Abstract
Nylig histondeacetylase (HDAC) hemmere har dukket opp som en lovende klasse av legemidler for behandling av kreft, spesielt subkutan T-celle lymfom. I denne studien har vi vist at MPT0E028, en roman
N
-hydroxyacrylamide-avledet HDAC hemmer, hemmet human kolorektal kreft HCT116 cellevekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Resultatene av NCI-60 screening viste at MPT0E028 inhiberte proliferasjon i både faste og hematologiske tumorcellelinjer ved mikromolare konsentrasjoner, og var spesielt potente i HCT116-celler. MPT0E028 hadde en sterkere apoptotisk aktivitet og hemmet HDACs aktivitet mer potent enn Saha, den første terapeutiske HDAC hemmer bevist av FDA.
In vivo
murin modell, veksten av HCT116 tumor xenograft ble forsinket, og hemmet etter behandling med MPT0E028 på en doseavhengig måte. Basert på
in vivo
studie, MPT0E028 viste sterkere anti-kreft effekt enn Saha. Det ble ikke observert noen signifikant kroppsvekt forskjell eller andre negative effekter på både MPT0E028-og Saha-behandlede grupper. Til sammen våre resultater viser at MPT0E028 har flere egenskaper og er potensial som en lovende anti-kreft terapeutisk legemiddel
Citation. Huang HL, Lee HY, Tsai AC, Peng CY, Lai MJ, Wang JC, et al. (2012) Anticancer Aktivitet av MPT0E028, en Novel Potent histondeacetylase Sperre, i Human tykktarmskreft HCT116 Cells
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 7 (8): e43645. doi: 10,1371 /journal.pone.0043645
Redaktør: Manfred Jung, Albert-Ludwigs-universitetet i Tyskland
mottatt: 20 mars 2012; Godkjent: 24 juli 2012; Publisert: 22 august 2012
Copyright: © Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble støttet av et stipend fra National Science Council of Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
histondeacetylase hemmere (HDACi) er en lovende ny klasse av cytostatika. HDACi hemme tumorprogresjon gjennom deres evne til å regulere genekspresjon ved å fremme acetylering av histon og ikke-histonproteinene [1], [2]. Foreløpig flere HDACi, inkludert Saha LBH589, PXD101, MS-275, og FK228, blir undersøkt i kliniske studier for sin evne til å behandle ulike faste og hematologiske maligniteter [3], [4]. USA Food and Drug Administration (FDA) har nylig godkjent Saha og FK228 for behandling av kutant T-cellelymfom [5]. HDAC-inhibitorer (HDACi) modulerer ekspresjonen av flere gener som regulerer apoptose, angiogenese [6], [7], cellesyklusprogresjon, og cellulær differensiering. De har minimal giftighet mot normale celler [8] – [10]. Samlet utgjør disse funnene er avgjørende i å utforme mål hemmere av HDAC for behandling av kreft og andre sykdommer.
Et nærbilde av disse kliniske studier med lite molekyl HDACi indikert hydroxaminsyren eller
N
-hydroxyacrylamide gruppe spiller en viktig rolle i HDAC aktivitet [11], [12]. Vi har tidligere rapportert identifisering av indolinderivater-1-sulfonamid-inneholdende forbindelser med tydelig anticancer aktivitet [13], [14]. På grunnlag av de ovenstående observasjoner, har vi designet og syntetisert en rekke nye klasse av histondeacetylase inhibitorer. Blant dem, 3- (1-benzensulfonyl-2,3-dihydro-1 H-indol-5-yl) –
N
-hydroksy-akrylamid (MPT0E028) har den beste inhibitorisk aktivitet av HDACs. I denne studien undersøkte vi de antitumor-aktivitet av MPT0E028 i flere kreftcellelinjer fra NCI-60 kreftcelle panel. Vi undersøkte effekten av MPT0E028 på cellesyklusprogresjon og apoptose og utforsket mulige molekylære mekanismer som ligger bak dens anticancer aktivitet. I tillegg, undersøkte vi effekten av MPT0E028 på veksten av human kolorektal kreft HCT116-celler
in vivo
, ved hjelp av en tumor xenograft modell, som bekreftet at antitumoreffekt av MPT0E028. Våre resultater tyder på at MPT0E028 er et lovende terapeutisk kandidat for behandling av kreft hos mennesker.
(a) NaBH
3CN, AcOH, 0 ° C-r.t .; (B) (i) benzensulfonylklorid, pyridin, refluks; (Ii) LiAlH
4, THF, 0 ° C-r.t .; (Iii) pyridiniumdikromat (PDC), molekylsikter, CH
2 Cl
2, r.t .; (C) (i) metyl- (triphenylphosphorylidene) acetat, CH
2 Cl
2, r.t .; (Ii) 1 M LiOH
(aq), dioksan, 40 ° C; (D) (i) NH
2OTHP, PyBOP, Et
3N, DMF, romtemperatur .; (Iii) trifluoreddiksyre, CH
3OH, r.t. Forkortelser: NaBH
3CN, natriumcyanoborhydrid; AcOH, acetyl syre; LiAlH
4 (LAH), litiumaluminiumhydrid; THF, tetrahydrofuran; PDC, pyridiniumdikromat; NH
2OTHP,
O
– (tetrahydro-2H-pyran-2-yl) hydroksylamin; PyBOP, benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium heksafluorfosfat; Et
3N, trietylamin; DMF, dimetylformamid; TFA, trifluoreddiksyre.
Materialer og metoder
Material
MPT0E028 og Saha ble syntetisert av Dr. Jing-Ping Leo Lab. (School of Pharmacy, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taiwan), og renhet er mer enn 98% (Data S1). RPMI 1640, M199, føtalt bovint serum (FBS), penicillin, streptomycin, og alle andre vev kultur reagenser ble erholdt fra Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Antistoffer mot forskjellige proteiner ble oppført som følger: a-tubulin, PARP, actin, HRP-konjugert anti-mus og anti-kanin-IgG var fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA); histone 3, aktin, acetyl-μ-tubulin var fra cellesignalisering var fra cellesignalisering Technologies (Boston, MA, USA); caspase 3 var fra IMGENEX (San Diego, California, USA); acetyl-histon tre var fra Upstate Bioteknologi (Lake Placid, NY, USA). Propidiumjodid (PI), sulforhodamin B (SRB), og alle de andre kjemiske midler ble innhentet fra Sigma Chemical (St. Louis, Missouri, USA).
Cell Culture
Den humane tykktarmskreftcellelinje HCT116, brystcancer cellelinje MDAMB231 og humane navlestrengvene endotelialceller (HUVEC) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Eggstokkreft cellelinje NCI-ADR ble innhentet fra DTP humane tumorcellelinje Screen (Developmental Therapeutics Program, NCI). HCT116, MDAMB231 og NCI-ADR-celler ble dyrket i RPMI 1640 med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (v /v) og penicillin (100 enheter /ml) /streptomycin (100 ug /ml). HUVEC ble dyrket i M199 med 20% varme-inaktivert føtalt bovint serum (v /v) og penicillin (100 enheter /ml) /streptomycin (100 ug /ml). Alle celler ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 5% CO
2/95% luft.
(A) konsentrasjonsavhengig effekt av MPT0E028 og Saha på cellevekst. HCT116-celler ble inkubert med eller uten de indikerte konsentrasjoner av MPT0E028 eller Saha i 48 timer. Cellevekst ble bestemt ved SRB-analysen. Data ble uttrykt som middelverdier ± S.E.M.. på minst 3 uavhengige eksperimenter. (B) konsentrasjonsavhengig effekt av MPT0E028 og Saha på cellesyklusprogresjon. HCT116-celler behandlet med eller uten de indikerte konsentrasjoner av MPT0E028 eller Saha i 24 timer og ble analysert ved strømningscytometri for cellesyklusfordeling. (C, D) Viste data er de hjelp av minst 3 uavhengige eksperimenter. (E) tidsavhengige effekter av MPT0E028 og Saha på subG1 befolkningen. HCT116 cellene behandlet uten eller med 1 uM MPT0E028 eller Saha for det angitte tidsintervall, og ble analysert ved strømningscytometri for subG1 befolkning. (F) MPT0E028 induseres-kaspase 3 og PARP-aktivering. HCT116 cellene behandlet uten eller med den indikerte konsentrasjon av MPT0E028 eller Saha i 24 timer utsatt for western blot for caspase 3 og PARP analyse. (G) MPT0E028 indusert casepase-avhengig celle-apoptose. HCT116 cellene behandlet uten eller med 3 uM MPTE028, Saha eller 20 pM Z-VAD-FMK i 24 timer og utsatt for Western blot for caspase 3 og PARP-analyse.
NCI-60 Cellelinjer Screening
NCI-60 kreftcellelinjer screening ble utført av Therapeutics Program (DTP NCI sin Developmental; https://www.dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html).
Sulforhodamin B-analysen
HCT116, MDAMB231 og NCI-ADR-celler ble sådd ut i 96-brønners plater i medium med 5% føtalt bovint serum over natten. Celler ble fiksert med 10% triklor representerer cellepopulasjon ved tidspunktet for behandling (
T
0). Etter inkubasjon med bærer (0,1% DMSO), MPT0E028 eller Saha i 48 timer ble cellene fiksert med 10% trikloreddiksyre og deretter beiset med sulforhodamin B på 0,4% (vekt /volum) i 1% eddiksyre. Overskudd av Sulforhodamin B ble vasket bort med 1% eddiksyre og fargestoff-inneholdende celler ble lysert med 10 mmol /l Trizma basen. Absorbansen ble avlest etter bølgelengde på 515 nm. Ved å måle tid null (
T
0), kontroll vekst (
C
), og cellevekst i nærvær av stoffet (
T
x
), ble den prosentvise vekst beregnet. Prosentvis vekst hemming ble beregnet som 100 – [(
T
x Anmeldelser –
T
0) /(
C Anmeldelser –
T
0)] × 100. Veksthemming på 50% (GI
50) bestemmes ved legemiddelkonsentrasjonen som gir 50% reduksjon av total protein økning i kontrollceller i løpet av sammensatte inkubasjon.
Crystal Violet analysen
HUVECs ble sådd på 96-brønners kulturplater (5000 celler /brønn) i fire eksemplarer. Etter 24 timers inkubering ble cellene fiksert med 0,1% krystallfiolett /20% metanol, noe som representerer cellepopulasjon ved tidspunktet for behandling (
T
0). Andre celler ble behandlet med MPT0E028 eller Saha i 48 timer. Etter 48 timers inkubering ved 37 ° C, ble cellene farget med 0,1% krystallfiolett /20% metanol i 10 minutter og vasket 3 ganger. Da fargestoffet ble eluert ved 0,1 M natrium-citrat /75% etanol, og absorbansen måles ved 550 nm.
(A) Inhibering av HDACs aktivitet i HeLa-nukleære ekstrakter. Data ble uttrykt som gjennomsnittet av minst 3 uavhengige eksperimenter. (B) Hemming av total HDAC aktivitet ved MPT0E028 og Saha. HCT116-celler behandlet med de angitte konsentrasjoner av MPT0E028 og Saha i 24 timer, og de nukleære proteiner ble isolert for å bestemme inhibering av total HDAC enzymaktivitet. Data er uttrykt som middelverdier ± S.E.M.. av minst 3 uavhengige eksperimenter.
FACScan flowcytometrisystemer
Etter behandlingen av kjøretøy (0,1% DMSO), MPT0E028 eller Saha for de angitte tidsforløp, cellene ble høstet ved trypsinering, fiksert med 75% (v /v) alkohol ved 4 ° C over natten. Etter sentrifugering ble cellene inkubert i 0,1 mol /l fosfat-sitronsyrebuffer [0,2 mol /l NaHPO
4, 0,1 mol /l sitronsyre (pH 7,8)] i 20 minutter ved romtemperatur. Deretter ble cellene sentrifugert og resuspendert med 0,5 ml PI-løsning inneholdende Triton X-100 (0,1%, v /v), RNase (100 ug /ml), og PI (80 ug /ml). DNA-innholdet ble analysert med FACScan og Cellquest-programvare (Becton Dickinson).
(A) HCT116-celler behandlet med MPT0E028 og Saha i 24 timer ved de angitte konsentrasjoner. Cellelysater ble fremstilt og underkastet SDS-PAGE og immunblotting ved bruk av acetyl-histon H3, histon H3, acetyl-α-tubulin, og tubulin-a-antistoffer. Kvantitativ analyse av western blot med Imagequant (Molecular Dynamics, USA); acetyl-histon H3 (B) og acetyl α-tubulin (C) ble analysert i HCT116 cellene.
HDAC biokjemiske analyser
HDACs
in vitro
aktiviteter av rekombinant humant HDAC 1, 2, 4, 6 og 8 (BPS Biosciences) ble påvist ved fluorigenic frigjøring av 7-amino-4-metylkumarin fra substratet ved deacetylase-enzymatisk aktivitet. Halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) bestemmes ved legemiddelkonsentrasjonen som gir 50% reduksjon av HDAC aktivitetsøkning i kontrollbrønner i løpet av sammensatte inkubasjon.
Alle svulster vokste til 1200 mm
3 endepunkt volum. (A) Svulster ble målt regelmessig og vekstforsinkelse ble beregnet for behandlingsgruppene i forhold til å kontrollere svulster (TGD). (B) Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse var basert på tumorvekst endepunkt. (C) Inhibering av tumorvekstkurver representerte en gjennomsnittlig ± SEM og prosentvis endring i gjennomsnittlig tumorvolum (prosent TGI). (D) Kroppsvekten ble målt daglig i løpet av den første uken og deretter 2 ganger per uke. Den kroppsvekt-forholdet ble beregnet i forhold til grunnlinjen måling. (E)
In vivo
effekten av MPT0E028 på uttrykk for caspase 3, PARP, acetyl-histon H3 og acetyl-μ-tubulin i HCT116 xenografttumorer som bestemmes av western blotting.
HeLa Nuclear Extract HDAC aktivitetsanalyse
HeLa kjerneekstrakt HDAC aktivitet ble målt ved hjelp av HDAC Fluorescent Activity Assay Kit (BioVision, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner [15]. Kort sagt ble den HDAC fluorometriske substrat og analysebuffer tilsatt til HeLa-nukleære ekstrakter i et 96-brønners format og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av lysin utvikler, og blandingen ble inkubert i ytterligere 30 minutter ved 37 ° C. Ytterligere negative kontroller inkludert inkubering uten atom ekstrakt, uten substratet, eller uten begge deler. TSA 1 uM tjente som positiv kontroll. En fluorescens plateleser med eksitasjon ved 355 nm og emisjon ved 460 nm ble anvendt for å kvantifisere HDAC aktivitet. Halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) bestemmes ved legemiddelkonsentrasjonen som gir 50% reduksjon av HeLa HDAC aktivitetsøkning i kontrollgruppen i løpet av sammensatte inkubasjon.
Total HDACs enzymatisk aktivitet analyse
Totalt HDACs enzymaktiviteten ble bestemt ved bruk av Boc-Lys (Ap) -AMC fluorometrisk HDAC aktivitetsanalyse kit (BioVision, Mountain View, CA, USA). HCT116-celler behandlet med MPT0E028 og Saha i 24 timer. Cellene ble deretter samlet og totale cellelysatene ble analysert ved anvendelse av en Fluorometrisk HDAC Activity Assay Kit (k330-100; BioVision). En fluorescens plateleser med eksitasjon ved 355 nm og emisjon ved 460 nm ble anvendt for å kvantifisere HDAC aktivitet. Halvparten av maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) bestemmes ved legemiddelkonsentrasjonen som gir 50% reduksjon av total HDAC aktivitetsøkning i kontrollgruppen.
Western Blot analyse
Etter behandlingen av bærer (0,1% DMSO), MPT0E028 eller Saha ved indikerte konsentrasjoner ble cellene vasket med kald PBS. For total lysat ble celler lysert med 120 ul iskald lyseringsbuffer [10 mmol /L Tris-HCl (pH 7,4), 150 mmol /l NaCl, 1 mmol /liter EGTA, 1 mmol /l fenylmetylsulfonylfluorid, 10 ug /ml aprotinin, 10 ug /mL leupeptin, 1 mM natrium orthovandate, 1 mM NaF og 1% Triton X-100]. Cellelysatene ble sentrifugert ved 13000 rpm i 30 min. For Western blot-analyse, ble mengden av protein (40 ug) separert ved elektroforese på en 10% eller 15% polyakrylamidgel og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran. Etter 1 time inkubering ved romtemperatur i PBS /5% fettfri melk, ble membranen vasket med PBS /0,1% og inkubert med de angitte antistoffer ved 4 ° C over natten. Etter vaskinger med PBS /0,1% Tween 20, ble de tilsvarende sekundære antistoffer anvendes på membraner i 1 time ved romtemperatur. Membranene ble deretter vasket med PBS /0,1% Tween 20, og påvisning av signal ble utført med en forbedret kjemiluminescens deteksjon kit (Amersham, Buckinghamshire, UK).
In vivo
Implantasjon og Tumor vekst
De humane HCT116 kolorektal adenokarsinom celler som anvendes for implantering ble høstet ved logaritmisk fase vekst og resuspendert i fosfatbufret saltoppløsning ved 5 x 10
7 celler /ml. Hver mus ble injisert subkutant i høyre flanke med 1,0 × 10
7 celler (0,2 ml cellesuspensjon). Svulster ble overvåket to ganger ukentlig, og deretter daglig som deres volumer nærmet 1.200 mm
3. Tumorstørrelse, mm
3, ble beregnet fra: der
w =
bredde og
l =
lengde i mm av svulsten. Tumor volum = (
w
2
×
l
) /2. Alle dyreforsøk fulgt etiske standarder og protokoller er gjennomgått og godkjent av Animal bruk og Management Committee for National Taiwan University (IACUC godkjenning No: 20100225)
Mus
Dame nude-atymiske mus. var 8 uker gamle og hadde en kroppsvekt (BW) området 17,2 til 22,0 g, på D1 av studien. Dyrene ble fôret ad libitum vann (omvendt osmose, 1 ppm Cl) og PicoLab gnager Diet 20 Modified og bestrålt Lab Diet® består av 20,0% råprotein, 9,9% råfett, og 4,7% fiber. Musene ble plassert på National Taiwan University Laboratory Animal Center, NTUMC, på en 12-timers lys syklus på 21-23 ° C og 60-85% luftfuktighet.
statistiske og grafiske analyser
den logrank test ble anvendt for å bestemme den statistiske signifikans av forskjellen mellom de TTE verdier av to grupper, med unntak av eventuelle NTR dødsfall. Statistiske og grafiske analysene ble utført med Prism 3.03 (GraphPad) for Windows. De to-tailed statistiske analyser ble utført ved
P
= 0,05. Kaplan-Meier plot viser prosentandelen av dyr som er igjen i studien som funksjon av tiden. Kaplan-Meier-plott bruker de samme datasettet som logrank test.
tumorvekst Kurvene viser gruppen median tumorvolumet, på en logg skala som en funksjon av tiden. Når et dyr kommer ut av studien på grunn av tumorstørrelse eller TR død, er den endelige tumorvolumet registrert for dyr som følger med dataene som brukes til å beregne median ved senere tidspunkt. Derfor kan den endelige midlere tumorvolum er vist ved kurven være forskjellig fra MTV, som er det midlere tumorvolum for mus igjen i studien på den siste dag (med unntak av alt med svulster som har nådd endepunktet). Hvis det oppstår mer enn ett TR død i en gruppe, blir de tumorvekstkurver avkortet ved tidspunktet for den siste måling som går forut for den andre TR død. Tumorvekstkurver er også avkortet når tumorene hos mer enn 50% av assessable dyrene i en gruppe har vokst til endepunktet volum. (*
p
0,05; **
p
0,01; ***
p
0,001; sammenlignet med de respektive kontrollgruppen).
In vitro
Statistical Analysis
data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av angitt antall for egne eksperimenter. Statistisk analyse av data ble utført med enveis ANOVA etterfulgt av
t
test, og
p
0,05 ble betraktet som signifikant. (*
p
0,05; **
p
0,01; ***
p
0,001; sammenlignet med de respektive kontrollgruppen).
Resultatene
syntese av MPT0E028
syntese av MPT0E028 (1) er vist i figur 1. Kommersielt tilgjengelig metylindol-5-karboksylat (2) ble omsatt med natriumcyanoborhydrid i nærvær av eddiksyre ga metyl- indolin-5-karboksylat (3) i 93% utbytte.
N
1-sulfonylering av indolin (3) med benzensulfonylklorid i pyridin og deretter LiAlH
4-mediert C5-ester reduksjon, etterfulgt av PDC-oksidasjonen gitt de ønskede 1-benzenesulfonylindoline-5-karbaldehyd (4) i 42% utbytte (3 trinn). Wittig-reaksjon av metyl (trifenylfosforanyliden) acetat med den indolin-5-karboksyaldehyd 4T og behandling av litiumhydroksyd (LiOH) i MeOH ga kanelsyre (5) i 73% utbytte. Omdannelsen av karboksylsyre (5) til den hydroksamsyre (1) ble oppnådd i 72% utbytte ved behandling av NH
2OTHP i nærvær av PyBOP og Et
3N, etterfulgt av trifluoreddiksyre-mediert avblokkering. Den detaljerte eksperimentelle informasjon for utarbeidelse av MPT0E028 er tilgjengelig i supplerende delen.
Effekten av MPT0E028 på spredning av kreft cellelinjer
For å avgjøre om MPT0E028 viser anti-kreft i menneskelig kreft celler, testet vi den anti-proliferative aktivitet av MTP0E028 hjelp av NCI-60 cancercellelinjer screening panel [16]. Som vist i tabell 1, MPT0E028 signifikant hemmet celleproliferasjon i alle humane kreftcellelinjer som ble undersøkt ved mikromolare konsentrasjoner, men var særlig kraftig i HCT116-cellelinjen. Derfor valgte vi HCT116 cellene for videre studier av anti-kreft aktivitet av MPT0E028
in vitro Hotell og
in vivo
.
MPT0E028 Betydelig Induced HCT116 Cell apoptose
for det første viste vi at MPT0E028 hemmer veksten av HCT116-celler på en konsentrasjonsavhengig måte ved hjelp av SRB-analysen (GI
50 = 0,09 ± 0,004 uM) (figur 2A). To andre cellelinjer, MDA-MB-231 og NCI-ADR fra NCI-60 screening panel, ble også valgt å analysere følsomheten av MPT0E028 (MDAMB231, GI
50 = 0,19 ± 0,04 uM, NCI-ADR, GI
50 = 0,14 ± 0,02 mm). MPT0E028 også hemmet celleproliferasjon i betydelig grad i disse to cellelinjer (data S2A, S2B), men viste mindre følsom enn HCT116. Vi har også bestemt sikkerhetsmargin på MPT0E028 i humane normale celler (f.eks HUVEC) og funnet ut at MPT0E028 viser 20-40 kaster mindre følsom mot normale celler (GI
50 = 3,57 ± 0,45 mm), noe som tyder MPT0E028 særlig rettet mot ondartede kreftceller (data S2C). For å undersøke effekten av MPT0E028 på cellesyklusutvikling, ble cellulært DNA-innhold målt ved strømningscytometri. Vi viste at behandling med MPT0E028 øket antall celler i sub-G1-fasen av cellesyklus (figur 2B og 2C). Referanseforbindelsen var et HDACi, suberoylanilide hydroksamsyre (Saha, vorinostat), med en GI
50 0,82 ± 0,07 uM, som oppviste antiproliferativ aktivitet (figur 2A) og induserte apoptose i HCT116-celler (figur 2B og 2D) i en konsentrasjonsavhengig måte, men var mindre effektive i forhold til MPT0E028. Som vist i figur 2E, MPT0E028 også induserte sub-G1 populasjon på en tidsavhengig måte, mens Saha viste svakere effekt og forsinket cytotoksisitet. MPT0E028 også indusert kaspase 3 og PARP-aktivering i en konsentrasjonsavhengig måte (figur 2F). MPT0E028-indusert apoptose ble avskaffet da cotreatment med caspase-hemmer z-VAD-FMK, noe som tyder på at MPT0E028 indusert apoptose gjennom caspase-avhengige veien. Disse resultatene antydet at MPT0E028 indusert HCT116 cellene cytotoksisitet gjennom apoptose veien.
MPT0E028 er en hemmer av HDACs aktivitet
Vi neste undersøkt effekten av MPT0E028 på aktiviteten av HDACs, ved hjelp av et panel av humane rekombinante proteiner HDAC, og sammenlignet dens aktivitet til Saha. Som vist i tabell 2, MPT0E028 inhiberte signifikant HDAC1 og HDAC2 fra klasse I, så vel som HDAC6 fra klasse IIb ved lave nanomolare konsentrasjoner. Mens MPT0E028 var mer potent enn Saha mot rekombinant HDAC1 og 2, har det liten aktivitet mot rekombinant HDAC4 og HDAC8, som er lik den hemmende mønster av Saha. Vi bekreftet at MPT0E028 hemmet atom HDAC aktivitet i livmorhalsen adenokarsinom cellelinje HeLa (IC
50 = 11,1 ± 2,8 nM) og i HCT116-celler (IC
50 = 4,43 ± 0,5 mm), som var ca 9-30 ganger mer potente enn Saha (IC
50 = 118,8 ± 13,2 nM og 129,4 ± 13,9 uM, henholdsvis) (figur 3A og 3B). Den potente HDACs inhiberende virkning av MPT0E028 kunne også observeres i MDAMB231 og NCI-ADR celler (data S3). Disse resultatene antydet at MPT0E028 er en roman og potent HDAC hemmer.
Effekter av MPT0E028 på α-tubulin og Histone H3 acetvlering i HCT116 Cells
Fordi α-tubulin og histon H3 er vanlige nedstrøms mål av HDACs, undersøkte vi effekten av MPT0E028 på α-tubulin og histon H3-acetylering i HCT116-celler ved hjelp av western blot-analyse. Som vist i figur 4, MPT0E028 indusert sterkere hyperacetylation av histon H3 enn den til Saha (figur 4A og 4B), som er forenlig med dens sterk hemmende virkning på klasse I HDAC1 og 2. I motsetning til dette, Saha oppviste mer potent α-tubulin acetylering enn MPT0E028 (figur 4A og 4C), noe som tyder på at Saha er mer potent mot klasse IIb HDAC6, som er konsistent med våre funn i tabell 2.
MPT0E028 hemmer veksten av menneskelig Colon Cancer xenografter
in vivo
til slutt vurderte vi effektiviteten av MPT0E028 og Saha ved hjelp av
in vivo
svulst HCT116 xenografter i en naken mus modell (figur 5A og 5B) (tabell 3). Når en svulst ble følbar med den størrelse på ca 55 mm
3, ble mus randomisert inn i kjøretøyet kontroll- og behandlingsgrupper (8 mus pr gruppe). Kontrollmus mottok bærer (0,5% karboksymetylcellulose + 0,1% Tween 80). Svulster i alle 3 gruppene fikk lov til å nå et endepunkt volum på 1200 mm
3. Median tid til endepunkt (TTE) for kontrollmusene var 16,6 dager. I mus som ble behandlet oralt med Saha (200 mg /kg, daglig), økte TTE til 27,0 dager, noe som tilsvarer en T-C på 10,0 dager, og en prosent tumorvekstforsinkelse (TGD) på 63%. I henhold til logrank analyse, Saha produserte signifikant antitumoraktivitet (
P
= 0,0251). Oral behandling med MPT0E028 (200, 100, og 50 mg /kg, daglig) økte median TTE til 36,9, 19,2 og 15,5 dager, henholdsvis svarende til en TC på 20, 2,6 og 0 dager og en prosent TGD av 122 %, 16% og 0%, respektivt. Basert på den logrank analyse, oppviser MPT0E028 signifikant antitumoraktivitet på 200 mg /kg (
P
= 0,0031). Spesielt, 3 mus i en gruppe som ble behandlet med 200 mg /kg MPT0E028 og en mus i en annen gruppe som ble behandlet med 100 mg /kg MPT0E028 viste fullstendig tumorregresjon etter behandling (tabell 3). I tillegg ble musene også dosert en gang om dagen i 15 dager via oral administrering for å vurdere tumorveksthemning etter MPT0E028 behandling. har vi funnet at veksten av HCT116 kreftceller xenotransplantater ble undertrykket med 73,5%, 32,0% og 21,9% (prosent tumorvekst inhibering [TGI] verdier) etter behandling med MPT0E028 ved 200, 100, og 50 mg /kg, henholdsvis, mens Saha ved 200 mg /kg undertrykket tumorvekst med 47,7% (% TGI) (figur 5C). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i kroppsvekt eller andre ugunstige effekter ved behandling med MPT0E028 (figur 5D). Vi har også bestemt effekten av MPT0E028 på uttrykk for caspase3, PARP, acetyl-histon H3 og acetyl-μ-tubulin
in vivo
i HCT116 xenograft tumor vev. Mus ble behandlet med 200 mg /kg MPT0E028 eller Saha i 7 dager (oralt, daglig) og deretter tumorer ble forsiktig fjernet og utsatt for Western blot-analyse. Som vist i figur 5E, caspase 3, ble PARP og acetyl-histon H3 vesentlig indusert i MPT0E028-behandlede gruppen mens acetyl-μ-tubulin ble funnet mer dypt i Saha-behandlede gruppen, som er konsistent med våre funn
in vitro
. Til sammen MPT0E028 induserte en doseavhengig forsinkelse og hemming av tumorvekst og vises sterkere anti-tumor aktivitet
in vivo
enn Saha.
Diskusjoner
HDACs er viktige mål for kreftterapi på grunn av deres evne til å transkripsjonelt regulere ekspresjonen av gener som er involvert i celle-proliferasjon, differensiering og apoptose [17], [18]. HDACi er for tiden i kliniske studier for behandling av solide svulster og leukemi pasienter. To HDACi, Saha og FK228, har fått det amerikanske FDA-godkjenning for behandling av pasienter med kutant T-cellelymfom. I denne studien, rapporterer vi syntese av en ny kjemisk forbindelse 3- (1-benzensulfonyl-2,3-dihydro-1 H-indol-5-yl) –
N
-hydroksy-akrylamid (MPT0E028), som har en potent HDACi aktivitet. MPT0E028 er designet basert på vår tidligere forskning med mikrotubulidynamikk destabiliserende agenter bruker indolinderivater-1-arylsulfonamider som en kjerne struktur [13], [14]. Etter kobling av et
N
-hydroxyacrylamide funksjonell gruppe i 5-stillingen i ringen indolin, ga vi den ønskede MPT0E028.
Videre har vi undersøkt anti-kreft-aktivitet av MPT0E028 i
n vitro Hotell og
in vivo
. Vi fant ut at MPT0E028 indusert cytotoksisitet i en rekke humane kreftcellelinjer fra NCI-60 paneler og utført mekanistiske studier i HCT116-celler, som viste høy følsomhet for MPT0E028. Sammenlignet med Saha, behandling med MPT0E028 indusert sterkere hemming av kreftcelle (GI
50 = 0,82 ± 0,07 uM og 0,09 ± 0,004 uM, henholdsvis), men ikke normal cellevekst (GI
50 = 3,57 ± 0,45 uM) og produserte et signifikant høyere antall sub-G1 (apoptotiske) celler som bestemt ved strømningscytometri. Også MPT0E028 indusert mer dypt caspase 3 og PARP aktivering. Til sammen hemmer MPT0E028 kreftceller vekst og induserer apoptotisk celle-død.
Vi viste at MPT0E028 hemmer aktiviteten til HDAC1, HDAC2 og HDAC8 i klasse I, samt HDAC6 i klasse IIb, men ikke HDAC4 i klassen Ila, og konsekvent induserer acetylering av histon H3 og α-tubulin. Klasse I HDACs har vist seg å være overuttrykt i humane kolorektale cancerceller [19], som kan bidra til perturbert kreftcellevekst, differensiering og apoptose ved begge epigenetisk eller ikke-epigenetisk modifikasjon [20], [21]. Inhibering av HDAC aktivitet indusert den indre og ytre apoptotisk reaksjonsvei, som fører til kreft celledød [22], [23]. I tillegg kunne HDACi indusere ekspresjon av p21 ved å stabilisere og indusering av transkripsjonen aktivitet av RUNX3, noe som fører til induksjon av kreft celle apoptose [24], [25]. Inhiberingen av HDAC-aktivitet ved MPT0E028 var 10-30 ganger sterkere enn det av Saha i HeLa og HCT116-celler.
Til slutt, undersøkte vi effektiviteten av MPT0E028 mot den humane HCT116 kolorektal adenokarsinom-cellevekst i mus. Median tumorvekst og Kaplan-Meier kurve analyse viste sterk antitumor aktivitet av MPT0E028. Daglig administrasjon av MPT0E028 resulterte i signifikant antitumoraktivitet. Videre, sammenlignet med Saha, viste MPT0E028 sterkere antitumoraktivitet. Basert på disse resultatene, er MPT0E028 en roman syntetisk HDACi med unike farmakologiske egenskaper som skal testes i human kolorektal kreft terapi.
I sammendraget, vi har identifisert en ny hemmer av HDAC aktivitet, MPT0E028, med antitumor aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo
. Resultatene som presenteres her viser at MPT0E028 hemmer HDACs aktivitet og har antitumor egenskaper som er mer potent enn Saha, som nå er i klinisk bruk i subkutan T-celle lymfom. Dermed er MPT0E028 egnet for videre testing som en roman anti-kreft agent.
Hjelpemiddel Informasjon
data S1.
kjemi. Kjernemagnetisk resonans (
1H-NMR) spektra ble oppnådd med Bruker DRX-500 spektrometer (drevet ved 500 MHz), med kjemisk skift i parts per million (ppm,
δ
) nedfelts fra TMS som intern standard. Høy-oppløsningsmassespektra (HRMS) ble målt med et JEOL (JMS-700), elektronstøt (EI) massespektrometer.
