Abstract
Graviditet-assosiert plasma protein-A (PAPPA) har blitt rapportert å regulere aktiviteten til insulin-lignende vekstfaktor (IGF) signal vei gjennom proteolytisk nedbrytning av IGF-bindende proteiner (IGFBP) for derved å øke den lokale konsentrasjon av frie IGF tilgjengelig for reseptorer. I denne studien fant vi at PAPPA skilles fra to av sju lunge kreft cellelinjer undersøkt. Ingen av udødeliggjort normale bronkial epitelceller (HBE) testet hemmeligheter PAPPA. Det er ingen korrelasjon mellom ekspresjonsnivå og sekresjon av PAPPA i disse cellene. En cellelinje over-uttrykker PAPPA sammen med utskillelsen viser ingen merkbare endringer i spredning henhold celledyrkningsforholdene
in vitro
, men viser betydelig styrking av tumorvekst
in vivo
i en xenograft modell. I motsetning til en cellelinje over-uttrykker PAPPA uten sekresjon utstillinger reduksjon av tumorvekst både
in vitro Hotell og
in vivo
. Nedregulering av PAPPA uttrykk og sekresjon av RNAi knockdown reduserer tumorvekst etter implantert
in vivo
. Den tumorfremmende aktivitet av PAPPA ser ut til å være formidlet hovedsakelig gjennom styrking av IGF signalveien som antydet med bemerkelsesverdige økninger i nedstrøms Akt kinase fosforylering i tumorprøver. Våre resultater indikerer at PAPPA sekresjon kan spille en viktig rolle i lungekreft vekst og progresjon
Citation. Pan H, Hanada S, Zhao J, Mao L, Ma MZ-Q (2012) Protein Sekresjon er nødvendig for graviditet-Associated Plasma Protein-A for å fremme Lung Cancer Vekst
In Vivo
. PLoS ONE 7 (11): e48799. doi: 10,1371 /journal.pone.0048799
Redaktør: Giuseppe Viglietto, Universitetet Magna Graecia, Italia
mottatt: 11 juni 2012; Godkjent: 01.10.2012; Publisert: 09.11.2012
Copyright: © 2012 Pan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskningen ble støttet delvis av National Institute of Health gir R01 CA126818 og R01 CA136635. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Insulin-lignende vekstfaktorer (IGF) spiller. en viktig rolle i mange biologiske prosesser, for eksempel cellevekst, transformasjon, differensiering, overlevelse og migrasjon [1], [2]. I tillegg til deres viktige roller i utviklingsbiologien som tydelig i genetiske mutasjoner null [3], [4], [5], IGF er tydelig involvert i reguleringen av tumordannelse og progresjon [6], [7]. Det er vel kjent at serumnivåene av IGF-1 kan korreleres med forekomsten av kreft hos mennesker [8], [9]. Muse embryonale fibroblaster med null mutasjon av
Ifgf1r
er resistente mot induksjon av celletransformasjon [10]. På molekylært nivå, til IGF binde til de reseptor-tyrosin-kinaser (IGF1R, IR-A) aktivere flere intracellulære signalreaksjonsveier, inkludert phosphatidylinositide-3′-kinase (PI3K) /akt og mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) signaleringskaskader [ ,,,0],11], [12]. Imidlertid er tilgangen av IGF til deres reseptorer strengt kontrollert av IGF-bindende proteiner (IGFBP) som bindes til IGF med en høyere affinitet enn IGF1R [13]. Nedbrytning av IGFBP øker frie aktive IGF tilgjengelig til reseptorer i ekstracellulære mikromiljøet og øker dermed IGF aktivitet [14]. En mangfoldig gruppe av proteaser, inkludert plasmin, matriks-metallproteaser (MMP-1, -2 og -3), cathepsin D og prostataspesifikt antigen (PSA) har blitt rapportert til å delta i proteolyse av IGFBP med forskjellig styrke og spesifisitet [15].
Graviditet-assosiert plasma protein-A (PAPPA) er en annen protease som har blitt rapportert å kløyve IGFBP4 [16]. PAPPA ble opprinnelig funnet i morkaken og reproduktive vev, og har blitt foreslått som en biomarkør for graviditet med genetisk abnormitet [17]. Nylig den proteolytiske aktiviteten til PAPPA er blitt identifisert i normale humane fibroblaster, dyrkede osteoblaster [18], [19], vaskulære glatte muskelceller [20] og ovarie granulosa celler [21]. I tråd med disse funnene, økt uttrykk av PAPPA er funnet
in vivo
i aktive aterosklerotisk plakk i menneskekoronararteriene [22] og sårtilheling av menneskelig hud [23]. Således deltar PAPPA i reguleringen av IGF-medierte patofysiologiske prosessene i disse sykdommene. PAPPA er også funnet å spalte og inaktivere IGFBP2, IGFBP3 og IGFBP5 [24].
Flere linjer av bevis indikerer at PAPPA er involvert i tumordannelse. PAPPA genet er lokalisert i en kromosomal regionen assosiert med høy frekvens for tap av heterozygositet i ovarietumorer. De fleste eggstokkreft cellelinjer og primære svulster viser delvis eller fullstendig tap av uttrykk for PAPPA [25]. PAPPA ekspresjon ble vist å være jevnt høy i normale eggstokk-prøvene og er undertrykt av SV40 stort T-antigen [25], [26]. Tvert imot, mus med en null mutasjon av genet PAPPA lever lenger og vis mindre forekomst av tumordannelse i løpet av livet [27]. I tillegg har serum PAPPA nivå blitt rapportert å være økt hos pasienter med lungekreft sammenlignet med friske personer [28]. I lys av de kontroversielle roller PAPPA rapportert i kreftutvikling, bestemte vi oss for å over-express PAPPA i lunge kreft cellelinjer for å vurdere sin rolle på tumorvekst og progresjon. Her rapporterer vi at ektopisk over-uttrykk for PAPPA i H1299 lungekreftceller fremmer tumorvekst
in vivo
i en xenograft modell mens nedregulering av endogen PAPPA i A549 lungekreftceller avtar tumorvekst. Tumor veksten er knyttet til PAPPA sekret. Svulster fra PAPPA over-uttrykker H1299 celler viste økt antall mitotiske celler og en reduksjon i apoptose. Signalveien analyse viste forhøyet Akt signalering. Våre resultater tyder på at utskilt PAPPA i kreftceller kan fremme svulst utvikling gjennom poten IGF signalveien
Materialer og metoder
reagenser ble hentet fra følgende leverandører:. Cellelinjer H1299, A549, H460 , H596, H1792, H1944 og H522 ble opprinnelig kjøpt fra ATCC. HBE1, HBE2 og HBE4 ble hentet fra John Minna (University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas), som hver representerer HBEC1, HBEC2 og HBEC4 udødeliggjort med Cdk4 og hTERT henholdsvis [29]. Origin of reagenser som brukes i eksperimenter er oppført som følger: Human PAPPA full lengde cDNA-klon (ATCC, Varenr: 10625309); Mus monoklonalt anti-PAPPA antistoff (Novus, Littleton CO); IGF2 protein, IGFBP4 protein og Kanin polyklonalt anti-IGFBP4 antistoff (Abcam, Cambridge, MA); Fosfor-P44 /42 MAPK kanin mAb, P44 /42 MAPK kanin mAb, Phospho-Akt kanin mAb, Akt (pan) kanin mAb, β-tubulin antistoff (Cell Signaling, Danvers, MA); Anti-mus IgG, anti-kanin IgG (Thermo Scientific, Rockford, IL); Biotinylert anti-kanin-IgG, biotinylert anti-muse IgG (Vector Lab, Burlingame, CA); Rekombinant human epidermal vekstfaktor (EGF), human rekombinant transformerende vekstfaktor-β1 (TGF-β1) (Invitrogen, Camarillo, CA); Rekombinant humant insulin-lignende vekstfaktor I (IGF1) (R CellTiter-Blue (Promega, Madison, WI); Anti-fosfor histon H3 (Millipore, Temecula, CA); RIPA buffer (Sigma, Saint Louis, MI); PAPPA ELISA kit (Diagnostic Systems Lab, Webster, Texas); Proteasehemmer cocktail tabletter (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland)
Cell kultur
H1299, H460, H596, H1792, H1944 og H522 cellelinjer ble opprettholdt i RPMI 1640 og A549 cellekulturer ble opprettholdt i DMEM. Både PRMI1640 og DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Atlanta, Lawrenceville, GA), L-glutamin (4 mM), penicillin (100 U /ml), og streptomycin (100 ug /ml), alle fra Invitrogen. HBE1, HBE2 og HBE4 ble opprettholdt i fullstendig keratinocyte serumfritt medium (SFM) (Invitrogen, Carlsbad, California). Celler ble dyrket i en fuktet vevskultur-inkubator ved 37 ° C, 5% CO
2. Serum-frie celle kondisjonert medium (CM) ble fremstilt fra monolagskulturer ved 80-100% konfluens. Serumholdig medium ble aspirert og monolagene ble vasket tre ganger med fosfat-bufret saltløsning. Komplett keratinocyte-SFM tilsatt og inkubert i 24 timer. Ved høsting, ble CM overført til et sentrifugerør og sentrifugert ved 2500 rpm i 10 min ved 4 ° C før frysing i små alikvoter ved -20 ° C inntil bruk i analyser. For hele celleekstrakt (CE), ble mediet fjernet og vasket tre ganger i PBS og lysert i RIPA buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som inneholder proteasehemmere og fosfatase inhibitor cocktail tabletter (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) og sentrifugert ved 12500 rpm i 5 min. Denne supernatant ble brukt for analyser.
Expression analyse av kreftcellelinjer ved real-time PCR
RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) ble brukt til å forberede total RNA fra cellekultur . Total RNA ble behandlet med DNase i henhold til produsentens instruksjoner (Qiagen). Syntese av cDNA ble satt opp ved hjelp TaqMan RT-PCR reagenser fra Applied Biosystems (Life Technologies, Grand Island, New York). PAPPA genekspresjon ble bestemt av TaqMan genuttrykk analysen med en 7900HT Real-Time PCR System detektor (Applied Biosystems). De spesifikke primere for forsterkning av målgener og spesifikk probe for å oppdage forsterkning ble designet av Applied Biosystems (Cat #: Hs00361692_m1). Humant PPIA (Cyklofilin A) ble anvendt som en intern kontroll for normalisering av genekspresjon (Cat #: 4333763F, Applied Biosystems).
Generering av lungekreft-cellelinjer som stabilt overuttrykkende PAPPA eller nedregulering av endogen PAPPA uttrykk
Menneskelig PAPPA full lengde cDNA (kjøpt fra ATCC, Varenr: 10625309) ble løslatt fra pBluescript vektor av SfiI (fylt) -XbaI fordøyelse og subklonet inn EcoRV og Xbal områder av pCR3.1 ekspresjonsvektor (Invitrogen ) å konstruere PAPPA ekspresjonsvektor. Ekspresjonsvektoren ble verifisert ved sekvensering. H1299-celler transfektert med enten PAPPA ekspresjonsvektor eller tom vektor ble valgt under seleksjonsmedium inneholder 0,5 mg /ml G418 (Sigma). G418-resistente kloner ble testet for ekspresjon av PAPPA og deretter ekspanderes for å generere H1299 PAPPA overekspresjon linje (H1299 /PAPPAov) og tom vektorkontroll cellelinje (H1299 /pCR3.1). For pappa knockdown eksperimenter, lentiviral partikler # 81 (Cat #: VGH5523-101126912, Clone ID: V3LHS_355181), # 82 (Cat #: VGH5523-101130068, Clone ID: V3LHS_355182), # 83 (Cat #: VGH5523-101132535, Clone ID: V3LHS_355183) som inneholder shRNAmir til PAPPA og ikke-tie shRNAmir (Cat #: RHS4348) ble kjøpt fra Thermo Scientific (Lafayette, CO) og benyttes til å infisere A549 kreftceller. De modne fornuft sekvenser av disse klonene er oppført som følger: V3LHS_355181: CGACAAGAAGTCTCCTTCA; V3LHS_355182: AGAGCCTACTTGGATGTTA; V3LHS_355183: GGGCAGTTCATGAAGCTCT; Non-lyddemping: TCTCGCTTGGGCGAGAGTA. Førtiåtte timer etter infeksjon, ble cellene valgt i seleksjonsmedium inneholdende 2 ug /ml puromycin (Invitrogen). Kloner ble undersøkt ved real-time PCR for styrken av PAPPA mRNA knockdown og utvidet til å generere PAPPA knockdown cellelinje (A549 /PAPPAkd) og ikke-tie kontroll cellelinje (A549 /sc).
PAPPA ELISA
Kondisjonert medium (CM) og hel celleekstrakt (CE) ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Pappa ble målt ved hjelp av en Ultra PAPPA ELISA kit hentet fra Diagnostic Systems Laboratories i henhold til produsentens instruksjoner. Minimum følsomhet er 0,24 mIE /L, med intra- og inter-assay variasjonskoeffisient på 4,7 og 4,2%, henholdsvis.
Måling av IGFBP proteolytisk aktivitet
Den proteolytiske aktiviteten til PAPPA ble analysert ved inkubasjon serumfritt kondisjonert medium (CM) med underlaget protein IGFBP4. I korthet replikere reaksjoner ble satt opp ved å blande 25 ul CM med 40 ng IGFBP4 substrat i nærvær eller fravær av IGF2 (75 nM endelig konsentrasjon), etterfulgt av inkubasjon ved 37 ° C i 4 timer. Intakte og spaltede protein av IGFBP4 i reaksjonsblandinger ble deretter separert ved ikke-reduserende 10% SDS-PAGE og visualisert ved Western Blot analyse ved anvendelse av polyklonalt anti-IGFBP4 antistoff (Abcam).
tumor xenograft eksperimenter
Fire uker gamle hunn alvorlig kombinert immunsvikt (SCID /NOD) mus eller nu /nu athymiske mus (Charles River) ble anvendt for denne studien, og alle musene ble holdt under spesifikke patogenfrie forhold. 5 × 10
6 av H1299 /PAPPAov, H1792 /PAPPAov eller dets tom vektorkontrollceller (H1299 /pCR3.1 eller H1792 /pCR3.1) ble suspendert i 0,1 ml 1 x PBS som inneholder 50% av matrigel og injisert subkutant i fem mus per gruppe ved å bruke 26 gauge nåler og lov til å forplante å danne håndgripelig svulster. Svulster ble overvåket og deretter målt to ganger i uken i tre dimensjoner ved hjelp av et skyvelære. Tilsvarende Pappa knockdown A549 celler linje A549 /PAPPAkd og ikke-tie kontroll A549sc ble utvidet i kultur. 1 x 10
6-celler suspendert i 0,1 ml 1 x PBS ble injisert subkutant i fire uker gamle nu /nu athymiske mus. De voksende tumorer ble undersøkt og målt to ganger i uken, som beskrevet ovenfor. Tumorvolumer ble beregnet ved hjelp av formelen (π /6) x lengde (
L
) × bredde (
W
) × høyde (H) av svulster der
L Hotell og
W
representerer de lengste og korteste kreft dimensjoner, henholdsvis. Musene ble avlivet på samme måte når det største tumoren nådde studien endepunktet definert av en tumorbelastning på 10% av musekroppsvekt.
Ethics Statement
Alle mus ble behandlet i henhold til guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Alle dyreforsøk ble utført følgende prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Maryland School of Dentistry. Den heter Institutional Review Board eller etisk komité godkjente spesielt denne studien.
Western Blot analyse
Protein fra hele celle utdrag ble kvantifisert ved hjelp av BCA assay (Pierce). En total på 25 ug protein ble fraksjonert ved NuPAGE 10% Bis-Tris gel (Invitrogen) og overført til en polyvinylidendifluorid (PVD) membran ved iBlot gel overføringssystemet (Invitrogen). Membranen ble blokkert i TBST (10 mMTris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1% (v /v) Tween-20) inneholdende 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk i en time og inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer (1:1000), enten i TBST /1% (vekt /volum) fettfri tørrmelk, eller i TBST /1% (w /v) BSA (bovint serumalbumin). Membranene ble vasket seks ganger med TBST, inkubert med 1:5000 pepperrot peroksidase-konjugert anti-mus eller anti-kanin-IgG-antistoff i TBST /1% (vekt /volum) fettfri tørrmelk i en time ved romtemperatur. Etter ytterligere seks vasker i TBST, ble antistoffkomplekser oppdaget ved hjelp av forbedret chemiluminescence (Amersham Biosciences). Molekylvekt ble beregnet ved hjelp av en prestained full raseri regnbue molekylære markører (GE Healthcare).
immunhistokjemisk farging
Parafin-embedded, 5 mikrometer tykke vevssnitt fra tumorvev ble brukt til immunhistokjemisk farging . Kort fortalt seksjonene ble deparaffinized i en serie av xylen bad og deretter utvannet ved hjelp av en gradert alkohol serien. Seksjonene ble deretter inkubert i citrat-buffer (pH 9) i 15 minutter under mikrobølgestråling i rekkefølge for antigen gjenfinning. Etter blokkering med normal blokkeringsbuffer (Vectastain kit) i 30 min ble snittene inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer (fosfo-histon H3 mAb: 1:000; Phospho-Akt mAb: 1:100; Phospho-P44 /42 MAPK mAb: 1:100). Seksjonene ble deretter behandlet ved hjelp av standard avidin-biotin immunkjemiske teknikker (ABC) i henhold til produsentens anbefalinger (Vector Laboratories). Diamnobenzidine ble brukt som et kromogen og hematoksylin ble brukt for kontra.
Resultater
Utskillelse av funksjonell aktiv PAPPA fra lungekreftceller
Vi først testet hypotesen om den økte plasma konsentrasjonen av PAPPA observert hos lungekreftpasienter [28] skyldes utskillelse av PAPPA direkte fra lungekreftceller. Vi undersøkte proteininnhold og sekresjon av PAPPA i flere brukte ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer i sammenligning med normale humane immortaliserte bronkiale epitel (HBE) cellelinjer. PAPPA innhold i kreftcellelinjer er sammenlignbare (i tilfeller av A549 og Calu-1) eller mindre (i tilfelle av H460, H596, H1299, H1792 og H19444) enn HBE cellelinjer generelt. Imidlertid PAPPA sekresjon fra A549 og H460 er betydelig mer enn HBe-celler som gjenspeiles av betydelige høye nivåer av PAPPA i kondisjonert medium fra disse to cellelinjene. Resultatene antyder PAPPA proteinsekresjon kan være forskjellig mellom HBe-celler og A549, selv om de totale proteinnivåer PAPPA er tilsvarende (Fig. 1A). Således utskilte form av PAPPA fra kreftceller kan bidra til vekst og progresjon av enkelte typer av lungekreft.
(A) PAPPA proteinkonsentrasjon på forskjellige lungecancer cellelinjer (CE) og kondisjonert medium (CM) . Data som vises er gjennomsnittet av to uavhengige analyser i to eksemplarer. (B) IGF avhengig protease aktivitet i kondisjonert medium fra A549 lungekreftceller. Måling av IGFBP proteolytisk aktivitet utføres som beskrevet i Materialer og Metoder. Pilene viser intakt IGFBP4 og 18 kD og 14 kD proteolytiske fragmenter.
For ytterligere adresse hvis skilles PAPPA er funksjonelt aktive, protease aktivitet av PAPPA ble undersøkt ved hjelp IGFBP4 som substrat i kondisjonert medium fra HBE1 og A549 . Som vist i figur 1B, kan kondisjonert medium fra A549 effektivt å degradere IGFBP4 i nærvær av IGF2, noe som indikerer at PAPPA utskilt fra A549 er funksjonelt aktiv. PAPPA i HBE1 verken hemmelighets eller funksjonell fordi ingen IGFBP4 degradering ble observert i det kondisjonerte medium fra HBE1 (Fig. 1B). Tatt sammen, disse resultatene antydet at evnen av kreftceller til hemmelig PAPPA snarere enn celle PAPPA innhold er forbundet med tumorvekst og progresjon. Funksjonell analyse av PAPPA proteolytisk aktivitet på IGF2 avhengig IGFBP4 degradering er bestemt, følsom og pålitelig. Vi brukte denne analysen deretter som middel for å påvise tilstedeværelsen av PAPPA serumfritt medium som rapportert av andre, [26], [27], [30].
Reduksjon av PAPPA sekresjon minsker tumorvekst in vivo i en xenograft modellen, men ikke in vitro i cellekultur
for å vurdere at det utskilte form er viktig for PAPPA å fremme cellevekst vi genererte stabil cellelinje av A549 transduced med lentiviral partikler som inneholder shRNAmir til PAPPA (A549 /PAPPAkd) i mål til knockdown uttrykket og sekresjon av PAPPA. Over 50% nedregulering av PAPPA mRNA er oppnådd i klon # 82 shRNAmir til PAPPA som bekreftes av real-time PCR kvantifisering (Fig. 2A). Viktigere var nesten alle sekresjon av PAPPA fra A549 /PAPPAkd cellene opphevet slik det fremgår av mangelen på protease-aktivitet i kondisjonert medium (Fig. 2B). PAPPA er kjent for å fornedre IGFBP og øke biotilgjengeligheten av IGF
in vivo
. Det er av stor interesse å vite om reduksjon av PAPPA sekresjon vil påvirke cellevekst
in vitro
i cellekultur. Effekten av PAPPA knockdown på A549 cellevekst ble evaluert første
in vitro
sammenlignet med ingen støydempere shRNAmir kontrollceller. Ingen merkbar endring på celleproliferasjon og vekst av A549 /PAPPAkd ble observert
in vitro
i cellekultur tilstand (Fig. 2C). Unnlatelse av å påvise effekten av PAPPA knockdown på cellevekst tyder på at cellekultur
in vitro
kanskje ikke er den rette modellen systemet fordi den ikke har et skikkelig miljø for PAPPA å fungere som protease å øke biotilgjengeligheten av IGF og cellene blir stadig utsatt for mange gratis vekstfaktorer inkludert IGF i dyrkingsmedium. Vi bestemte oss for å undersøke hvilken rolle PAPPA i tumorvekst
in vivo
i xenograft modeller. Som forventet, svulster som genereres fra A549-cellelinjen med PAPPA knockdown (A549 /PAPPAkd) viste signifikant reduksjon av tumorvekst i forhold til kontroll A549-cellelinje (Fig. 3A og B). Den gjennomsnittlige tumor våtvekt av A549 /PAPPAkd ved slutten av eksperimentet var 214 mg, som er betydelig lavere enn 360 mg for (fig. 4C) kontrollgruppen. Samlet utgjør disse resultatene indikerer PAPPA utskilt fra tumorceller spiller en viktig rolle i markedsføringen av lungekreft celleproliferasjon og progresjon
in vivo
.
A549 celler ble transduced med lentiviral partikler som inneholder shRNAmir (# 81 # 82 og # 83) til PAPPA og ikke-tie shRNAmir (SC) og valgt med puromycin. (A) PAPPA mRNA nivåer fra disse cellelinjer fastsatt av real-time PCR kvantifisering og avbildet som relative nivået til ikke-tie kontroll. (B) IGF avhengig protease aktivitet i kondisjonert medium fra Pappa knockdown A549 cellelinjer. (C) Vekstkurve av Pappa knockdown A549-celler linje # 82 og ikke-lyddemping styreledning.
(A) Bilde av tumorstørrelsen ved disseksjon. (B) Vekstkurve av xenograft tumor. Pappa knockdown A549 celler linje A549 /PAPPAkd og ikke-tie kontroll A549sc ble injisert subkutant i 4 uker gammel
nu /nu
atymiske mus som beskrevet i Materialer og metoder. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittlig tumorvolum (mm
3) ± SD (n = 5). (C) Våt tumorvekt ved disseksjon. *:
p
0,05 (student
t
test)
(A) Protein nivåer av PAPPA i H1299 celler over-uttrykker PAPPA.. Pappa nivåer i proteinekstrakter fra H1299 cellelinjer som stabilt transfektert med PAPPA ekspresjonsvektor (H1299 /PAPPAov) og tom kontrollvektor (H1299 /pCR3.1) ble bestemt ved ELISA-sett som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene som vises er gjennomsnitt ± SE av tre bestemmelser. (B) IGF avhengig protease aktivitet i kondisjonert medium fra H1299 /pCR3.1 og H1299 /PAPPAov. (C) Vekstkurve av H1299 /pCR3.1 og H1299 /PAPPAov cellelinjer. Levedyktige celler ved forskjellige tidspunkter ble målt ved CellTiter-Blue som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE av tre bestemmelser av relativ fluorescens enhet (RFU) av tre uavhengige eksperimenter. (D) Protein nivåer av PAPPA i H1792 celler over-uttrykker PAPPA. Pappa nivåer i proteinekstrakter fra H1792 cellelinjer som stabilt transfektert med PAPPA ekspresjonsvektor (H1792 /PAPPAov) og tom kontrollvektor (H1792 /pCR3.1) ble bestemt ved ELISA-sett som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene som vises er gjennomsnitt ± SE av tre bestemmelser. (E) IGF avhengig protease aktivitet i kondisjonert medium fra H1792 /pCR3.1 og H1792 /PAPPAov. (F) Vekstkurve av H1792 /pCR3.1 og H1792 /PAPPAov cellelinjer.
Sekresjon av PAPPA over-uttrykt i cancerceller fremmer tumorvekst i xenograft modell, men ikke in vitro i celleformering
for ytterligere å vurdere rollen til PAPPA uttrykk i lungekreft utvikling, H1299 og H1792 lungekreft cellelinjer som viste et lavt nivå av endogen PAPPA uttrykk, ble valgt for over-uttrykk for PAPPA. Begge H1299 og H1792 celler med stabilt transfektert PAPPA uttrykk vektor (H1299 /PAPPAov og H1792 /PAPPAov) oppnådde omtrent to ganger økning i PAPPA protein nivå i forhold til foreldrevektorkontrollceller (H1299 /pCR3.1 og H1792 /pCR3.1) (fig. 4A og D). Viktigere, kondisjonert medium fra H1299 /PAPPAov cellene var i stand til å spalte IGFBP4 substrat i en IGF2 avhengig måte, mens ingen protease aktivitet ble påvist i foreldrevektorkontrollceller, noe som tyder på at PAPPA var i stand til å bli utskilt fra H1299 /PAPPAov celler og var funksjonelt aktive ( fig. 4B). Under den samme analysen tilstand, kondisjonert medium fra H1792 /PAPPAov celler forårsaket litt degradering av IGFBP4 underlaget, noe som tyder på mangel på PAPPA sekresjon fra H1792 /PAPPAov celler (fig. 4E).
Effekten av PAPPA over-uttrykk på cellevekst ble deretter evaluert i både H1299 /PAPPAov og H1792 /PAPPAov celler. Ingen merkbar endring av cellevekst ble observert i H1299 /PAPPAov celler når sammenlignet med foreldrevektorkontrollcellen, igjen sannsynligvis på grunn av mangel på riktig mikromiljøet i cellekultur tilstand som beskrevet ovenfor (fig. 4C). Interessant, H1792 /PAPPAov celler viste en signifikant reduksjon av cellevekst sammenlignet med dens vektorkontrollceller (fig. 4 F), noe som tyder på at en økning i ikke-hemmelighets, intracellulær PAPPA kan utøve distinkte roller i kreftcellevekst.
i likhet med PAPPA knockdown i A549-celler, er effekten av PAPPA over-ekspresjon ble undersøkt i en xenograft modell. H1299 /PAPPAov celler som over-express og hemmelig pappa, og H1792 /PAPPAov celler som over-express PAPPA uten PAPPA sekresjon ble injisert subkutant i immunmangel NOD /SCID eller
/
athymiske hunnmus, henholdsvis nu nu . Som vist i figur 5, svulster som genereres fra PAPPA overekspresjon cellelinje H1299 /PAPPAov vokste mye raskere enn dens vektorstyreledningen (Fig. 5A og B). Tjuesyv dager etter vaksinasjonen, gjennomsnittlig våtvekt av H1299 /PAPPAov svulster var 630 mg, mens det av H1299 kontrollen var 84 mg (Fig. 5C). Serumnivået av PAPPA fra tumorbærende mus ved slutten av forsøket ble målt i både H1299 /PAPPAov gruppe og den respektive kontrollgruppen. PAPPA serumnivået ble signifikant forhøyet i H1299 /PAPPAov gruppe (Fig. 5D). I motsetning til H1299 /PAPPAov celler, xenograft tumorer fra H1792 /PAPPAov celler vokste mye langsommere enn den vektorstyreledningen (fig. 5E og F). Seksti dager etter inokulering, gjennomsnittlig våtvekt av H1792 /PAPPAov tumor var 112 mg, signifikant mindre enn de 644 mg av tumorvekt avledet fra (fig. 5G) H1792 /pCR3.1 kontrollceller. Resultatene av PAPPA over-uttrykk og ned regulering i lungekreftcellelinjer ble oppsummert i tabell 1. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at utskilt form av PAPPA er avgjørende for dens tumorvekst aktivitet
in vivo
.
(A) Bilde av tumorstørrelse fra H1299 celler på tidspunktet for disseksjon. (B) Vekstkurve av xenograft tumor. H1299 /pCR3.1 og H1299 /PAPPAov celler ble injisert subkutant i 4 uker gamle NOD /SCID hunner. (C) Våt tumorvekt ved disseksjon. (D) PAPPA serumnivå av tumorbærende mus bestemt ved hjelp av ELISA ved slutten av forsøkene. (E) Bilde av tumorstørrelsen fra H1792-celler ved disseksjon. (F) Vekstkurve av xenograft tumor. H1792 /pCR3.1 og H1792 /PAPPAov celler ble injisert subkutant i 4 uker gammel
nu /nu
atymiske mus. (G) Våt tumorvekt ved disseksjon. Tumorstørrelsene ble målt og beregnet som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnittlig tumorvolum (mm
3) ± SD (n = 5). *:
p
0,05; **:.
p
0,01 (student
t
test)
Forbedring av AKT signaltransduksjon i økt tumorvekst av PAPPA
Økt tumorvekst i PAPPA utskillende cellelinjer som kan resultere fra den forbedrede IGF-signalisering forårsaket av degradering av IGFBP4 og dermed øker i biotilgjengeligheten av IGF. For å teste denne hypotesen, ble tumor spredning og apoptose undersøkt ved hjelp av histon H3 som en mitotisk markør og TUNEL analyse for apoptose. Betydelig mer mitotiske celler ble observert i tumorvev fra H1299 /PAPPAov celler enn de fra H1299 /pCR3.1 kontroller. Som for apoptose, ble færre TUNEL-positive celler observert i tumorer fra H1299 /PAPPAov celler enn de fra H1299 /pCR3.1-kontroller (fig. 6). For å bestemme mulige signaltransduksjonsveier hovedsakelig ansvarlige for tumorvekst opprykk, status for fosfor-Akt og fosfor-p43 /44 MAPK kinase ble undersøkt. Som vist i figur 7, var betydelig større mengde av fosfo-Akt-positive celler observert i tumorsnitt fra H1299 /PAPPAov celler enn svulster fra H1299 /pCR3.1 kontrollceller. Dette resultatet ble ytterligere bekreftet ved western blot-analyse ved å bruke protein direkte ekstrahert fra tumorvevet i disse to gruppene. Mengden av fosfor-Akt ble betydelig økt i proteinekstrakter fra H1299 /PAPPAov tumorprøver enn de fra H1299 /pCR3.1 kontrollceller. Ingen merkbar forskjell ble observert av Phospho-p42 /44 MAPK status mellom H1299 /PAPPA og sine kolleger
A, C og E:. Xenografttumorer fra H1299 /pCR3.1 celler; B, D og F:. Xenografttumorer fra H1299 /PAPPAov
Venstre panel: farging for fosfor-Akt (A og B) og fosfor-p42 /44 MAPK (C og D) på svulstvev fra H1299 /pCR3.1-celler (A og C) og fra H1299 /PAPPAov-celler (B og D). Høyre panel: western blot kvantifisering av proteiner knyttet til IGF signaltransduksjonsbane: P-Akt og P-p42 /44 MAPK på proteinekstrakter fra tumorvev. P-. Fosfor-protein
Diskusjoner
Våre resultater indikerer at uttrykk for PAPPA i lungekreftcellelinjer varierer. Den intracellulære nivå av PAPPA protein vises høyere i immortalisert normal human bronkial epitelial generelt enn de fleste av lungekreftceller undersøkes, som vises i samsvar med rapporten at PAPPA kromosomale locus er forbundet med høy frekvens for tap av heterozygositet i ovarietumorer [25 ]. Over-uttrykk for PAPPA i to forskjellige lungekreftceller, H1299 og H1792 på samme proteinnivå, imidlertid ført til ulike utfall. Over-uttrykk for PAPPA i H1299 har noen merkbar effekt på cellevekst
in vitro
men betydelig øker i tumorvekst
in vivo
som xenograft modell. I kontrast, over-uttrykk for PAPPA i H1792 forårsaket merkbar reduksjon av cellevekst både
in vitro Hotell og
in vivo
som xenograft modell. Ved å kontrollere både over-uttrykk cellelinjer har vi funnet at H1299 hemmeligheter funksjonell PAPPA i kondisjonert medium mens H1792 ikke. Selv om H1299 og H1792 kan ha forskjellig genetisk sminke som kan gjøre dem avhengige av forskjellige signaloverføringsveier for vekst, ser det ut til at aktiviteten av PAPPA i markedsføringen av tumorvekst er knyttet til evnen til cellene til hemmelig funksjonell PAPPA. I samsvar med den rolle PAPPA sekresjon i tumorvekst, PAPPA knockdown i A549 resulterte i en signifikant reduksjon i tumorvekst når cellene ble implantert i immun-manglende mus. Den molekylære mekanisme (r) for den inhiberende virkning av intracellulær PAPPA i vekst av H1792 celler som gjenstår å bli definert.
PAPPA fungerer som en IGFBP protease for å styre den lokale konsentrasjon av frie aktive IGF tilgjengelig for sine reseptorer av IGFBP degradering og indirekte øke IGF signalveien. Vår
in vitro Hotell og
in vivo
Resultatene vises i samsvar med denne modellen.
