Abstract
Sagopilone, en optimalisert helsyntetisk epotilon er en microtubule stabiliserende stoff som har vist høy
in vitro Hotell og
in vivo
aktivitet mot et bredt spekter av menneskelige tumormodeller. Vi analyserte differensial virkningsmekanismen til sagopilone i ikke-småcellet lungekreft cellelinjer
in vitro
. Sagopilone hemmet spredning av ikke-småcellet lungekreft cellelinjer på lavere nanomolar konsentrasjon. Behandlingen med sagopilone forårsaket sterke forstyrrelser i mobilnettet cytoskeletal organisasjon. To konsentrasjonsavhengig fenotyper ble observert. På 2,5 nM sagopilone eller 4 nM paclitaxel en aneuploid fenotype oppstå mens en mitotisk arrest fenotype ble indusert med 40 nM sagopilone eller paclitaxel. Interessant, behandling med 2,5 nM sagopilone effektivt hemmet celledeling, men – i forhold til høye konsentrasjoner (40 Nm) – bare marginalt indusert apoptose. Behandling med et høyt forhold til en lav konsentrasjon av sagopilone eller paclitaxel regulerer en ikke-overlappende sett av gener, noe som indikerer at begge fenotyper i det vesentlige skiller seg fra hverandre. Gener involvert i G2 /M fase overgang og spindelenheten sjekkpunkt, som Cyclin B1 og BUBR1 ble oppregulert ved behandling med 40 nM sagopilone. Uventet, også gener involvert i DNA-skade respons ble oppregulert under denne behandlingen. I motsetning til behandling av A549 celler med en lav konsentrasjon av sagopilone avslørte en oppregulering av direkte transcriptional målgener av TP53, som CDKN1A, MDM2, GADD45A, FAS. Knockdown av TP53, som inhiberte den transkripsjonelle induksjon av TP53 målgener, førte til en signifikant økning i apoptose-induksjon i A549-celler ved behandling med en lav konsentrasjon av sagopilone. Resultatene indikerer at aktivering av TP53 og nedstrøms effektorer som CDKN1A ved lave konsentrasjoner av sagopilone er ansvarlig for den relative apoptoseresistens av A549-celler, og kan representere en mekanisme for motstand mot sagopilone
relasjon:. Winsel S, Sommer A, Eschenbrenner J, Mittelstaedt K, Klar U, Hammer S, et al. (2011) Molekylær Virknings og rolle TP53 i Sensitivitet til Novel epothilon Sagopilone (ZK-EPO) i A549 ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 6 (4): e19273. doi: 10,1371 /journal.pone.0019273
Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA
mottatt: 19 august 2010; Godkjent: 31 mars 2011; Publisert: 29 april 2011
Copyright: © 2011 Winsel et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble finansiert av Bayer Healthcare (www.bayerhealthcare.com). Finansiører hadde en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, og utarbeidelse av manuskriptet. Alle forfatterne er ansatte eller tidligere ansatte i Bayer Healthcare. Gi støtte i detalj: S. Winsel, J. Eschenbrenner, K. Mittelstaedt mottatt kommersielle forskningsstøtte fra Bayer Healthcare; A. Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann er nåværende eller tidligere arbeiderne av Bayer Healthcare og hold patenter på Bayer Healthcare samt aksjer på Bayer
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journal politikk og har følgende konflikter: selskapet hadde en rolle i denne studien i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet. Alle forfatterne er ansatte eller tidligere ansatte i Bayer Healthcare. Gi støtte i detalj: S. Winsel, J. Eschenbrenner, K. Mittelstaedt mottatt kommersielle forskningsstøtte fra Bayer Healthcare; A. Sommer, U. Klar, S. Hammer, J. Hoffmann er nåværende eller tidligere arbeiderne av Bayer Healthcare og hold patenter på Bayer Healthcare samt aksjer på Bayer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall på verdensbasis, så det er ofte bare diagnostisert ved avanserte stadier og viser en høy grad av motstand mot kjemoterapeutiske regimer som brukes. [1] – [5]. Sagopilone (SAG) er en helsyntetisk epothilon, nå i klinisk utvikling som var optimalisert for å overvinne begrensninger ofte forbundet med taxaner, konvensjonelle tubulin-bindemidler (låns-TBAer) som for eksempel MDR medierte resistente mekanismer [6]. SAG har vist høy
in vitro
og
in vivo
aktivitet i en rekke tumormodeller sammenlignet med paclitaxel (PAC) og andre vanlig anvendte kjemoterapeutiske midler [6]. Med observert sterk anti-tumor aktivitet i NSCLC (ikke-småcellet lungekreft) cellelinjer
in vitro Hotell og primære humane NSCLC mus xenograft modeller, kan SAG gi en potensiell ny behandling muligheten for NSCLC [7].
Flere studier beskriver prediktive markører for respons for NSCLC-cellelinjer, som uttrykk for den excision reparasjon kryss-komplementering gruppe 1 (ERCC1) genet for platinaforbindelser [8] eller epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)-mutasjonsstatus for EGFR tyrosin-kinase hemmere (gefitinib og erlotinib) [9]; [10]. Med hensyn til motstand mot låns-TBAer, viste rapporter på cellelinjer som er valgt for PAC motstand gjennom langvarig kultur i nærvær av stoffet økte nivåer av TUBB3 (beta III tubulin) proteinekspresjon [11]. I motsetning til deres patupilone (epotilon B) bestandig motstykke, inkubert på samme måte, viste lav TUBB3 proteinekspresjon [11]. Disse dataene tyder på at TUBB3 bidrar til mobil motstand mot PAC, men ikke til epothilon. Som en konsekvens er det behov for andre markører som kan forutsi SAG respons.
Mutasjoner i tumor-suppressor-gener, som spiller en sentral rolle i cellulær respons til DNA-skade, cellesyklusregulering, og apoptose [12] , ble funnet i omtrent 50% av alle tilfeller NSCLC [13]. Imidlertid har rollen som TP53 som svar på låns-TBAer som PAC blitt omstridt: Noen grupper rapporterte ingen sammenheng mellom TP53 mutasjonsstatus og følsomhet for PAC [14]; [15], mens andre observert at mangel på TP53 aktivitet resulterte i økt kjemosensitivitet til PAC [16]; [17]. Disse funnene tyder på at TP53 mutasjonsstatus og endret TP53 aktivitet kan påvirke følsomheten av celler til SAG. For å løse dette spørsmålet, har vi analysert påvirkning av TP53 på evnen til SAG å indusere apoptose i en NSCLC modell
in vitro
.
Identifiseringen av stratifisering biomakers eller narkotika eller narkotika mål -relaterte responsmarkører kan betraktelig forbedre utfallet av behandlingen, og vil føre til en dreining mot mer skreddersydd behandling mot spesifikke sykdomstyper [18]. Den optimale behandling for pasienter som lider av NSCLC vil i økende grad avhengige av biomarkør-analyse for å identifisere pasientpopulasjonen som vil dra mest nytte en viss mono- eller kombinasjonsbehandling. Likevel biomarkør identifisering og validering er fortsatt en stor utfordring [19], og det er derfor viktig å følge utviklingen av nye terapeutiske midler for pasienter med NSCLC med forskning på pasientutvelgelse og identifisering og validering av kliniske biomarkører som predikerer respons. Som en del av denne prosessen, er det viktig å forstå hvordan aktiviteten til lovende nye agenter er påvirket av endringer i viktige cellulære trasé, og vice versa.
Målet vårt translasjonsforskning programmet var å undersøke aktiviteten til SAG
in vitro
i et panel av NSCLC cellelinjer, for ytterligere å analysere sin virkningsmekanisme og å sammenligne det med virkningene av PAC og å undersøke mulige resistensmekanismer samt respons basert på genuttrykk profilering.
Materialer og metoder
Cells og forbindelser
Menneskelige lungekarsinom cellelinjer (A549, NCI-H1437, NCI-H23, NCI-H522, NCI-H226, NCI- H460) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC) og dyrket i henhold til anbefalte protokoller. SAG ble syntetisert på Bayer Healthcare Laboratories gjennom totalsynteser. PAC ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (München, Tyskland). Den pan-caspase inhibitor ZVAD.fmk ble kjøpt fra Bachem, (Heidelberg, Tyskland). Alle medier og kosttilskudd for cellekultur ble kjøpt fra Biochrom AG (Berlin, Tyskland). Stamløsninger ble fremstilt som tidligere beskrevet [20]. For valg av stabilt transduserte cellelinjer Hygromycin ble innkjøpt fra Roche (Mannheim, Tyskland).
Tumor celleproliferasjonsanalyse
Virkningen av SAG eller PAC på proliferasjonen av lungekreft ble vurdert ved anvendelse av en celleproliferasjonsanalyse basert på farging av cellene med krystallfiolett som tidligere beskrevet [20]. IC50 verdier ble beregnet ut fra tre uavhengige eksperimenter ved hjelp av Sigmaplot programvare (SPSS, Friedrichsdorf, Tyskland).
In vitro
analyse av effekter på cytoskjelettet, cellesyklus og apoptose
A549 celler ble inkubert med bærer (ethanol 0,1%), 2,5 nM og 40 nM SAG i 20 timer, fiksert med 4% paraformaldehyd og farget med et monoklonalt muse anti-α-tubulin-antistoff (1:1000) (Sigma-Aldrich ), Alexa Fluor® 488 bundet geit anti-mus IgG sekundært antistoff (1:250) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA) og DRAQ5 (Biostatus, Leicestershire, UK), ifølge standardprotokoller. Faste og fargede celler ble analysert ved hjelp av en Zeiss LSM 510 META mikroskop (Carl Zeiss AG, Jena, Tyskland) er utstyrt med en Plan-Apochromat® 63x /1.4 (olje DIC) objektiv. Zeiss LSM-programvare (versjon 3.0 SP3) ble ansatt for confocal bildebehandling.
fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) analyse ble utført for å bestemme cellesyklus distribusjon av SAG- eller PAC-behandlede celler. Celler ble inkubert med SAG ved de indikerte konsentrasjoner eller kjøretøy i 18 timer, fiksert med 70% etanol og farget med 50 ug /ml propidiumjodid (PI) (Sigma-Aldrich). Cellular DNA ble bestemt ved flowcytometri bruk av BD FACSCalibur ™ (Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, USA) og data ble analysert med Cellquest ™ programvare (Becton, Dickinson and Company) den. For å undersøke apoptose ved FACS, ble A549-cellene inkubert kontinuerlig i 72 timer med de angitte konsentrasjoner av SAG eller kjøretøy, trypsinert og farget med DiOC
6 (3) (3,3′-dihexyloxacarbocyanine jodid) (Invitrogen Inc.) og PI som beskrevet tidligere [21].
Kvantitativ real-Time PCR og Western blot
RNA ble ekstrahert ved hjelp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), cDNA ble generert ved hjelp av Super First Strand Synthesis System (Invitrogen Inc.). Real-time PCR ble utført med genuttrykk essay fra Applied Biosystems: p21 (# Hs00355782_m1), TP53 (# Hs00153340_m1), cyclin B1 (# Hs00259126_m1), BUBR1 (Hs00176169_m1), FAS (Hs00163653_m1), GADD45A (Hs00169255_m1), MDM2 ( Hs00242813_m1), og HPRT (# 4326321E) som endogent kontroll. Reaksjonene ble satt opp i tre paralleller med TaqMan FAST Universal PCR Mastermix og registreres i en 7500 Fast Real-Time PCR-System (Applied Biosystems). Den relative ekspresjon av hvert gen ble kvantifisert i henhold til sammenligningsterskelsyklusen metode (ΔΔ
Ct-metoden) med like forsterknings virkningsgrad på målet og den endogene kontroll.
Proteiner ble ekstrahert ved bruk av M-PER Mammalian Protein Ekstraksjonsreagens (Pierce, Perbio Science, Bonn, Tyskland). Proteinkonsentrasjonene i lysatene ble bestemt med BCA Protein Assay Kit (Pierce) i henhold til produsentens instruksjoner. Like mengder av proteiner ble separert på en 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) i en XCell Surelock elektroforese kammer (Invitrogen) som er fylt med MOPS-SDS buffer og overført til en PVDF-membran (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. Etter blokkering av uspesifikke bindingsseter, ble membranen undersøkt med antistoffer spesifikke for CDKN1A (Abcam, # 16767), TP53 (BD Pharmingen, # 15801A), BUB1B (BD Transduction Laboratories, # 612502), cyclin B1 (BD Pharmingen, # 554176 ), γH2AX (upstate, # 05-636), PARP (BD Pharmingen, # 551024), fosfor-Ser /Thr-MPM-2 (upstate # 05-368), og GAPDH (Advanced immun, # RGM2 /Clone 6C5) som lasting kontroll.
RNA ekstraksjon for genekspresjonsanalyser
A549 celler ble sådd i 10 cm cellekulturplater og lov til å feste natten. Cellene ble deretter behandlet med medium som inneholdt enten 2,5 nM SAG, 40 nM SAG, 4 nM PAC eller 40 nM PAC, henholdsvis bærer (etanol 0,1%), eller forble ubehandlet i 18 timer. Total RNA ble ekstrahert ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) som inkluderer en DNase I (Qiagen) trinn for å eliminere genomisk DNA. Total RNA ble sjekket for integritet ved hjelp av RNA LabChips på Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, USA) og konsentrasjonen ble bestemt på en Nanodrop spektrofotometer (Peqlab, Erlangen, Tyskland). Alle RNA prøver hadde høyt RNA integritet tall [22] større enn 9,5.
Affymetrix GeneChip® analyse
The One-Cycle Eukaryote Target Merking Kit (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA ) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet ble 2 pg av høy kvalitet total RNA ble revers-transkribert ved å bruke en T7-merket oligo-dT primer for den første-tråd cDNA syntese reaksjon. Etter RNase H-mediert andre-tråd cDNA syntese, dobbelt-trådet cDNA ble renset og tjente som templat for den etterfølgende
in vitro transkripsjon
reaksjon som genererer biotin-merket komplementært RNA (cRNA). Det biotinylerte cRNA ble deretter ryddet opp, fragmentert og hybridisert til Genechip HGU133Plus2.0 uttrykk arrays (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA.), Som inneholder 54675 probe sett. De GeneChips ble vasket og farget med streptavidin-fysoerytrin på Genechip lufthåndtering Station 450 (Affymetrix). Etter vasking ble arrays skannet på Affymetrix Genechip 3000 skanner med autolasteren. Totalt 30 HGU133Plus2.0 matriser ble behandlet med n = 5 biologiske replikater for alle behandlingsgrupper.
Expression-analyser ble utført med den ekspresjonistiske Pro 4.0-programvaren (Genedata AG, Basel, Sveits). Kvaliteten på datafiler (CEL-format) som inneholder sonde nivå uttrykk data ble kontrollert og raffinert ved hjelp av den ekspresjonistiske raffinerikapasitet programvare (Genedata AG). Raffi prosessen ble utført ved gruppering av prøvene på funksjonen intensitetsnivå. Dette gjør at identifisering av mulige uteliggere på funksjonen intensitetsnivå. Deretter ble raffinert CEL filer kondenseres med MAS5.0 algoritme (Affymetrix) og LOWESS normalisert ved hjelp av alle eksperimenter som en referanse. De normaliserte uttrykk datasettene ble lastet inn i Cobi database (Genedata) og analysert med Genedata ekspresjonistiske programvare. Prinsipp Component Analysis (PCA) og hierarkisk clustering ble utført med den ekspresjonistiske Analytiker Pro 4.0-programvaren (Genedata). ble utført en gyldig verdi andel Analyse for hver gruppe (4 av 5 sondesett måtte vise et signal), og de resulterende gruppene av probe-sett ble forenet. Disse dataene ble utsatt for en rekke parvise sammenligninger ved hjelp av den ekspresjonistiske Analytiker Pro 4.0-programvaren (Genedata). Statistiske analyser inkludert parvise sammenligninger mellom SAG- eller PAC behandlet prøver og kjøretøy-behandlede prøver. Probe sett ble ansett å være regulert hvis de var utenfor ellipsoiden regionen i vulkanen tomten anvende følgende terskler: Vulkan tomten: 5x ganger endring og P-verdi 1 x 10-5 fra T-test for 40 nM SAG og PAC; for 2,5 nM SAG og 4 nM PAC 3 ganger endring og P-verdi mindre enn 5 × 10-3. Venn krysset analyser av betydelig regulerte gener ble utført for å identifisere gener som reguleres vanligvis av forskjellige behandlinger med den ekspresjonistiske Analytiker Pro 4.0-programvaren. Pathway analyser ble utført med GeneGo Metacore (St. Joseph, MI, USA) database og programvareverktøy. Alle Affymetrix cel-fildata er tilgjengelige via ArrayExpress sjonsnummer E-mtab-377.
Kloning av shRNA konstruerer
BLOCK-iT RNAi Designer algoritme (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) ble brukt til å analysere TP53 mRNA (GenBank deponeringsnummer, NM_000546.4) og for å identifisere tre pulssekvenser for shRNA, dvs. shTP53_1 (sense) 5′-GCATCTTATCCGAGTGGAAGG-3 «og 5′-CCTTCCACTCGGATAAGATGC-3′; shTP53_2 (sense) 5»-GACTCCAGTGGTAATCTAC-3 «og 5′-GTAGATTACCACTGGAGTC-3′; shTP53_3 (sense) 5»-GCGCACAGAGGAAGAGAATCT-3 «og 5′-AGATTCTCTTCCTCTGTGCGC-3». De målsekvenser for et ikke-spesifikt kontroll shRNA (ikke-målsøkende shRNA) ble shCtrl1 (sense) 5′-TAAGGCTATGAAGAGATAC-3 «og 5′-GTATCTCTTCATAGCCTTA-3′ og shCtrl2 (følelse) 5»-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 «og 5 «-ACGTGACACGTTCGGAGAA-3».
Komplementære syntetiske oligonukleotider DNA ble hybridisert og innsatt i pENTR /U6-vektoren (Invitrogen). shRNA kassetter ble saman av Gateway kloning inn i en modifisert pLenti-6 reisemålet vektor (pGT3, Invitrogen) for å generere lentiviral shRNA uttrykk konstruerer shCtrl1, shCtrl2, shTP53_1, shTP53_2, og shTP53_3. Alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering på tjenestene i Molecular Biology (SMB), Berlin, Tyskland.
Produksjon av lentivirus og transduksjon av A549 celler
293ft celler ble transfektert med ulike pGT3 ekspresjonsvektorer inneholder TP53 shRNAs eller ikke-target kontroll shRNA. Lentivirus produksjon ble gjennomført i henhold til BLOCK-iT U6 RNAi Entry Vector Kit User Manual (Invitrogen). A549-celler ble infisert med lentivirus rekombinant for shTP53_1, shTP53_2, shTP53_3, eller ikke-target-kontroll shRNAs shCtrl1 og shCtrl2, henholdsvis, og er valgt med hygromycin (100 ug /ml). Individuelle kloner ble utvidet og testet for TP53- knockdown effektiviteten ved QRT-PCR (data ikke vist) og immunoblotting.
Resultater
Sagopilone efficaciously hemmer spredning av NSCLC cellelinjer i nanomolar rekkevidde
Den anti-proliferativ aktivitet av SAG og PAC ble undersøkt i 6 ikke-småcellet lungekreft cellelinjer av ulike undergrupper (adenokarsinom: A549, NCI-H1437, NCI-H23, NCI-H522, plateepitelkarsinom: NCI -H226, stor celle lungekreft: NCI-H460) med en
in vitro
spredning analysen (figur 1A).. SAG inhiberte lungetumorcelleformering i alle cellelinjer med IC50-verdier i området 0,2 til 3,3 nM, og var effektiv ved sub-nanomolare konsentrasjoner (nM ≤1) i fem av de seks cellelinjer. Videre SAG var gjennomgående mer effektiv enn PAC.
1A, SAG og PAC hemme spredning av lungekreftcellelinjer. Seks forskjellige lungekreftcellelinjer ble behandlet med SAG eller PAC i 72 timer. Proliferasjon ble målt med krystallfiolett analyse. Midlere IC50-verdiene som mål på den halv-maksimal veksthemming og standardavvik er vist. 1B, Immunfluorescens farging av α-tubulin (grønn) og DNA (rød) i A549 lungekreftceller etter inkubering med enten bærer (0,1% etanol), 2,5 nM, eller 40 nM SAG. Scale bar = 20 mikrometer. Representative bilder av inter og mitotiske celler er vist. 1C, FACS analyse av A549 celler behandlet med kjøretøy, 2,5 og 40 nM SAG eller 4 nM og 40 nM PAC for 18 timer avslørte G2 /M arrest ved 40 nM SAG eller PAC og økt antall celler med 2N og 2N DNA-innhold og anrikning i G
0 /G
1 fasen av cellesyklusen ved 2,5 nM SAG eller 4 nM PAC. 1D, induksjon av apoptose ved økende konsentrasjoner av SAG i A549-celler. A549 celler ble inkubert i 72 timer med bil, eller 2,5 nM, 5 nm, 10 nm, 40 nm, eller 100 nM SAG. Videre ble cellene farget med 3,3′-dihexyloxacarbocyanine jodid (DiOC6 (3)) og propidiumjodid for FACS måling. Hvite linjer indikerer gjennomsnittlig prosent av celler preget av nedgang på ΔΨm (ΔΨm lav) og svarte linjene viser celler med ΔΨm lav og høy propidiumjodid signal (PI + og ΔΨm lav) på grunn av plasmamembran ruptur. Gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter og standardavvik er gitt.
Sagopilone forstyrrer cytoskeletal funksjoner og induserer apoptose i A549 celler
Videre forsøk på den generelle modusen for handling av SAG ble utført med A549 som modell cellelinje. Behandlede A549 celler viste en normal microtubule spredning i interfase celler og typiske bipolare spindler med congressed kromosomer ved metafase plate i mitotiske celler (Fig. 1B). I kontrast, når A549 celler ble inkubert med 40 nM SAG merket microtubule bundling i interfasecellene var synlig som førte til en unormal spindel organisasjon i metafase celler, med flere spindel stolper, flere plater av congressed kromosomer, og en uregelmessig kromosom justering. Disse cellulære effekter var doseavhengig og også sett etter inkubasjon med 2,5 nM SAG, men i mindre grad.
Effekter av SAG og PAC på cellesyklusutvikling ble målt i A549-celler
in vitro
med FACS-analyse (fig. 1C og analytiker fig. S1). To forskjellige fenotyper ble observert: Lave konsentrasjoner av SAG eller PAC (0,5-5 nM og 2-7 nM, respektivt) induserte avvikende celledeling som resulterer i dannelsen av en økt prosentandel av aneuploide celler med et DNA-innhold 2N eller 2N, men bare en liten økning i prosentandelen av celler i G2 /M-fasen. En annen fenotype ble observert ved høyere konsentrasjoner av SAG og PAC ( 10 nM): Her er en dramatisk økning i prosentandelen av celler i G2 /M fasen ble observert (figur 1C og Tilsetnings Fig S1..). For alle videre analyser av de to forskjellige fenotyper, ble to konsentrasjoner ansatt som induserer enten aneuploid fenotype, dvs. 2,5 nM SAG eller 4 nM PAC eller mitotisk arrest fenotype, dvs. 40 nM SAG eller PAC.
En konsentrasjon -avhengig induksjon av apoptose av SAG ble observert i FACS-analyse etter 72 timers inkubering. Interessant, behandling med lave konsentrasjoner av SAG (2,5, 5 og 10 nM) effektivt inhiberte celleproliferasjon, men induserte bare lite apoptose, mens høy konsentrasjon SAG behandlinger (40 nM og 100 nM) førte til markert induksjon av apoptose i A549-celler ( fig. 1 D).
sterke virkningene av høy konsentrasjon, men ikke ved lav konsentrasjon sagopilone-behandling på forandringer i genom-wide-genekspresjon i A549-celler
RNA ble isolert fra A549-celler, ubehandlet , bærerkontroll-behandlet, samt behandles med to konsentrasjoner av hver av SAG (2,5 nM og 40 nM) og PAC (4 nM og 40 nM) i 18 timer, og hybridisert til Affymetrix HGU133Plus2.0 matriser. Høykvalitets genuttrykk data ble innhentet. Et prinsipp komponentanalyse (PCA) basert på ekspresjon av alle gener avslørte to hoved klynger: En klynge inneholdt ubehandlet, bærer-behandlede og lav konsentrasjon SAG (2,5 nM) – eller PAC-behandlede (4 nM) prøver, mens prøvene som er behandlet med høy konsentrasjon (40 nM) med SAG eller PAC dannet et separat klynge (fig. 2A, 2B) som indikerer at behandling med en lav medikamentkonsentrasjon på SAG eller PAC indusert bare forholdsvis små genekspresjon endringer sammenlignet med de ubehandlede prøvene, mens en høy legemiddelkonsentrasjonen av SAG eller PAC indusert sterkere genuttrykk endringer.
2A og 2B. Prinsipp Component Analysis (PCA) av microarray data av A549 celler ubehandlet (grå), kjøretøy-behandlet (mørk grå), eller behandlet med 2,5 nM (blå) eller 40 nM SAG (mørk blå) og 4 nM (grønn) eller 40 nM PAC (mørkegrønn) i 18 timer. Hvert plottet sfære representerer ekspresjonsprofilen av en enkelt prøve med n = 5 uavhengige biologiske replikater på projeksjonen av dataene på de første tre hovedbestanddeler, som utgjør det meste av variasjonene i dataene (merket akser). Utsikt fra to forskjellige vinkler (Fig. 2A, 2B) er vist å visualisere clustering.
Koblede t-tester sammenligner hver behandlingsgruppe med bilens behandlede grupper ble utført og resultatene vises som Volcano plot (Supplementary fig. S2) som viser den betydning som en funksjon av folden endringen. Fire lister genet ble samlet med terskelparametrene for P-verdi og brett endring av de høye og lave konsentrasjon behandlinger av begge forbindelser ble som beskrevet i tabell 1, sammen med det totale antall og antall opp- og ned-regulerte gener. Genet lister innhentet fra de statistiske tester ble sammenliknet med Venn-diagrammer. Fra totalt 503 gener regulert ved 40 nM PAC og 593 ved 40 nM SAG, 391 gener ble begge regulert ved begge behandlinger, noe som indikerer et lignende sett av gener som påvirkes av en høy konsentrasjon av begge låns-TBAer. En Gene Ontologi (GO) analyse av de 391 regulerte gener med den GeneGo Metacore programvaren viste en lignende forekomst og rangordnet biologiske prosesser (data ikke vist) indikerer en meget lignende virkningsmekanisme for begge låns-TBAer ved høy konsentrasjon. I kontrast, når man sammenligner de 593 genene reguleres av 40 nM SAG med de 221 genene påvirkes av behandling med 2,5 nM av det samme stoffet, bare 41 gener ble oftest regulert av både medikamentkonsentrasjoner og en mager ni gener ble ofte regulert av 40 nM (
