Abstract
AZD6244 og MK2206 er målrettet små molekyl narkotika som hemme MEK og AKT hhv. Effekten av denne kombinasjon i lungekreft er ukjent. Vårt tidligere arbeid viste viktigheten av aktivert AKT ved formidling av motstanden av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) til AZD6244. Dermed har vi en hypotese om at dual hemming av både nedstrøms MEK og AKT trasé ville indusere synergistisk antitumor aktivitet. I denne studien evaluerte vi virkningen av AZD6244 og MK2206 individuelt på et stort panel av lungekreft cellelinjer. Deretter, behandlet vi 28 humane lungekreft-cellelinjene med en kombinasjon av AZD6244 og MK2206 ved klinisk anvendelig legemiddel molare forhold. Den AZD6244-MK2206 kombinasjonsbehandling resulterte i en synergistisk effekt på inhiberingen av lungecancer cellevekst sammenlignet med resultatene fra enkeltmedikamentbehandling alene. MK2206 forbedret AZD6244-indusert Bim overekspresjon og apoptose i A549 og H157 celler. Når vi testet kombinasjonen av AZD6244 og MK2206 på prosenter av 08:01, 04:01, 02:01 og 01:08, har vi funnet at synergistisk effekt av kombinasjonsbehandling var forholdet avhengig. I forhold på 08:01, 04:01, og 02:01, medikamentkombinasjonen konsekvent vist synergi, mens redusere forholdet til 01:08 resulterte i et tap av synergi og ga en additiv eller antagonistisk virkning i de fleste cellelinjer. Videre AZD6244-MK2206 kombinasjonsbehandling viste synergi med hensyn til suppresjon av A549 og H157 xenograft tumorvekst og øket midlere overlevelsestid dyr. Den AZD6244-MK2206 kombinasjonsbehandling resulterte i effektiv inhibering av både p-ERK og p-AKT ekspresjon i tumorvevet. I tillegg ble en signifikant økning av apoptose detektert i tumorvev fra mus behandlet med AZD6244-MK2206 sammenlignet med den fra den monoterapi behandlede mus. Vår studie tyder på at kombinasjonen av AZD6244 og MK2206 har en betydelig synergistisk effekt på tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo Hotell og fører til økt overlevelse i mus med svært aggressive menneskelungesvulster.
Citation: Meng J, Dai B, Fang B, Bekele BN, Bornmann WG, Sun D, et al. (2010) Kombinasjonsbehandling med MEK og AKT hemmere er mer effektiv enn enkelt narkotisk stoff i Human Ikke-småcellet lungekreft
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 5 (11): e14124. doi: 10,1371 /journal.pone.0014124
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 07.06.2010; Godkjent: 05.11.2010; Publisert: 29.11.2010
Copyright: © 2010 Meng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes delvis av National Institutes of Health gjennom MD Anderson Cancer Center Support Grant CA-016672 – Lung Program, flowcytometrisystemer og Cellular Imaging (FCCI) Kjerne Facility and Research Animal Support Facility, et spesialisert program for fremragende forskning (SPORE) Grant CA-070 907 (J. Minna og J. Roth), en R01 Grant CA-124951 (B. Fang) og Cohen-Reinach Family Charitable Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt og RAS /RAF /mitogen-aktivert protein kinase (MEK) /ekstracellulære signalregulerte kinase (ERK) trasé, megle spredning og overlevelse i humane lungekreftceller og dele flere nedstrøms-molekyler, slik som FOXO3a [1], caspase-9 [2], og Bad [3].
for tiden er en rekke små-molekyl tyrosinkinaseinhibitorer som er rettet mot signalveier er blitt utviklet , og to av disse midlene blir nå evaluert i kliniske studier. AZD6244 er en allosterisk inhibitor av MEK1 /2 kinaser som ikke konkurrerer med adenosintrifosfat (ATP) bindingsaktivitet [4]. Denne forbindelsen binder seg til MEK1 /2 og induserer flere konformasjonsendringer i den ufosforylerte MEK1 /2-enzymer, inhibering av sin katalytiske aktivitet, noe som resulterer i en inhibering av ERK-aktivering og en blokade av signaloverføringsreaksjonsveier. MK2206 er en svært selektiv ikke-ATP konkurranse allosterisk hemmer av AKT med IC
50 i nM område og har bred preklinisk antitumor aktivitet. Det er også i tidlig fase kliniske forsøk, og blir vurdert ved behandling av pasienter med lungekreft. Imidlertid er den potensielle effekt av en kombinasjon av AZD6244 og MK2206 i behandlingen av lunge cancer ukjent. I denne studien undersøkte vi effekten av kombinasjonen av AZD6244 og MK2206 i å drepe humane lungecancercellelinjer, og fant at denne kombinasjonen var svært synergistisk
in vitro
og meget effektiv i behandlingen av lunge cancer xenotransplantater. Vi har også undersøkt den mekanisme av synergisme for disse to forbindelser. Våre prekliniske funn støtter kliniske undersøkelser av AZD6244 og MK2206 kombinasjonsbehandling i lungekreftpasienter.
Materialer og metoder
Material
AZD6244 og MK2206, syntetisert i Dr. William G. Bornmann laboratorium ved The University of Texas MD Anderson Cancer Center, ble oppløst til konsentrasjoner på 25 mM og 20 mM, respektivt, i dimetylsulfoksyd og lagret ved -80 ° C. Antistoffer mot total og fosforylert ERK og AKT ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Antistoffer mot Bim ble oppnådd fra Calbiochem (San Diego, CA). Proteaseinhibitor cocktail, β-actin-antistoff, og sulforhodamin B ble erholdt fra Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Proteinanalyse materialer ble anskaffet fra Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Deadend ™ Flurometic TUNEL System ble kjøpt fra Promega (Madison, WI).
Cell kultur
Alle de humane lungekreftcellelinjer ble gitt av enten Dr. John V. Heymach ved MD Anderson Cancer senter~~POS=HEADCOMP eller legene. Adi Gazdar og John D. Minna ved The University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas. Cellelinjene ble opprettholdt i RPMI 1640 eller høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 ig /ml ampicillin, og 0,1 mg /ml streptomycin; cellene ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 og 95% luft.
Celleviabilitet assay
De inhiberende virkninger av AZD6244, MK2206, og den kombinasjonen av AZD6244 og MK2206 på cellevekst ble bestemt ved å bruke sulforhodamin B-analysen, som beskrevet tidligere [5]. Hvert eksperiment ble utført i fire eksemplarer og gjentas minst tre ganger. Den relative cellelevedyktighet (%) ble beregnet ved hjelp av ligningen OD
T /OD
C x 100% (hvor OD
T representerer absorbansen til behandlingsgruppen og OD
C representerer absorbansen kontrollgruppen). Median hemmende konsentrasjon (IC
50)-verdier ble bestemt under anvendelse av CurveExpert 1,3 programvare og plottet i dose-responskurver.
Western blot-analyse
Whole-cellelysater ble fremstilt ved vasking av celler med fosfat-bufret saltvann (PBS) og utsette dem for lysis med Laemmli-prøvebuffer supplert med protease inhibitor cocktail. Etter lysatene ble ultralydbehandlet i 15 sekunder, ble proteinkonsentrasjonen kvantifisert ved anvendelse av Bio-Rad proteinanalyse kit. Ekvivalente mengder av hvert protein ble lastet separert ved 10% eller 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese, og deretter overført til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner ved 80 V i 2 timer. Membranene ble blokkert i 1 time med 5% fettfri tørrmelk i PBS-buffer inneholdende 0,1% Tween-20 (PBST) og probet med fortynnet primært antistoff ved 4 ° C over natten. Membranene ble deretter vasket tre ganger i PBST-buffer, og probet med infrarøde fargestoffmerkede sekundære antistoffer; de immunreaktive bånd ble visualisert med Odyssey Imager (Li-COR biovitenskap, Lincoln, NE).
Cellesyklus og apoptose analyser
Cellene ble høstet ved trypsinering, vasket to ganger i kaldt PBS, fiksert med iskald 70% metanol, og inkubert ved 4 ° C over natten. Cellene ble deretter vasket med PBS og inkubert med 25 ug /ml propidiumjodid inneholdende 30 ug /ml ribonuklease i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble analysert på en EPICS Profile II flowcytometer (Coulter Corp., Hialeah, FL) ved hjelp av Multicycle AV programvare (Phoenix Flow Systems, San Diego, California). Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
Dyrestudier
Alle Dyreforsøk ble utført etter godkjenning av MD Anderson Institutional Review Board (11-03-09932) og ble utført i samsvar med Retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr publisert av National Institutes of Health.
Kvinne BALB /c nakne mus ble kjøpt fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Musene ble huset i laminære strømnings skap under spesifikke patogenfrie forhold, og ble anvendt når de var 6- til 8-uker gamle. Totalt 3 x 10
6 H157 eller A549-celler ble inokulert subkutant inn i høyre dorsale flankene av nakne mus. Når tumorene nådde et gjennomsnittlig volum på ca. 0,1 cm
3, ble musene tilfeldig delt inn i kontroll- og behandlingsgrupper (
n
= 5 dyr per gruppe). For H157-bærende mus, ble behandlingsgruppene administrert 20 mg /kg AZD6244, 10 mg /kg MK2206, eller AZD6244-MK2206 kombinasjon ved 20 mg /kg-10 mg /kg, som alle var blitt oppløst i et medium inneholdende 0,5% hydroksypropylmetylcellulose og 0,1% polysorbat buffer. I A549-bærende mus, ble behandlingsgruppene administrert 24 mg /kg AZD6244, 6 mg /kg MK2206, eller AZD6244-MK2206 kombinasjon ved 24 mg /kg-6mg /kg, som alle var blitt oppløst i et medium inneholdende 0,5% hydroksypropylmetylcellulose og 0,1% polysorbat buffer. Alle medikamentene ble oppløst i 100 ul bærerbuffer for hver mus. Alle legemidler administrert to ganger daglig ved oral sonde. Kontrollgruppen fikk bare bærerbuffer. Den behandlingsvarighet var 20 d. Tumorstørrelse, målt ved calipers, ble spilt inn hver 5 d. Tumorvolumet ble beregnet, idet lengde for å være den lengste diameter på tvers av tumoren og bredde som den tilsvarende perpendikulære diameter, ved hjelp av følgende formel: lengde x bredde
2 x 0,52. Tumorvekst-hemming ble beregnet som 100% x (tumorstørrelse
behandlede /tumorstørrelse
kontroll) på hver måling dag. Tumor-bærende mus fortsatt behandling som angitt ovenfor etter 20 d. Mus fikk lov til å leve opp til sitt naturlige død eller ble avlivet når deres tumorvolumet var større enn 2000 mm
3. Kaplan-Meier-overlevelseskurver ble plottet og analysert statistisk. Dyrets kroppsvekt ble målt og registrert hvert 5. d under behandlingen.
I farmakodynamisk studie ble svulster etablert som beskrevet ovenfor og ble tillatt å vokse til en størrelse på 0.5-0.8cm
3 før behandlingen gang. Mus med subkutant A549 svulster ble deretter daglig administrert kjøretøy, AZD6244, MK2206 eller AZD6244-MK2206 i samme konsentrasjoner som er nevnt ovenfor (
n
= 5 dyr per gruppe) for 3 dager. Fire timer etter siste dose ble dyrene avlivet og svulster ble resected, fiksert med 4% paraformaldehyde og parafin-embedded for immunhistokjemi flekker og TUNEL analysen.
Immunohistochemistry
Seksjonene ble deparaffinized i xylen og serie etanol fortynninger. Antigenene ble hentet og endogen peroksidase-aktivitet ble blokkert med 0,3% hydrogenperoksid i 10 minutter. Snittene ble så behandlet med 10% normalt geite eller hesteserum i 30 min. Etter inkubering over natten med primære antistoffer, inkludert p-AKT (fortynning 1:100) og p-ERK (fortynning 1:100), ble seksjonene probet med biotinylerte sekundære antistoffer, og deretter inkubert med streptavidin-biotin-kompleks (Lab Vision, Fremont , CA). Seksjonene ble deretter farget med en oppløsning av 3,3-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB, Lab Vision, Fremont, CA), motfarget med Mayers hematoksylin (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), dehydratisert og montert
TUNEL. analysen
seksjonene ble deparaffinized og Tunel analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner fra en kommersielt tilgjengelig kit (deadend ™ Fluorometrisk TUNEL System) fra Promega. Apoptotiske celler utviser en sterk kjerne grønn fluorescens som kan påvises ved å bruke en standard fluorescein filter. Alle celler farget med DAPI utstillings en sterk blå atom fluorescens. Skinnene ble observert etter fluorescens mikroskopi med relative apoptotiske celler bestemt ved å telle TUNEL-positive celler i fem tilfeldige felt (ved x 100 forstørrelse) for hver prøve.
Statistisk analyse
in vitro cytotoksisitets
eksperimenter ble utført i tre eksemplarer for hvert tidspunkt og konsentrasjon. Betydningen av
in vitro
data ble bestemt ved bruk av Student
t
test (2-tailed). P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
mutasjoner av cellelinjene ble hentet fra online database genet (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/). Korrelasjonene av
in vitro
svar på AZD6244 eller MK2206 (IC
50) og genmutasjoner ble vurdert ved hjelp av Wilcoxon test og logistisk regresjon.
For
in vivo
studier, ble tumorvolumet beregnet som middelverdi ± standardavvik. Wilcoxon rank sum test og Kruskal-Wallis test ble brukt for å sammenligne behandlings forskjeller. Spearman korrelasjonskoeffisient ble brukt for å beregne korrelasjon mellom to kontinuerlige variabler. Behandling forskjeller med hensyn til overlevelse ble vurdert via log-rank test. Alle testene var tosidig. P-verdier som er mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistisk programvare SAS 9.1.3 og S-PLUS 8.0 ble brukt for alle analysene.
Resultater
Effekter av AZD6244 eller MK2206 Single-medikamentell behandling på Lung Cancer Cell Lines
Før evaluere effekten av kombinasjonsbehandlingen, testet vi den antiproliferative effekt av AZD6244 og MK2206 som enkeltmiddelterapier på et panel av 47 humane lungekreft-cellelinjer (figur 1). Responsen på AZD6244 variert mye, fra svært følsom (IC
50 0,2 mm) til svært motstandsdyktig (IC
50 150 mm), blant de cellelinjer. Doseresponsområde av MK2206 var mer konsekvent, med IC
50 som strekker seg fra 0,4 uM til 25 uM. Vi har funnet noen cellelinjer var følsomme for AZD6244 men motstandsdyktig mot MK2206 (for eksempel Calu-6, HCC1171, og H1993), mens andre cellelinjer var resistente mot AZD6244 men følsom for MK2206 (så som H522, H1395, og Calu-3) . Ingen sammenheng mellom følsomhet for disse to forbindelser ble observert. Sammenligning av dose-respons-resultater og den elektroniske genmutasjon database, ble ingen sammenheng finnes mellom EGFR, KRAS, BRAF eller PI3K genmutasjoner og IC
50 av AZD6244 eller MK2206. Vi også observere sammenhenger mellom generelle EGFR /KRAS /BRAF genmutasjoner og IC
50 av AZD6244 eller generelle EGFR /PI3K genmutasjoner og IC
50 av MK2206 (tabell 1 og 2).
De angitte cellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av enten AZD6244 eller MK2206 i 96 timer. Celleviabilitet ble fastsatt ved hjelp sulforhodamin B, og IC
50 ble beregnet i henhold til dose-responskurve.
Effekter av AZD6244-MK2206 kombinasjon varierer mellom lungekreft cellelinjer
fra 47 cellelinjer, vi valgte 28 å teste antitumor effektene av AZD6244 og MK2206 kombinasjonsbehandling. Cellelinjene ble valgt for å representere et spekter av følsomhet for ett eller begge medikamenter. IC
50 var 5um for både AZD6244 og MK2206 for 21 av de 28 cellelinjer. For de andre cellelinjer IC
50 var mindre enn 5um for AZD6244 eller MK2206 eller begge deler. For å finne ut om antitumoreffekter som oppnås med forskjellige AZD6244 og MK2206 kombinasjoner var synergistisk beregnet vi kombinasjonen indeks (CI) i henhold til Chou-Talalay metode med Calculsyn programvare (Biosoft, Cambridge, UK). (CI 1.1, antagonisme, CI = 0,9-1,1, additiv effekt; CI = 0,2-0,9, synergisme, CI 0,2 sterk synergisme). Siden Chou-Talalay modell krever cytotoksiske midler som skal brukes på en fast dose forhold, valgte vi å bruke AZD6244 og MK2206 på en 05:01 molar ratio. Etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av AZD6244 (0,024 til 100 uM), MK2206 (0,005 til 20 uM) og AZD6244 /MK2206 (0,024 /0,005 til 100/20 pM), som er i størrelsesorden av konsentrasjoner oppnådd i serum hos pasienter som mottar oral AZD6244 og MK2206, ble kombinasjonen indeks (CI) målt på hver cellelinje. I 67% av cellelinjene, inkludert H2023, H2347, HCC827, og H23 er vist i figur 2, er kombinasjonsbehandling ga en sterk synergistisk effekt. Den kombinerte behandling produserte en additiv eller antagonistisk virkning bare i 11% av cellelinjer (tabell 3).
lungecancercellelinjer ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AZD6244 (0,024 til 100 uM), MK2206 (0.005- 20 mm) og AZD6244 /MK2206 (0,024 /0,005 til 100/20 mm) i 96 timer. Dose-effekt kurver i kombinasjon og av hvert middel alene, er presentert for sammenligning. Representative cellelinjer som viste de sterke synergieffekter av kombinasjonsbehandlingen blir vist.
synergistisk effekt av AZD6244-MK2006 kombinasjonsbehandling er forholdsavhengig
De faste stoffet forholdstall ble utvidet til 7 cellelinjer (H1792, H157, A549, H515, H1693, H1703 og H3122) som var følsomme for kombinasjonen av AZD6244 og MK2206 til 08:01, 04:01, 02:01, 01:02, 1: 4 og 01:08. Vi fant ut at konsekvent synergisme resulterte når 8:1, 04:01, og 2:1 forhold ble brukt (figur 2, tabell 4), mens redusere AZD6244:MK2206 forholdet til 01:08 resulterte i et tap av synergi og produsert en additiv eller antagonistisk virkning i de fleste cellelinjer (tabell 4). Vi har også funnet at hver cellelinje som hadde sitt eget optimale medikamentforhold. For eksempel H1703 viste den høyeste grad av synergi på en AZD6244:MK2206 forhold på 08:01; H1693 og A549 var høyest ved 04:01 (figur 3A, til venstre); og H157 var høyest ved 2:01 (figur 3A, til høyre).
(A) A549 og H157 ble behandlet med AZD6244, MK2206, eller en kombinasjon av disse to forbindelser ved de angitte konsentrasjoner i 48 timer. (B) Proteinprøver ble høstet og AKT, p-AKT, ERK, p-ERK og Bim ekspresjon ble påvist med Western blot-analyse. (C) Cellene ble trypsinert og fast, og cellesyklusen ble målt ved strømningscytometri. Tallene representerer prosenter av apoptotiske sub-G
1-fase celler. Data representerer en av tre uavhengige forsøk med lignende resultater.
Kolonner
, mener;
bar
, SD *,
P
. . 0.05, sammenlignet med monoterapi behandlinger
MK2206 forbedrer AZD6244-indusert apoptose
for å finne ut om MK2206 hatt en effekt på AZD6244-indusert apoptose, testet vi uttrykket av AKT, p-AKT, ERK, p-ERK, og Bim og kvantifisert apoptotiske celler etter behandling med individuelle og kombinasjonsmidler. AZD6244 er kjent for å oppregulere ekspresjon av Bim, et BH3-bare protein, som fører til en mitokondriell sti aktivering og apoptose mediert av FOXO3a [6]. I tillegg kan AKT også fosforylere FOXO3a, og hemming av AKT kan forbedre FOXO3a aktivering av defosforylering. Vi la merke til at behandling med AZD6244 alene førte til en relativt moderat overekspresjon av Bim på 48 timer. Selv om vi ikke oppdager en åpenbar endring i Bim uttrykk etter behandling med MK2206, da MK2206 ble kombinert med AZD6244, økt Bim uttrykk til et nivå høyere enn det indusert av AZD6244 alene (Figur 3B). Vi har også funnet at 2-stoff kombinasjon resulterte i mer apoptotiske celler enn både enkeltmedikamentbehandling alene. Når kombinert med MK2206, økt AZD6244-indusert apoptose fra 14,4% til 29,8% i A549-cellelinjen og fra 6,0% til 27,0% i H157-cellelinjen (
P
0,05, figur 3C). Disse resultatene indikerer at MK2206 effektivt forbedret AZD6244-indusert aktivering av mitokondrie apoptose.
synergistisk effekt
in vivo
Response til AZD6244-MK2206 kombinasjonsbehandling
in vivo
ble evaluert i subkutane tumorer generert ved injeksjon av A549 eller H157-celler inn i flankene av BALB /c nakne mus. Mus med etablerte flanke svulster i like volumer ble behandlet med kjøretøy, en enkelt AZD6244 administrasjon, et enkelt MK2206 administrasjon, eller AZD6244-MK2206 kombinasjon. I både A549 og H157 subkutan xenograft musemodeller, mus som fikk kombinasjonen av AZD6244 og MK2206 viste en betydelig redusert gjennomsnittlig tumorvolum (135 ± 120 og 188 ± 107 mm
3) sammenlignet med mus som fikk AZD6244 alene (848 ± 302 og 669 ± 154 mm
3), MK2206 alene (1497 ± 380 og 858 ± 125 mm
3), eller kontroll behandling (2666 ± 275 og 1437 ± 217 mm
3) ved dag 20 (
P
0,01 for alle tre sammenligninger, figur 4A). Dette resultatet indikerer at undertrykkelse av AKT med MK2206 økte A549 og H157 cellenes følsomhet for AZD6244
in vivo
. I tillegg har vi funnet at dyr overlevelsestiden var lengre i gruppene som mottok 2-legemiddelkombinasjonen enn i de gruppene som fikk mono forbindelser eller kontrollbehandling (figur 4B). Median overlevelse av dyr behandlet med AZD6244-MK2206 kombinasjon økt betydelig (
P
0,01, figur 4B). I A549 xenograft modell, mus behandlet med AZD6244-MK2206 hadde en median overlevelsestid på 50 d, mens de som ble behandlet med AZD6244 alene, MK2206 alene, og kontroll kjøretøy hadde median overlevelsestid på 32 d, 23 d, og 17 d, respektivt (
P
0,01 for alle tre sammenligninger). Vi hadde lignende resultater i H157 xenograft modell: median overlevelsestid for kombinasjonsterapi markant økt til 45 d mens for AZD6244 stående, MK2206-alene, og kontrollbehandlinger var 33,5 d, 33 d, og 26,5 d, henholdsvis (
p
0,01 for alle tre sammenligninger). I tillegg er 20% av H157 tumorbærende mus, og 40% av A549-tumor-bærende mus som fikk kombinasjonsbehandling levde forbi 55 d og ikke har tumorer i slutt observasjon. Videre ble ingen signifikante forskjeller i mus kroppsvekt funnet mellom de fire gruppene etter den 20 d behandlings, og det var ingen åpenbar toksisitet i medikamentkombinasjonen (data ikke vist). Sammen tyder disse resultater på at kombinasjonen av AZD6244 og MK2206 har en synergistisk terapeutisk virkning på kreftcellevekst human lunge i et panel av NSCLC-cellelinjer
in vitro
, og i A549 og H157 cellelinjene
i vivo
.
Flanken svulster ble etablert i nakne mus og behandlet med kjøretøy, terapi AZD6244, MK2206, eller kombinasjon AZD6244-MK2206 oralt to ganger om dagen på angitte doser. (A) Tumor-volumer. Totalt forskjeller mellom behandlingene var statistisk signifikant (
P
0,001; Kruskal-Wallis Test). Vi observerte statistisk signifikante tid-for-behandling effekter når man sammenligner kontroll vs A (
P
0,05); Kontroll vs M (
P
0,05); Kontroll vs A + M (
P
0,05); En vs M (
P
= 0,05); A vs A + M (
P
= 0,05) og M vs A + M (
P
0,05) for A549; Resultatene var tilsvarende for H157 bortsett fra at A vs. M ikke var statistisk signifikant. (B) Overlevelses ganger. Totalt forskjeller mellom behandlingene var statistisk signifikant (
P
0,001; Logg RankTest).
Target modulasjon i A549 xenograft mus modell
I den farmakodynamiske studien fire timer etter den siste dose på dag 3 ble dyrene avlivet og tumorene vev ble skåret ut og analysert for p-ERK og p-AKT ved immunhistokjemisk farging. Hemning av p-ERK-ekspresjon ble observert i tumorer i mus behandlet med AZD6244 alene eller AZD6244-MK2206 kombinasjon. Hemning av p-AKT ble sett i tumorer i mus behandlet med MK2206 alene eller AZD6244-MK2206 kombinasjon (figur 5A). Resultatene viste at p-ERK og p-AKT ble effektivt inhibert med AZD6244 og MK2206
in vivo
. Kombinasjonen av AZD6244 og MK2206 kan også hemme målene effektivt. Tunel analysen viste at MK2206 forbedret AZD6244-indusert apoptose signifikant (
P
0,05). Fra 2,6% til 11,2% i xenograft tumor vev (figur 5B)
xerograft musemodeller var behandlet med bærerkontroll, AZD6244 (24 mg /kg), MK2206 (6 mg /kg) eller AZD6244-MK2206 (24 mg /kg-6 mg /kg) kombinert i 3 dager. Fire timer etter siste dose, ble svulstene resected, faste og parafin-embedded. (A) Seksjonene ble analysert ved hjelp av immunhistokjemi p-ERK og p-AKT-antistoffer og de representative fotografier i tumorsnitt er vist. (B) Seksjonene ble utsatt for TUNEL og DAPI farging. De relative apoptotiske celler ble bestemt ved telling TUNEL-positive celler i fem tilfeldig felt (ved 100 x forstørrelse) for hver prøve.
Kolonner
, mener;
bar
, SD. *,
P
0,05, sammenlignet med monoterapi behandlinger. De representative fotografier i tumorsnitt vises.
Diskusjoner
I denne studien vi rapportere at kombinasjonsterapi av MEK hemmer AZD6244 og AKT hemmer MK2206 kan indusere dramatiske synergis hemming av tumorvekst
in vitro Hotell og
in vivo
. Tidligere studier har observert at motstanden mot AZD6244 i lungekreftceller er mediert av AKT-aktivering [5], [7]. Feedback loop av RAS /RAF /MEK /ERK og PI3K /AKT trasé bedt oss om å hypoteser om at undertrykkelse av disse to banene kan overvinne motstanden mot AZD6244 og virke synergistisk å hemme veksten av lungekreft. I denne studien viste vi at monoterapi med enten AZD6244 eller MK2206 har en beskjeden hemmende effekt på lungekreftcellelinjer. Fordi enkelte genmutasjoner kan være innblandet i respons til disse midlene, vi også sjekket mutasjonsstatus av BRAF, KRAS, EGFR og PI3K i disse cellelinjene. BRAF V600E mutasjon er blitt rapportert å være korrelert med følsomhet for MEK-hemmere [8], [9] og har vært brukt som et viktig kriterium for å rekruttere pasienter inn i en klinisk studie av MEK-inhibitorer i melanomapasienter. KRAS, BRAF /KRAS, og LKB /KRAS mutasjonen (e) er korrelert med følsomhet for MEK-inhibitorer i eggstokk-kreft [10], kolorektal kreft [11], og NSCLC [12], respektivt. Men vi gjorde ikke oppdage en åpenbar sammenheng mellom mutasjons uttrykk for EGFR, BRAF, PI3KI, eller KRAS og følsomhet for AZD6244 eller MK2206 i lungekreft linjene vi testet. Dette kan være på grunn av de forskjellige effekter av mutasjonene i spesifikke histologiske typer kreft eller i cellelinje bestemte veier. For eksempel, for bryst- og lungecancer, genekspresjon assosiert med forskjellig sensitivitet til AZD6244 inkluderte mange gener som ikke var felles for begge histologier [13]. En annen mulig forklaring på avvik på våre resultater og tidligere studier kan skyldes ulike frekvenser av genmutasjoner i ulike krefttyper. For eksempel er mutert BRAF i mange kreftformer, inkludert malignt melanom (27-70%), papillær skjoldbruskkjertelkreft (36-53%), eggstokk-kreft (ca. 30%), og kolorektal kreft (5-22%). Imidlertid er BRAF mutasjoner påvist bare i 1-2% av lungekreftpasienter. Det ville være vanskelig å statistisk signifikante forbindelser med slike lave frekvens hendelser.
Undersøkelsen viste at den dual-middel AZD6244-MK2206 kombinasjonsbehandling viste en synergistisk effekt på tumorveksten i forhold til enten middel alene. Som monoterapi, AZD6244 var ineffektive mot noen lungekreft cellelinjer (som Calu-1, H460 og H661). Imidlertid, når kombinert med MK2206, disse resistente cellelinjer var følsomme for kombinasjonsbehandling. Ifølge Chou-Talalay metoder [14], ble det benyttet en fast stoff-forhold for å teste for en synergistisk effekt. I kliniske studier, vil kombinasjonsbehandling gis til pasienter i å gjenta 28-d sykluser. Den planlagte startdose på MK2206 er 45 mg /kg annenhver dag (den høyeste gang annenhver dag dose MK2206 vil være 45 mg /kg) eller 90 mg /kg en gang i uken og øke til så mye som 250 mg /kg en gang i uken ; den planlagte startdose på AZD6244 er 75 mg /kg to ganger daglig (https://clinicaltrials.gov/). Vi valgte et stoff forhold på 05:01 AZD6244:MK2206 som er i dette området for vår første studie
in vitro
. Våre resultater viser at AZD6244:MK2206 kan indusere synergieffekter mellom 89% cellelinjer. For å få en mer kvantitativ analyse utvidet vi stoffet forhold til å identifisere de mest effektive rekkevidden og optimal synergistisk forhold. Vi fant ut at disse to stoffene viste konsekvent synergieffekter på 08:01, 04:01, og 2:1 forholdstall på AZD6244 til MK2206, mens avtagende dette forholdet til 01:08 resulterte i et tap av synergi og tilstedeværelsen av bare additive effekter eller til og med antagonisme i de fleste cellelinjer. Vi valgte to KRAS muterte cellelinjer, A549 og H157, for ytterligere å undersøke effekten av AZD6244-MK2206 kombinasjonen
in vivo
. Den tumorvekst ble hemmet signifikant med kombinasjonsbehandling sammenlignet med monoterapi behandling. Den farmakodynamiske effekter i A549 xerografts viste at uttrykket nivået av p-ERK og p-AKT ble undertrykt tilstrekkelig med AZD6244 og MK2206 hhv. Kombinasjonen av AZD6244 og MK2206 inhiberte både p-ERK og p-AKT effektivt. Tunel analysen viste at kombinasjonsbehandling fremkalt mye mer tumor celle apoptose enn enkelte legemidler. Disse resultatene antyder sterkt at AZD6244 og MK2206 synergi indusere apoptose av dual hemming av ERK og AKT fosforylering.
Tidligere studier har vist at om kreft medikamentkombinasjoner samhandle synergi eller antagonistically kan stole på forholdet mellom de samlede midler [15 ], [16]. Unnlatelse av å kontrollere medikamentforhold på grunn av ukoordinerte mekanismer eller farmakokinetikk vil derfor kunne føre til resistens hvis tumorcellene utsettes for antagonistiske medikamentforhold. Det er mulig at de nøyaktige forholdene beskrevet
in vitro
kan ikke oppnås i svulsten til en pasient på grunn av differensial fordeling og metabolisme av disse to forbindelser. Men vi fant at synergieffekter skjedde over et bredt spekter av medikamentkonsentrasjoner gjør det sannsynlig at en terapeutisk effekt oppnås.
I vår mekanistisk og
in vivo
studier, vi brukte A549 og H157 cellelinjer fordi begge havn KRAS-mutasjoner. Mutasjoner i KRAS har blitt funnet i 20% til 30% av lungekrefttilfellene og antas å spille en nøkkelrolle i dette malignitet [17].
