivå og for ytterligere å karakterisere epitel og /eller stromal lokalisering av potensiell økt uttrykk utførte vi immunhistokjemi (IHC) på en BPH vev microarray (TMA). Matrisen inneholdt 129 vevssnitt fra 43 unike pasienter, inneholdende BPH-vev med patologi som strekker seg fra minimal til alvorlig som definert i Materialer og Metoder.
