Abstract
Bakgrunn
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) mutasjons status er de mest verdifulle indikatoren i screening av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) pasienter for tyrosinkinaseinhibitor (TKI) terapi. Nøyaktige, raske og økonomiske metoder for å oppdage EGFR mutasjoner har blitt viktig. Bruken av to mutasjonsspesifikke antistoffer rettet mot delE746-A750 mutasjon i ekson 19 og L858R mutasjon i ekson 21 gjør denne oppgaven mulig, men mangelen på konsensus akseptable kriterier for positive resultater begrenser anvendelsen av dette antistoffet basert mutasjonsdeteksjon.
Metoder
Vi har samlet 399 prøver fra NSCLC pasienter (145 reseksjon prøver, 220 biopsiprøver, og 34 cytologiske prøver) som EGFR mutasjonsstatus hadde blitt oppdaget av TaqMan PCR-analyse. Immunhistokjemisk (IHC) analyser ved bruk av EGFR mutasjonsspesifikke antistoffer ble ansatt for alle prøvene. Etter beising og score, sensitivitet, spesifisitet, positiv prediktiv verdi (PPV) og negativ prediktiv verdi (NPV) ble beregnet i henhold til ulike nivåer av positive karakterer i sammenligning med resultatene av PCR-basert analyse.
resultater
I IHC-baserte analyser, ble 144 tilfeller scoret 0, 104 tilfeller ble scoret 1+, ble 103 tilfeller scoret 2+, og 48 saker ble scoret 3+. Med de molekylære baserte resultater ble satt som «gullstandard», utbredelsen av mutasjon var 6,94% (10/144), 23,08% (24/104), 67,96% (70/103) og 100% (48/48 ), henholdsvis for prøver med score 0, 1+, 2+ og 3+. Når poengsum 3+ ble ansett positiv, spesifisitet og PPV var 100%; hvis bare scorer 0 ble ansett negativ, ble 93,06% NPV oppnådd.
Konklusjon
Pasienter med poengsum 3+ har et perfekt PPV (100%), og kan godta TKI behandling direkte uten molekylær -baserte analyser. Pasienter med stillingen 0 hadde høy NPV (93,06%), som kunne nå 97,22% når deteksjonen av total EGFR ble påført. Men prøver med poengsum 1+ eller 2+ er upålitelig og trenger ytterligere verifisering av EGFR mutasjonsstatus ved molekylærbaserte analyser
Citation. Jiang G, Vifte C, Zhang X, Dong Q, Wang L, Liu Y, et al. (2013) Konstatere et passende diagnostisk algoritme Bruke EGFR mutasjon-spesifikke antistoffer for å oppdage EGFR Status i ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (3): e59183. doi: 10,1371 /journal.pone.0059183
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 18 desember 2012; Godkjent: 12 februar 2013; Publisert: 11 mars 2013
Copyright: © 2013 Jiang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (tilskudd 81071905 og 81272606 til EHW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Siden begynnelsen av bruken av epidermal vekstfaktor-reseptor-tyrosinkinase-inhibitorer (EGFR-TKI) gefitinib og erlotinib for behandling av avansert ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [1], har studier vist at NSCLC pasienter med EGFR-aktive mutasjoner kan ha nytte av TKI behandling [2], [3]. Statusen for EGFR mutasjoner har blitt den beste prediktor for responsen på TKI [4] – [9]. Direkte sekvensering er «gullstandard» metode for påvisning av EGFR mutasjoner. Imidlertid er dens følsomhet forholdsvis lav; Dersom prosentandelen av tumorceller som er 25%, sannsynligheten for et falskt negativt resultat er betydelig større. På grunn av mangel på et tilstrekkelig antall tumorceller som er tilgjengelige for ekstraksjon av høy kvalitet DNA, er sannsynligheten for å få en falsk-negative øket under testing av en liten biopsi eller cytologi prøven. Imidlertid er ca 70% av lungekrefttilfellene diagnostisert ved avanserte stadier hvor små biopsier og cytologiske prøver er den eneste kilden til materialet for diagnose og mutasjonstesting. Nylige fremskritt innen molekylære metoder har aktivert en videreutvikling av mer følsomme metoder for påvisning av mutasjoner. Slike metoder omfatter sanntid kvantitativ polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) ved anvendelse av spesifikke sonder (TaqMan PCR assay), forsterkes ildfast mutasjon system (ARMS) og smelter analyse med høy oppløsning (HRMA) [10] – [14]. Men de er dyre og alltid krever gode eksperimentelle forhold og avanserte instrumenter. Derfor blir de sjelden brukt i ikke-undervisning sykehus.
Immunhistokjemisk (IHC) analyser kan også brukes til å screene for EGFR mutasjoner. Yu et al. utviklede EGFR mutasjon-spesifikke kanin monoklonale antistoffer mot EGFR med den E746-A750 delesjon i exon 19 eller den L858R punktmutasjon som viste god konsistens sammenlignet med molekyl-baserte assays [15] – [26]. Men den praktiske anvendelsen av denne metoden ble sterkt begrenset på grunn av merkbar forskjell i de kriteriene som brukes for positive resultater blant de ulike forskergrupper. Noen forskere scoret data i henhold til fargeintensitet, og delt prøver i fire klassetrinn: 0, 1+, 2+ og 3+. Men noen forfattere forfektet en score over 1+ å bli vurdert positivt, og andre, selv hevdet at en score over 2+ bør scoret positive. Særegenheter av disse to tilnærmingene var relativt tett (96-100%), men deres følsomhet variert mye (47-92%) [15] – [19]. Enkelte forskere har også fått en poengsum for uttrykk ved å multiplisere fargeintensitet med prosentandelen av flekker området (0-300 eller 400), og henholdsvis etterlyste en score på 10 eller 20 å bli kategorisert som positive, men en merkbar forskjell i følsomhet (42,2 til 100%) og spesifisitet (77-100%) ble observert [20] – [22]. Nylig, Kawahara et al. foreslått at farging skal klassifiseres som positive (score på 2+), negativ (poengsum fra 0) eller tvetydige (score på 1+), noe som indikerer tvilsom, negativ eller svak uttrykk, henholdsvis, som kan få en sensitivitet på 81,4%, spesifisitet på 97,5%, positiv prediktiv verdi (PPV) på 94,6%, og negativ prediktiv verdi (NPV) på 90,6% [23]. Konsensus av en universelt akseptert kriterium for «positive» mangler, noe som sterkt hindrer klinisk bruk av EGFR mutasjonsspesifikke antistoff for å oppdage EGFR mutasjoner.
I denne studien, analyserte vi IHC resultatene av 399 prøver av NSCLC som ble bedømt av en fire-gradering metode tar hensyn til intensitet og område av flekker. Vi deretter sammenlignet resultatene med en molekylær-baserte analysen å utforske muligheten for screening for EGFR mutasjoner i NSCLC prøvene ved IHC analyser.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
alle menneskelige vev og celler ble oppnådd i samsvar med menneskelige subjekt forskning protokoller godkjent av Kina Medical University Review Board. Tumor vev og celler ble oppnådd med skriftlig informert samtykke fra voksne pasienter med NSCLC.
Prøve utvalg og molekylær-baserte analysen
Vi har samlet 399 prøver (145 reseksjon prøver, 220 biopsiprøver, og 34 cytologiske prøver) fra NSCLC pasienter som hadde søkt om molekylær-baserte analysen av EGFR mutasjoner i Avdeling for patologi i Kina Medical University (Shenyang, Kina) fra august 2008 til august 2012. alders~~POS=TRUNC av lungekreftpasienter var 26 -89 år (median, 62); Det var 214 menn og 185 kvinner. De histologiske typer var 341 adenokarsinomer, 47 plateepitelkarsinom, og 11 andre typer (tabell 1). EGFR mutasjonstatus for hver prøve ble detektert av TaqMan PCR-analyse. Reseksjon og biopsi vev ble fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin. Supernatantene av pleural effusjon-prøver ble fjernet ved sentrifugering, og de gjenværende cellulære komponenter ble deretter fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin. De parafinblokker ble kuttet med en tykkelse på 8 um for undersøkelse av PCR-baserte EGFR genmutasjoner. Mutasjoner av EGFR-genet ble undersøkt i eksoner 19 og 21 ved hjelp av TaqMan PCR-analyse. Genomisk DNA fra parafininnstøpte vev eller cytologiske prøver ble ekstrahert og renset ved anvendelse av en DNA-mikro QIAamp kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). De primere for mutasjon deteksjon og TaqMan prober rettet mot E746-A750 og L747-P753insS delesjonsmutasjoner i ekson 19, og L858R og L861Q punktmutasjoner i ekson 21 ble kjøpt fra GP Medical Technologies (Beijing, Kina). Den TaqMan PCR-analysen ble utført ved hjelp av en 7900HT Real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster, CA, USA).
IHC analyserer
Parafin blokkene ble kuttet til en tykkelse av 4 mikrometer for farging. Konvensjonell de-voksing og hydrering behandling ble foretatt ved hjelp av xylen og en gradert serie av etanol, henholdsvis. Prøvene ble kokt i et vannbad ved 100 ° C i 20 min i 1 mmol /liter etylendiamin-tetra-eddiksyre (EDTA) ved pH 9,0 og target henting løsning (Dako, Glostrup, Danmark) for å gjenvinne antigener. Intrinsic peroksydase-aktivitet ble blokkert ved behandling med peroksidase blokkerende reagens (Dako) i 15 min ved romtemperatur. De ikke-spesifikke bindingspunkter ble blokkert ved inkubering med normal ikke-immune geiteserum i 15 minutter ved romtemperatur. Etter vasking i Tris-bufret saltvann (TBS; Dako) i 15 min, tre primære antistoffer (dvs., EGFR monoklonalt antistoff (D38B1), delE746-A750-mutasjonen-spesifikt monoklonalt antistoff (6B6) og L858R mutasjon-spesifikt monoklonalt antistoff (43B2) ; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) ble fortynnet separat på 1:400 og lagt til prøvene. Prøvene ble inkubert ved 4 ° C over natten, vasket i TBS i 15 min, og inkubert med merkede polymer-pepperrotperoksidase sekundært antistoff (ChemMate Envision kit; DAKO) i 30 minutter ved romtemperatur. Etter vasking i TBS i 15 minutter, ble platene visualisert ved hjelp av 3,3′-diaminobenzidin.
IHC scoring
IHC farging poengsum var basert på fargeintensitet og prosentandel av flekker området membranen og /eller cytoplasma av tumorcellen. Fire karakterer var ansatt: 0, 1+, 2+, 3+. Zero betegnet ingen flekker; 1+ betegnet lys gul farging med ingen åpenbare partikler eller gule flekker med åpenbare partikler i 10% av tumorceller; 2+ betegnet gule flekker med åpenbare partikler i 10% tumorceller eller brune flekker med åpenbare partikler i 10% av tumorceller; og 3+ betegnet brune flekker med åpenbare partikler i 10% tumorceller. Farging Vurderingen ble utført kun dersom 5 tumorceller var tilstede i en nål biopsi eller cytologi prøven. Alle immunhistokjemiske analyser ble evaluert av tre erfarne etterforskere (YL, JHY og YZ) som var uvitende om pasientenes kliniske tilstander eller patologisk diagnose.
Statistiske analyser
sensitivitet, spesifisitet, PPV og NPV av IHC-baserte analysen ble beregnet ved bruk av molekylær-baserte assay som referanse. Avtalen mellom de 2 teknikkene ble beregnet ved hjelp Cohen κ. Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS 13.0 for Windows.
Resultater
Molecular baserte EGFR mutasjonsstatus av 399 NSCLC prøvene
Totalt 399 NSCLC prøvene ble oppdaget ved hjelp av TaqMan PCR-analyse. En EGFR mutasjon ble påvist i 162 tilfeller (40,6%, 162/399). Dette inkluderte en E19 (E746-A750) sletting mutasjon i 86 tilfeller (21,55%, 86/399), E21 (L858R) punktmutasjoner i 70 tilfeller (17,54%, 70/399), begge E746-A750 og L858R mutasjoner i fire tilfeller E19 (L747-P753insS) delesjonsmutasjoner i 4 tilfeller (1,03%, 4/399), E21 (L861Q) punktmutasjoner i 6 tilfeller (1,5%, 6/399), og ingen mutasjon i 237 tilfeller (59,4%, 237/399). Frekvensen av mutasjoner i reseksjon prøvene var 40,69% (59/145), i biopsiprøver ble 36,82% (81/220), og i cytologiske prøver var 35,29% (12/34).
Komparative analyser av IHC-baserte og molekylær-baserte EGFR mutasjonsstatus
De fargemønstre av EGFR mutasjon-spesifikt antistoff er vist i figur 1. ut av 399 NSCLC prøvene, 144 tilfeller ble scoret 0 (der 10 tilfeller næret EGFR mutasjoner og frekvensen av mutasjoner i denne kategorien var 6,94%, 10/144); 104 saker ble avsluttet 1+ (det var 24 tilfeller av EGFR mutasjoner og frekvensen av mutasjonen var 23,08%, 24/104); 103 saker ble scoret 2+ (EGFR mutasjoner var til stede i 70 tilfeller, og frekvensen av mutasjoner var 67,96%, 70/103); 48 saker ble avsluttet 3+ (48 tilfeller næret EGFR mutasjoner, og frekvensen av mutasjonen var 100%, 48/48). Detaljerte resultater er vist i tabell 2. Prøvene scoret 3+ har et perfekt PPV (100%), og de scoret 0 har en god NPV (93,06%).
representant farging av både histologi og cytologi prøver i NSCLC pasienter (A, D, G og J, reseksjon prøver, 200 ×, B, E, H og K, biopsier, 200 ×, C, F, I og L, cytologi eksemplarer, 400 ×). Fire karakterer var ansatt: 0, 1+, 2+ og 3+. 3+ betegnet brune flekker med åpenbare partikler i 10% tumorceller (A, B og C); 2+ betegnet gul farging med åpenbare partikler i 10% tumorceller eller brun farging med åpenbare partikler i 10% av tumorceller (D, E og F); 1+ betegnet lys gul farging med ingen åpenbare partikler eller gule flekker med åpenbare partikler i 10% av tumorceller (G, H og I); Zero betegnet ingen farging (J, K og L).
Avtalen mellom IHC-baserte og molekylærbaserte analyser i samsvar med ulike nivåer av positive karakterer ble beregnet ved hjelp av Cohen κ. Når gruppene med score på 0 eller 1+ ble vurdert som negative, og de med score på 2+ eller 3+ ble vurdert som positive, avtalen mellom 2 forskjellige deteksjonsmetoder var høyest (κ = 0,644). Imidlertid vil det være 24 falske negative tilfeller (23,08%, 24/104) i gruppen av poengsummen 1+ og 33 falske positive tilfeller (32,04%, 33/103) i det av partituret 2 +, noe som resulterer i en følsomhet fra 77,63%, spesifisitet på 86,64%, PPV av 78,14%, og NPV av 86,4% for påvisning av immunhistokjemi. Ingen av disse verdiene var ideell (vist i tabell 3).
Med molekyl testing som en standard, delE746-A750-mutasjonen-spesifikt antistoff (6B6) kunne detektere 69 av de 86 tilfeller med en E746 -A750 sletting mutasjon (40 med poengsum 2+ og 29 med resultatet 3+), mens den var negativ i de resterende 17 tilfeller (4 med stillingen 0 og 14 med resultatet 1+) (κ = 0,584, følsomhet: 80,23%, spesifisitet: 85,3%, PPV: 60%, NPV: 94,01%); den L858R mutasjon-spesifikt antistoff (43B2) kunne identifisere 53 av 70 tilfeller med en L858R punktmutasjon (31 med poengsum 2+ og 22 med 3+), mens den var negativ i de resterende 17 tilfeller (7 med stillingen 0 og 10 med poengsum 1+) (κ = 0,639, følsomhet: 75,71%, spesifisitet: 91,79%, PPV: 66,25%, NPV. 94,67%)
i tillegg har vi også oppdaget total EGFR i alle 399 tilfeller bruker monoklonalt antistoff mot EGFR. Resultatene viste 27 tilfeller ble scoret 0, 38 tilfeller ble scoret 1+, 193 tilfeller ble scoret 2+, og 141 tilfeller ble scoret 3+. EGFR monoklonalt antistoff (D38B1) er forskjellig fra de to mutasjonsspesifikke antistoffer. DelE746-A750-mutasjonen-spesifikt antistoff (6B6) kan spesifikt gjenkjenne EGFR-proteinene med en E746-A750 slettingsmutasjon i exon 19, og L858R mutasjonsspesifikke antistoff (43B2) er i stand til å spesifikt identifisere EGFR-proteinet med en L858R punktmutasjon i ekson 21; i motsetning til dette EGFR-monoklonalt antistoff (D38B1), som ikke er en mutasjon-spesifikt antistoff, viser totalt EGFR-proteinet, uavhengig av mutasjonen status. Selv om total EGFR ble sterkt uttrykt i de fleste tilfeller var det fortsatt 38 tilfeller med poengsum 1+ og 27 tilfeller med stillingen 0, hvor 12 saker ble testet positivt for EGFR genmutasjoner av molekylær metode. Dette kan forklares ved det faktum at nivåene av total EGFR i tumorceller som er så lave, at farging av de to mutasjonsspesifikke antistoffer kan være negativ i noen tilfeller, selv om de har EGFR genmutasjoner som detekteres (som vist i figur S1). Derfor detektering av nivået av total EGFR ved hjelp av EGFR-monoklonale antistoff (D38B1) kunne hindre fremveksten av tilsvarende falske negative resultater over, mens følsomheten delE746-A750 og L858R mutasjonsspesifikke antistoffer kunne økes til 82,56% og 90% henholdsvis.
komparativ analyse av IHC-baserte resultatene av reseksjon, biopsi og cytologi prøver
de fargemønstre av reseksjon prøver ved hjelp av EGFR mutasjon-spesifikke antistoffer ble vist i figur 2. i henhold til vår scoring kriterier, av reseksjon prøvene 145, 52 ble scoret 0, hvor 2 tilfeller næret EGFR mutasjoner og mutasjonsraten var bare 3,85% (2/52); 40 saker ble scoret 1+, der var det 10 tilfeller av EGFR mutasjoner og mutasjonsraten var 25% (10/40); 35 saker ble scoret 2+, hvor EGFR mutasjoner var til stede i 29 tilfeller, og mutasjonsraten var 82,56% (29/35); 18 saker ble scoret 3+, hvor 18 saker næret EGFR mutasjoner, og mutasjonsraten var 100% (18/18). De detaljerte resultatene ble vist i Tabell 2.
Den totale EGFR-proteinet i reseksjon prøvene kan være farget med EGFR (D38B1) antistoff (A, D og G, 200 ×). Prøvene uten EGFR mutasjoner ble ikke farget med to mutasjonsspesifikke antistoffer (B og C, 200 x). Prøver med E746-A750 sletting mutasjon ble farget med E746-A750 sletting (6B6) spesifikt antistoff (E, 200 ×) og prøver med L858R mutasjon ble farget med L858R mutant (43B2) spesifikt antistoff (I, 200 ×).
flekker funksjonene i biopsiprøver ved hjelp av EGFR mutasjon-spesifikke antistoffer ble vist i figur 3. i henhold til våre scoring kriterier, av de 220 reseksjon prøvene, ble 77 tilfeller scoret 0, der seks næret EGFR mutasjoner og mutasjonsraten var 7,79% (6/77); 55 saker ble scoret 1+, der 10 tilfeller næret EGFR mutasjoner og mutasjonsraten var 18,18% (10/55); 60 saker ble scoret 2+, hvor 37 næret EGFR mutasjoner, og mutasjonsraten var 61,67% (37/60); 28 saker ble scoret 3+, hvor 28 saker næret EGFR mutasjoner, og mutasjonsraten var 100% (28/28). De detaljerte resultatene ble vist i Tabell 2.
Den totale EGFR-proteinet i biopsiprøver kan bli beiset med EGFR (D38B1) antistoff (A, D og G, 40 × og øvre venstre hjørne 200 ×). Prøver uten EGFR mutasjoner ble ikke farget med to mutasjonsspesifikke antistoffer (B og C, 40 × og øvre venstre hjørne 200 ×). Prøver med E746-A750 sletting mutasjon ble farget med E746-A750 sletting (6B6) spesifikt antistoff (E, 40 × og øvre venstre hjørne 200 ×) og prøver med L858R mutasjon ble farget med L858R mutant (43B2) spesifikt antistoff (I, 40 × og øvre venstre hjørne 200 ×).
flekker funksjonene i cytologiske prøver ved hjelp av EGFR mutasjon-spesifikke antistoffer ble vist i figur 4. Ifølge våre scoring kriterier, av de 34 cytologiske prøver, 15 saker ble scoret 0, hvor 2 tilfeller næret EGFR mutasjoner og mutasjonsraten var 13,33% (2/15); 9 tilfeller ble scoret 1+, der 4 tilfeller hadde EGFR mutasjoner og mutasjonsraten var 44,44% (4/9); 8 saker ble scoret 2+, hvor fire inneholdt EGFR mutasjoner, og mutasjonsraten var 50% (4/8); 2 tilfeller ble scoret 3+, hvor 2 tilfeller næret EGFR mutasjoner, og mutasjonsraten var 100% (2/2). De detaljerte resultatene er vist i tabell 2.
Den totale EGFR-proteinet i cytologiprøvene kan være farget med EGFR (D38B1) antistoff (A, D og G, 400 ×). Prøvene uten EGFR mutasjoner ble ikke farget med to mutasjonsspesifikke antistoffer (B og C, 400 x). Prøve med E746-A750 sletting mutasjon ble farget med E746-A750 sletting (6B6) spesifikt antistoff (E, 400 ×) og prøver med L858R mutasjon ble farget med L858R mutant (43B2) spesifikt antistoff (I, 400 ×).
Når poengsum 3+ ble ansett å være positiv, spesifisitet og PPV i IHC-baserte analysen var 100% for alle tre typer prøver. Når stillingen 0 ble ansett for å være negativ, de reseksjon prøvene resulterte i det høyeste NPV (96,15%), fulgt av biopsier (92,21%), og cytologi prøvene hadde lavest NPV (88.24%). Når Karakter 0 og 1+ ble ansett for å være negativ og scorer 2+ og 3+ vurderes som positivt, det spesielle ved reseksjon prøvene hadde høyest NPV (93,02%), fulgt av biopsier (83,45%), og cytologi prøvene hadde den laveste NPV (81,82%) (tabell 3).
det var 12 pasienter med både reseksjon og cytologi eksemplarer i våre prøver, og 6 av dem næret EGFR mutasjoner (3 tilfeller av E746-A750 sletting mutasjon og 3 tilfeller av L858R punktmutasjon) av molekylær-baserte analysen. Ved IHC-baserte analysen på reseksjon prøvene ble fire av de 6 prøvene med EGFR mutasjoner identifisert som å ha score på 3+, og den andre to ble identifisert som å ha en score på 2+. I motsetning til på cytologiske prøver, bare ett tilfelle hadde en score på 3+ og en sak hadde en score på 2+, og de andre 4 tilfeller var alle poengsum 1+. I de 6 prøvene uten en EGFR mutasjon, bare ett tilfelle hadde en score på 1+ ved IHC-baserte analysen på reseksjon prøver, og de andre fem prøver hadde en score på 0. I kontrast til resultatene på de tilsvarende cytologiske prøver inkludert en score på 2+ i en sak, poengsum 1+ i en sak, og scorer 0 i de andre 4 tilfeller (tabell 4).
Diskusjoner
EGFR mutasjoner kan oppdages i NSCLC ved IHC metoder ved hjelp av EGFR muterte spesifikke antistoffer. Men på grunn av de vesentlige forskjeller mellom de kriteriene for positivitet er definert av forskjellige forskningsgrupper, leserne eller diagnosticians kan forveksles med eller til og med villedet med i forhold til en praktisk anvendelse av denne metoden. Derfor er en mer omfattende forskning er nødvendig for å oppnå en konsensus. Resultatene av denne studien og andre rapporter [15] – [19], [23] tyder på at scoring kriterier basert på fargeintensitet av membranen og /eller cytoplasma av tumorceller og prosentandelen av fargingen området (som ble delt i fire klassetrinn: 0, 1+, 2+ og 3+) kan være den beste av alle tilgjengelige scoring systemer. Avtalen mellom IHC-baserte og molekylær-baserte analyser ble beregnet ved hjelp av Cohen κ i samsvar med forskjellige nivåer av immunhistokjemisk gradering. Selv om avtalen mellom de 2 testmetodene var høyest (κ = 0,644) når resultatet 2+ og 3+ ble vurdert som positive, var det fortsatt 33 falske positive tilfeller (32,04%, 33/103) i rille 2 + saker og 24 falske negative tilfeller (23,08%, 24/104) i rille 1+ tilfeller, noe som resulterer i en sensitivitet på 77,63%, spesifisitet på 86,64%, PPV av 78,14%, og NPV av 86,4%, noe som var ideelt. Derfor, med en molekyl testen som en standard, selv om en prøve bedømmes som positive ved IHC metode, molekylær-baserte analysen kan likevel være nødvendig for å bekrefte EGFR mutasjonstatus, og således screening av EGFR mutasjoner ved IHC synes ikke å være aktuelt. Selv om antallet falske positive tilfeller har vært svært få i andre studier [15] – [19], noe som ytterligere molekylær påvisning kan ikke være helt forlatt. I denne studien ble det registrert at prøver med en score på 3+ hadde en perfekt PPV (100%), og scorer 0 prøvene hadde en god NPV (93,06%). Hvis en score på 3+ er ansett for å være et positivt kriterium, kan pasienter med positive prøvene etter IHC-baserte analysen direkte motta TKI behandling uten behov for verifisering av en molekylær test. Anvendeligheten av TKI terapi kunne bli vurdert raskt ved immunhistokjemi hjelp EGFR mutasjon-spesifikke antistoffer i nesten 50% av alle pasienter (de scoret som 0 eller 3+). Sjansen for mutasjoner i prøver med en score på 1+ var ca 23,08%, og en sannsynlighet for ingen mutasjon i dem var 76,92%, ifølge vår analyse. Frekvensen av mutasjon i prøvene med en score på 2+ var 67,96%, sterkt antyder muligheten for en EGFR mutasjon i denne gruppen. Deretter hvis det brukes riktig, screening EGFR mutasjonsstatus ved immunhistokjemi kan ha en diagnostisk verdi for terapeutisk beslutningsprosesser, spesielt i et medisinsk senter som ikke har en kapasitet på molekylær testing.
Som anbefalt Wu et al. [22], et uttrykk for total EGFR ble også testet i alle 399 tilfeller i vår studie. I motsetning til de to mutasjonsspesifikke antistoffer, EGFR-monoklonalt antistoff (D38B1) identifiserer den totale EGFR-proteinet, uavhengig av mutasjonen status. Fordi nivåene av total EGFR i visse tilfeller er meget lav, kan det mutante proteiner ikke kan oppdages ved hjelp av to mutasjonsspesifikke antistoffer, selv om de tilfellene Harbor muterte EGFR-genet (som vist i figur S1). Ikke desto mindre, ved hjelp av EGFR-monoklonale antistoff (D38B1) i kombinasjon med mutasjonsspesifikke antistoffer sannsynligvis redusert falsk-negative resultater pr vår analyse. Med denne tilnærmingen, kan følsomheten delE746-A750 og L858R mutasjonsspesifikke antistoffer økes til 82,56% og 90% henholdsvis. Sensitiviteten av L858R mutasjonsspesifikke antistoff (43B2) synes høyere enn delE746-A750 mutasjon-spesifikt antistoff (6B6), som er konsistent med det som er blitt rapportert av Ambrosini-Spaltro A et al [16].
i tillegg har vi foretatt en sammenlignende analyse av IHC-baserte resultatene på reseksjon, biopsi og cytologiske prøver. Når en score på 2+ ble ansett å være positiv, frekvensen av falske positive verdier for reseksjon prøvene var bare 17,14% (6/35), mens satsene for falske positive verdier for biopsier og cytologiske prøver var 38,33% (23 /60) og 50% (4/8), respektivt. Dette funnet antydet at, på grunn av den mindre mengde av vev og tumorceller enn reseksjon prøver, kan heterogeniteten av tumorceller i biopsi eller cytologiske prøver som blir mer fremtredende, og således føre til en øket variasjon av testresultatene. I tillegg til det begrensede antall av tumorceller i pleuralvæske (cytologi prøven), sammensetningen av cellulære komponenter var mer komplisert, noe som ofte inneholder mange røde blodlegemer, inflammatoriske celler og mesothelial celler, og således fortynner tumorcellene. Selv om cytologiske prøver som kan brukes for både molekylære baserte og IHC-baserte analyser, tenderer den sistnevnte analyse for å vise mer falske negative verdier, sammenlignet med vevsprøver (spesielt når sammenlignet med reseksjon prøver). Dette kan forklare et markert nedsatt følsomhet av mutant deteksjon i cytologiske prøver (tabell 3). I tillegg har vi undersøkt 12 tilfeller med både reseksjon og cytologi prøver samlet. Av disse seks næret EGFR mutasjoner ved molekylær-baserte analysen og den andre 6 ikke. Når resultatet 3+ ble anvendt som en terskel, kan IHC-baserte analysen å identifisere 4 av de 6 prøver med EGFR mutasjoner i reseksjon prøver, men detektere bare ett eksempel på cytologiske prøver. Hvis poengsummen ≥2 + ble brukt, kan analysen identifisere alle de 6 tilfeller med EGFR mutasjoner i reseksjon prøver, men registrerer bare 2 av de 6 tilfeller i cytologiske prøver. Disse resultater antyder at, med hensyn til IHC basert deteksjon av EGFR mutasjoner, reseksjon prøver var mye bedre enn biopsiprøver, og biopsiprøver var betydelig bedre enn cytologiske prøver.
I teorien EGFR proteiner på cellemembran eller i cytoplasma spiller ulike roller i tumorceller og har ulik interaksjon med TKI. Men behandlingseffekter av TKI hos pasienter som viser en annen subcellulære fordeling av EGFR i tumorceller har ikke blitt godt undersøkt ennå. Som rapportert tidligere, observerte vi at EGFR kunne finne på tumorcellemembraner, i cytoplasma eller både på membranen og i cytoplasma av immunohistokjemisk analyse. For å bestemme de funksjonelle trekk ved forskjellige subcellulære fordelinger i EGFR-proteiner, vi forsøkt å analysere en mulig korrelasjon mellom EGFR mutasjonstatus og subcellulære fordeling av proteinene, men fant ut ingen sammenheng mellom dem. I stedet viser fargeintensitet en sterk sammenheng med EGFR mutasjonsstatus. Derfor er fargingen av «membranen og /eller cytoplasma» er like og i fellesskap vurdert i vårt poengsystem.
Den høye aktivitet av EGFR-protein i lungekreft skyldes aktiverings mutasjoner, men genet kan amplifikasjoner også spille en betydelig rolle. I denne studien ble saker 334/399 (83,7%) av NSCLC vist å ha forhøyet ekspresjon av EGFR-protein (≥2 +) ved å bruke monoklonalt antistoff, den hastighet som er mye høyere enn standard-deteksjon ved genetisk nivå (40,6%). Det gjenstår å bli ytterligere undersøkt om denne forhøyet ekspresjon av EGFR i noen tilfeller uten påviselige mutasjoner er formidlet ved ampification av dets gen eller andre alternative mekanismer. Hvorvidt den TKI kan empirisk brukes til disse pasientene må verifiseres av flere eksperimentelle studier og kliniske studier.
I sammendraget, ifølge våre analyser av EGFR mutasjonsstatus ved IHC, pasienter med en score på tre + hadde et perfekt PPV (100%), og kan ta imot den TKI behandling direkte uten behov for en bekreftende molekylær-baserte analysen. Pasienter med en score fra 0 hadde en høy NPV (93,06%). Men prøver med poengsum 1+ eller 2+ er upålitelig og trenger ytterligere verifisering av EGFR mutasjonsstatus ved molekylær-baserte analysen. Derfor, ved hjelp av vår diagnostiske algoritmen, i nesten halvparten av alle pasienter (pasienter med score 0 eller 3+), kan en anvendelse av TKI behandling bestemmes ved immunhistokjemi og mer komplisert, dyrt molekylær test unngås. Prøver med stillingen 0 i IHC-baserte analysen med de to EGFR mutasjon-spesifikke antistoffer bør derfor ytterligere undersøkt for ekspresjon av total EGFR ved hjelp av EGFR-monoklonalt antistoff (D38B1), for ytterligere å redusere den feilaktig negative klassifiseringen (figur 5). Ta sammen, sammenlignet med ved hjelp av IHC-baserte analysen alene, denne integrerte metode som kombinerer IHC- og molekylbaserte analyser viser en høyere sensitivitet (97,37%), spesifisitet (100%) og κ verdi (0,979), og er derfor mer praktisk for pasientene screenet for en mulig TKI terapi. Vår diagnostisk algoritme kan potensielt optimalisere terapeutiske muligheter, redusere kostnader og spare tid.
«IHC» refererer til immunhistokjemiske analyser.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Den falske negative mutasjon resultatene av IHC på grunn av det lave nivået av total EGFR. Nivået av total EGFR i tumorceller var så lav (A og D, 200 x) som mutante proteiner var upåviselig med mutasjonsspesifikke antistoffer i visse tilfeller (B, C, E og F, 200 x), selv om mutasjonene var identifisert av molekylær-baserte analysen i de tilfeller
doi:. 10,1371 /journal.pone.0059183.s001 plakater (TIF)
Takk
studien ble gjennomført i henhold til forskrift av de institusjonelle gjennomgang styrene ved Kina Universitetssykehus.
