Abstract
Blærekreft er diagnostisert ved cystoskopi, en kostbar og invasiv prosedyre som er forbundet med ubehag for pasienten. Analyse av tumor-spesifikke markører i DNA fra sedimenter av annullert urin har potensial for ikke-invasiv påvisning av blærekreft; imidlertid følsomheten begrenset av lave fraksjoner og små antall av tumorceller ekspandert i urinen fra lav grad av tumorer. Hensikten med denne studien var å forbedre følsomheten for ikke-invasiv påvisning av blærekreft ved størrelse-baserte fangst og anrikning av tumorceller i urinen. I en split-sample oppsett, urin fra en sammenhengende serie av pasienter med primære eller tilbakevendende blæretumorer (N = 189) ble behandlet ved mikrofiltrering ved bruk av et membranfilter med en definert porestørrelse, og sedimentering ved sentrifugering, respektivt. DNA fra prøvene ble analysert med hensyn til syv blære tumor-assosierte markører ved hjelp av metylering MethyLight og pyrosekvensering analyser. Fraksjonen av tumor-avledet DNA var høyere i filterprøvene enn i tilsvarende sedimentene for alle markører (
p
0,000001). På tvers av alle tumor trinn, antallet tilfeller som var positive for en eller flere markører var 87% i filterprøvene sammenlignet med 80% i de tilsvarende sedimentene. Den største økningen i følsomhet ble oppnådd i lavgradige Ta svulster, med 82 av 98 tilfeller positive i filter prøvene (84%) versus 74 av 98 i sedimentene (75%). Våre resultater viser at pre-analytisk prosessering av annullert urin etter størrelse-basert filtrering kan øke følsomheten for DNA-basert deteksjon av blærekreft
Citation. Andersson E, Steven K, Guldberg P (2014) Size basert Anriking av ekspandert tumorceller i urinen øker følsomheten for DNA-basert diagnostikk av blærekreft. PLoS ONE 9 (4): e94023. doi: 10,1371 /journal.pone.0094023
Redaktør: Ludmila Prokunina-Olsson, National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA
mottatt: 23. oktober 2013, Godkjent: 12 mars 2014; Publisert: 14 april 2014
Copyright: © 2014 Andersson et al. . Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering: Grant støtte : The Candy Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den syvende vanligste kreftformen i verden og står for mer enn 150.000 dødsfall hvert år [1]. Mer enn 90% av blæren svulster er overgangscellekreft (også kalt urothelial karsinom) som oppstår fra urotelialceller lining blæren. Typiske symptomer på blærekreft er mikroskopiske og makroskopiske hematuri, smertefull vannlating og polyuri. Imidlertid er ingen av disse symptomer som er spesifikke for sykdom, og kan være forårsaket av en rekke andre tilstander, inkludert cystitis, nyrestein og prostata sykdom. Gullstandarden for diagnostisering av blærekreft er transurethral reseksjon av blære tumor (TURBT). De fleste pasienter er diagnostisert med ikke-invasiv blærekreft (stadium Ta), som har en fem-års overlevelse på 90%. Imidlertid er tilbakefallsraten høy (50-70%) og 10-25% fremgang til invasiv blærekreft, langsiktig oppfølging warranting ved cystoskopi hos pasienter med ikke-invasive svulster [2] – [4]. Cystoskopi er en invasiv metode som er ubehagelig for pasienter og krever store tekniske og økonomiske ressurser. Det er derfor viktig å utvikle ikke-invasive metoder som er enkle og kostnadseffektive for diagnostisering og oppfølging av blærekreft.
annullert urinprøver fra pasienter med blære svulster vanligvis inneholde ekspandert kreftceller som kan påvises ved cytologisk analyse. Urin cytologi er en ikke-invasiv metode som har en høy spesifisitet, men en lav følsomhet ( 40%), særlig hos pasienter med lavgradige svulster [5], [6]. En mer følsom ikke-invasiv metode for påvisning av blærekreft er basert på analyse av tumor-spesifikke endringer i DNA isolert fra urinsedimenter. Kromosom tap og somatiske mutasjoner i spesifikke gener som
FGFR3 Hotell og
TP53
har alle blitt brukt med hell som biomarkører for påvisning av ulike stadier av blærekreft [7] – [9]. I de senere årene har avvikende hypermethylation på promoter CpG øyer vist seg å forekomme oftere og tidlig i kreftutvikling og kan selv gå foran genetiske endringer som mutasjoner og genomisk omorganisering i cancerogenesis [10]. Flere studier har rapportert hypermethylation av promotor CpG øyer i blæretumorer (oversikt i Refs [11] – [13].) Og kan påvises disse endringene i urinsedimenter fra pasienter med blærekreft [14], [15]. Det er ingen enkelt DNA-metylering markør som definerer alle typer blære tumor, og de fleste studier har benyttet et panel av markører for å påvise blærekreft i kliniske prøver. Sensitiviteten og spesifisiteten av DNA-baserte blæretumordeteksjon variere betydelig på tvers av studier, som kan være knyttet til valg av markører og metoder for å vurdere disse markører, så vel som forskjeller i representasjonen av de forskjellige tumor stadier i kullene pasient [16] – [23].
i studier hvor sammenkoblede tumorprøver og sedimenter fra urin har blitt analysert i parallell for samme panel av DNA-markører, sensitiviteten for påvisning er gjennomgående lavere i urinen [15], [17], [20]. Peeling av tumorceller i urinen er avhengig av tumor-egenskaper som størrelse, stadium og grad og også viser stor intraindividuelle variasjon [24]. Spesielt små ikke-invasive svulster er mindre sannsynlig å felle nok celler i urinen til å bli oppdaget i senere analyse. I tillegg kan urin fra pasienter med blærekreft inneholde et økt antall av andre celletyper, inkludert hvite blodlegemer, noe som kan påvirke sensitiviteten av sedimentanalyse. Derfor er en metode som gjør det mulig for en anrikning av tumorceller i urinprøver kan øke robustheten og følsomheten for ikke-invasiv påvisning av blærekreft.
Tumorceller avledet fra epitelceller er generelt større enn hvite blodceller, og denne størrelsen forskjellen potensielt kan utnyttes for å anrike for tumorceller i heterogene biologiske prøver slik som urin. Tidligere studier har brukt filtre for størrelse basert isolering av sjeldne sirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod [25], [26]. Ideen om å fange celler i urinen på et filter ble det innført mer enn tretti år siden [27], og senere studier har benyttet membranfiltre for utarbeidelse av epitelceller fra urin for påvisning av urothelial karsinom ved cytologi eller fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse [28] – [30]. I denne studien, har vi testet en enkel og kostnadseffektiv fremgangsmåte for tidligere analytiske urin filtrering for å øke den fraksjon av tumorceller og dermed følsomheten for DNA-basert deteksjons spissen ufiltrerte sedimenter. I en split-sample set-up, ble urinprøver fra pasienter med blærekreft vurdert for tilstedeværelse av tumor-DNA med et panel av metylering markører ofte oppdages i blærekreft. Fraksjonene denaturert alleler ble kvantifisert i sedimentert og filtrerte prøver av MethyLight analyser og pyrosekvensering. Vi fant ut at dette filtreringsmetoden økte brøkdel av tumor-avledet DNA og også forbedret sensitivitet og robusthet av blære svulst deteksjon fra urinprøver.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
studien ble godkjent av København-Etisk Komité og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og kontroller på inkludering.
samling av urin prøver
annullert morgenurinprøver ble samlet inn fra blæren kreftpasienter innlagt for TURBT ved Københavns universitetssykehus, Herlev, Danmark, mellom juni 2010 og juni 2011, og fra friske frivillige uten kjente urologiske kreftformer. Prøvene ble sendt til den danske Kreftforeningen og behandles innen 4-6 timer etter tømming.
Behandling av urinprøver
Femti milliliter hver urinprøve ble sedimentert ved sentrifugering ved 2000 g i 10 min . Pelleten ble vasket i fosfatbufret saltvann (PBS), etterfulgt av en annen 10 min sentrifugering. Supernatanten ble kassert og pelleten ble resuspendert i omtrent 200 pl PBS. Parallelt ble urin fra den samme prøven trukket inn i en engangssprøyte og ført gjennom et Whatman Nuclepore spor graverte polykarbonathydrofilt membranfilter (diameter 25 mm) som er montert i den tilhørende filterholderen (Whatman, Maidstone, UK). Urinprøven ble ført gjennom filteret ved positiv kraft inntil en motstand ble følt (metning), med et maksimum på 125 ml. Alle filtre ble skylt med PBS før fjerning fra filterholderen. Urin sedimenter og filtre med filter innhold ble lagret ved -80 ° C inntil videre bearbeiding.
DNA Isolering og Bisulfite Conversion
DNA ble isolert fra urin sediment og filterprøver ved hjelp av Qiagen Mini Prep kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Filterprøver og bunnfallene ble inkubert med ATL-buffer og proteinase K ved 56 ° C i minst en 1 time eller over natt. Etterfølgende behandling ble utført i henhold til protokollen for DNA-rensing fra vev. DNA fra filtre og sedimenter ble eluert i 50 ul, og 100 ul buffer AE, henholdsvis, og lagret ved -80 ° C. DNA-konsentrasjonen ble målt ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).
Bisulfite konvertering ble gjort ved hjelp av EZ DNA Metylering-Gold Kit (Zymo Forskning Corp, Orange, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Bisulfitt-omdannet DNA ble eluert på 2 x 10 ul av M-elueringsbuffer og lagret ved -80 ° C. For paret prøver (sediment og filter), ble den samme mengden av DNA brukt, med et maksimum på 500 ng. I de tilfeller hvor DNA-konsentrasjonen var for lavt til å bli nøyaktig bestemt ved hjelp av Nanodrop spektrofotometer, ble den maksimale prøvevolumet (20 ul) anvendt. Normal menneskelig blære epitel stammer fra en 66 år gammel mann ble kjøpt fra Capital biovitenskap (Rockville, MD, USA).
Cell Culture
T24 cellelinje (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) var dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum. Lymfocytter ble isolert fra blod fra en frisk donor i det vesentlige som beskrevet [31] og lagret ved -80 ° C inntil bruk. Celler i enkeltcellesuspensjon ble talt opp og målt ved anvendelse av en Countess Automated celleteller (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De to celletyper ble blandet i de angitte prosenter og behandlet ved sentrifugering og filtrering som beskrevet ovenfor for urinprøver.
denaturerende Gradient gelelektroforese
Mutasjon analyse av
HRAS
exon 2 ved denaturerende gradient-gelelektroforese (DGGE) ble utført i det vesentlige som beskrevet [32]. Primer sekvenser og PCR-forhold er listet opp i tabell S1. PCR-produktene ble fylt på en 0% denaturant /6% polyakrylamid-90% denaturant /9% polyakrylamid dobbel-gradientgel [33]. Gelene ble kjørt ved 170 V i 4,5 timer i TAE-buffer holdt ved en konstant temperatur på 58 ° C, farget med etidiumbromid og fotografert under UV gjennomlysnings.
MethyLight
Sanntids kvantitativ metylering-spesifikk PCR (MethyLight; Ref. [34]) ble utført hovedsakelig som beskrevet [20]. Primer og probe sekvenser er oppført i tabell S1. Reaksjonene ble utført på LightCycler 480 kurven med LightCycler 480 prober Master Kit (Roche, Mannheim, Tyskland) og 1 mL av sulfitt-behandlede DNA per reaksjon. Spesifisiteten til hver analyse ble etablert ved hjelp av
in vitro
metylert DNA (IVM; CpGenomeTM Universal denaturert DNA, Chemicon /Millipore, Billerica, MA) og DNA fra utvalgte kreftcellelinjer som positive og negative kontroller for metylering, henholdsvis og vann og ikke-bisulfitt behandlet genomisk DNA som negative kontroller for forsterkning. En MethyLight assay for
ALUC4
og en fortynningsserie av IVM ble anvendt for å bestemme DNA-konsentrasjonen av prøven etter behandling bisulfitt [20], [35]. Saker ble forkastet hvis ett av de sammenkoblede sediment eller filter prøver hadde konsentrasjoner under tilsvarende 0,25 ng /mL ikke sulfitt-behandlet DNA. Metylering nivåene ble beregnet som prosent metylert referanse (PMR;. Ref [35]) ved å normalisere merkespesifikke reaksjons verdier til
ALUC4
verdier i forhold til de samme verdiene for fullt metylert kontroll (IVM). De små mengder av utgangs DNA for mange av prøvene begrenset antall markører som kan bli testet, og alle analyser ble utført som enkle reaksjoner. Bakgrunnen metylering nivået for hver markør ble bestemt ved hjelp av DNA fra sedimentert og filtrert urinprøver fra 11 friske kontroller samt humant genomisk DNA (Roche, Mannheim, Tyskland). Cut-off PMR verdiene var 3 for
HOXA9
, 2 for
POU4F2
, 0,5 for
SALL3 Hotell og 2 for
VIM2.
pyrosekvensering
pyrosekvensering analyser for
HRAS
p.G12V (c.35G T) mutasjon og
BCL2
promoter metylering ble utformet med PyroMark analysen design software (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Primer sekvenser og PCR-forhold er listet opp i tabell S1. PCR ble utført i et sluttvolum på 25 pl inneholdende PCR-buffer (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland), 200 uM hver dNTP, 0,4 M av hver primer og en U av Taq DNA-polymerase HotStarTaq (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Pyrosekvensering ble utført på en PyroMark Q24 plattform, ved hjelp PyroMark Gold Q24 Reagenser (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Analyse av resultatene ble gjennomført med PyroMark Q24 programvare (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Gjennomsnittlig metylering nivåer for
BCL2
ble beregnet for de syv CpG områder som inngår i analysen. Bakgrunnssignalet for den
BCL2
metylering analysen ble satt til 5% basert på analyse av bisulfitt ble behandlet med humant genomisk DNA (Roche, Mannheim, Tyskland). For
BCL2
metylering analyse, bare kliniske prøver med en konsentrasjon tilsvarende 5 ng /mL ikke sulfitt-behandlet DNA eller mer ble inkludert.
Resultater
Capture og berikelse av blære tumorceller på et membranfilter
for å teste evnen til membranfiltre for å fange opp blæren kreftceller, vi først brukt et modellsystem designet for å ligne urinprøver som inneholder lave fraksjoner av tumorceller. Ett eksperiment er vist i figur 1. Rensede dyrkede lymfocytter fra perifert blod (diameter 7-8 um) ble tilsatt med 0,5% T24 blærekreftceller (diameter 16-17 um). En del av dette celleblandingen ble sedimentert ved sentrifugering, mens de resterende ble ført gjennom et membranfilter med en porestørrelse på 8 um (figur 1A). Den gjennomstrømning fra filteret ble også samlet opp og sedimentert ved sentrifugering. For å vurdere om filtreringen øker fraksjon av tumorceller i prøven, DNA ble isolert og analysert for to tumor-spesifikke forandringer som er tilstede i T24-celler;
HRAS
p.G12V mutasjon og hypermethylation av
BCL2
promoter. Figur 1B viser den fysiske oppløsning av mutanten og villtype
HRAS
alleler ved hjelp av DGGE, som har en deteksjonsgrense på ca. 2% [36]. Mutanten
HRAS
allel var tydelig påvisbart som homo- og heteroduplekser i filteret prøven, men ikke i sedimentet eller gjennomstrømnings prøver (figur 1B). Kvantitativ analyse av de samme prøver ved hjelp av pyrosekvensering viste en økning i forholdet mellom mutant (T) over villtype (G)
HRAS
alleler fra 3-4% i sedimentet og gjennomstrømnings prøver til 19% i filteret prøven (figur 1C og data ikke vist). Bisulfite pyrosekvensering viste en tilsvarende økning i andelen
BCL2
hypermethylated alleler, spesifikk for T24 celler, ved filtrering (figur 1D).
(A) Skjematisk tegning av split-sample eksperimentell sett -opp. Urinprøve eller cellesuspensjonen er delt i to og underkastet sentrifugering og filtrering, respektivt. DNA fra cellene i sedimentet eller fanget på filteret blir deretter isolert og analysert for tumor-spesifikke markører. (B) Påvisning av
HRAS
p.G12V mutasjon av DGGE. Cellelinjen T24 er homozygot for det mutante allelet. Sediment og gjennomstrømnings prøvene vise bare villtype-allelet, mens filteret prøven viser både muterte og villtype-alleler. Heteroduplekser er hybridmolekyler består av en mutant tråd og en villtype tråd. (C) Pyrographs som viser fordelingen mellom villtype (G) og mutant (T)
HRAS
alleler i sedimentet og filterprøver. (D) Pyrographs av
BCL2
arrangøren CpG island metylering analyse i sedimentet og filterprøver. De enkelte CpG steder i målområdet er indikert med mørk grå skyggelegging, og andelen av denaturert alleler (C) er angitt på hvert sted.
For å teste filtreringsmetoden i en klinisk setting, urin prøvene ble tatt fra 15 blærekreftpasienter innlagt for TURBT. I denne serien av prøver, vi også vurdert om porestørrelsen kan påvirke forholdet mellom tumorceller til normale celler. Fra hver urinprøve ble 50 ml fremstilt ved sentrifugering, mens det gjenværende volum ble delt likt og ført gjennom to filtre med porestørrelser på 8 um og 10 um, respektivt. DNA ble isolert fra alle urinsedimenter og filterprøver og undersøkt for
BCL2
metylering ved hjelp av en svært spesifikk og sensitiv MethyLight analysen. Sju av de 15 urinprøver var positive for denne markøren, i samsvar med tidligere rapporter som viser
BCL2
hypermethylation i en stor andel av blæren svulster [16], [22]. For å estimere brøkdel av tumor-avledet DNA, ble metylering nivåer beregnet for
BCL2
-positive prøver ved hjelp av normaliserte verdier (PMR). Det var bare en liten forskjell i metylering nivåer mellom 8 og 10 um filter, med litt høyere nivå i 8 um filter (tabell S2). Kvantitativ analyse av
BCL2
metylering av pyrosekvensering bekreftet resultatene av MethyLight analyse (Figur 2). Spesielt, alle filterprøver (både 8 mikrometer og 10 mikrometer) viste høyere
BCL2
metylering nivåer enn de tilsvarende sedimentprøvene, som indikerer en høyere andel av kreftceller.
Gjennomsnittlig metylering nivåer av
BCL2
promoter CpG øy i urinprøver fra sju blærekreftpasienter, som bestemmes av pyrosekvensering. Sediment og to filterprøver (8 og 10 um pore størrelse, henholdsvis) ble fremstilt fra hver urinprøve. Sedimentet prøve fra pasienten to mangler på grunn av mislykket DNA-ekstraksjon.
Urin Filtrering Øker Fraction of Tumor DNA i kliniske prøver
Etter å ha fått bevis på prinsippet om at membranfiltre kan fange og berike for blære kreftceller i urinprøver, gjennomførte vi en klinisk studie av 220 sammenhengende blæren kreftpasienter. Demografiske og klinisk-patologisk karakteristikk av disse pasientene er oppført i tabell S3. Det var et likt antall pasienter med primære og tilbakevendende svulster i denne kohort. Morgen urinprøver ble oppsamlet og behandlet i henhold til den brøkdelen av prøven utformingen illustrert i figur 1A, ved hjelp av et 8 um filter. DNA ble isolert fra alle urinsedimenter og filterprøver og behandlet med natriumbisulfitt. Konsentrasjonen av bisulfitt-behandlede DNA i hver prøve ble bestemt ved anvendelse av en MethyLight assay for
ALUC4
. Trettien sammenkoblede prøver ble forkastet på grunn av lav DNA yield (tabell S3).
Screening av alle 189 parede prøver for
BCL2
metylering av MethyLight analyse identifisert 121 tilfeller positive for denne markøren (eksempler er vist i figur 3A). I 60 av disse sakene, både filtrer og sedimentprøver inneholdt tilstrekkelige mengder DNA for pålitelig kvantitativ analyse av pyrosekvensering (figur 3B). I 18 av 60 tilfeller, gjennomsnittlig
BCL2
metylering nivået var under bakgrunnssignalet for pyrosekvensering i både sediment og filterprøver. Av de 42 tilfellene, 29 (69%) viste høyere metylering nivåer i filter prøven sammenlignet med det sedimentprøven, fem tilfeller (12%) viste lik metylering nivåer (mindre enn 2 prosent poeng differanse) og åtte tilfeller (19% ) viste høyere metylering nivåer i sedimentene enn i tilsvarende filtre (Figur 3C). Den gjennomsnittlige metylering nivået var 28% i filterprøver sammenlignet med 21% i sedimenter (
p
0,001, paret t-test). Økningen i metylering nivåer fra sediment til å filtrere varierte fra 3 til 35 prosentpoeng, med en medianverdi på 10 prosentpoeng. Kvantitativ analyse av alle 121 tilfeller positive for
BCL2
metylering ved hjelp av normverdier (PMR) fra MethyLight analysen viste en gjennomsnittlig metylering nivå på 10,0% i sedimentprøvene og 14,4% i filter prøver, med medianverdien øker fra 1,6% til 4,0% (figur 4;
p
0,001, paret t-test)
(A) Eksempler på MethyLight analyse av
BCL2
promoter. CpG island metylering. I pasient A, forsterkning sett i filteret prøven, men ikke i den sedimentprøven. I pasient B, er forsterkning sett i begge prøvene; imidlertid med en høyere Ct-verdien for den sedimentprøven. (B) Eksempler på
BCL2
arrangøren CpG island metylering analyse av pyrosekvensering i parvise prøver. Gjennomsnittlig metylering nivå er beregnet for de syv individuelle CpG nettsider analysert (angitt med mørk grå skyggelegging). Den gjennomsnittlige metylering nivå i den sedimentprøven fra pasient B var under bakgrunnssignalet for pyrosekvensering, i motsetning til den MethyLight assay (A), som viser forskjellen i analytiske følsomhet mellom de to analyser. (C) Gjennomsnittlig metylering nivåer for parede prøver som fastsatt av pyrosekvensering. Vist er resultatene for de tilfeller hvor minst ett av de sammenkoblede prøvene viste signaler over bakgrunnen for pyrosekvensering (N = 42).
Synlig er medianen av normaliserte verdier (prosent denaturert referanse, PMR) fra MethyLight analyse av syv metylering markører. For hver markør, metylering nivåene varierte fra mindre enn 1% til 100% (ikke vist). *, P 0,05; **, P. 0,01
For å analysere prøvene negative for
BCL2
metylering, utvidet vi MethyLight basert analyse av seks ekstra promoter CpG øyer som tidligere er rapportert å være ofte hypermethylated i blærekreft, inkludert
CCNA1
,
EOMES
,
HOXA9
,
POU4F2
,
SALL3 Hotell og
VIM2
[16], [18], [23]. Vi har validert disse markørene sammen med
BCL2
i et panel av 51 blæren svulster som representerer ulike kreftstadier (Ta svulster 22 lavgradig, Ta svulster 2 høy klasse, 8 T1 svulster, 17≥T2 svulster, og to Tis ). Hver av disse markørene var positiv i 45% av tumorene i dette panelet, og 48 av de tumorer (94%) var positive for minst en markør. Tumor spesifisitet av markørene ble bekreftet ved analyse av normale blærevevet
Kvantitativ analyse av alle syv DNA-metylering markører viste en økning i metylering nivået i filterprøver, sammenlignet med sedimenter (figur 4;.
p
0.000001, paret t-test). Denne forskjellen var også statistisk signifikant for noen individuelle markører, inkludert
BCL2
,
HOXA9 Hotell og
VIM2 plakater (figur 4).
Urin Filtrering Øker sensitivitet for påvisning av blærekreft
Vi har endelig adressert om de økte fraksjoner av tumor-avledet DNA oppnås ved urin filtrering kan påvirke sensitiviteten for påvisning av blærekreft. For å bestemme nivåene av bakgrunns metylering for hver av de syv markører, undersøkte vi DNA fra filtrer og sediment urinprøver fra 11 friske kontroller, så vel som DNA fra perifere blodlymfocytter. Late-syklus forsterkning ble tidvis observert for fire av markører (
HOXA9
,
POU4F2
,
SALL3 Hotell og
VIM2
), hvorav noen var opprettholdt på gjentatt analyse. På grunnlag av disse data ble en cut-off-verdi som er definert for hver av disse markører ovenfor som en prøve ble ansett positiv.
BCL2, CCNA1 Hotell og
EOMES
viste ingen bakgrunn metylering.
Med positivitet definert som hypermethylation av minst ett av de syv markører, følsomheten på tvers av alle kreft stadier var 80% (152/189) i urinen sedimentene, mens den var 87% (164/189) i filterprøvene. Dette mønsteret var klart også for individuelle markører, som alle viste en høyere følsomhet i filter prøvene (figur 5). Markøren viser den høyeste sensitiviteten var
VIM2
, som var positiv i 56% av sedimentprøver og 67% av filterprøvene. De seks andre markører hadde følsomheten til 35-53% i sedimenter og 43-62% i filtre. Følsomheten for høyere stadium svulster (≥T1) var generelt høy ( 90%) i sedimenter og var bare litt, om enn stadig økt etter filtrering. Spesielt, er imidlertid en dramatisk effekt ble sett for lavgradig Ta svulster, hvor følsomheten økt fra 75% (74/98) i sedimentene til 84% (82/98) i filtre (tabell 1). Blant de 95 primære svulster, ble 80 (84%) som detekteres i sedimentet og 84 (88%) ble detektert i filteret. Blant de 94 tilbakevendende tumorer, ble 73 (78%) som detekteres i sedimentet og 80 (85%) ble detektert i filteret.
Vist er de prosenter prøvene var positive for de syv DNA-metylering markører. Den siste kolonnen ( «Alle») viser hvor stor andel av prøvene positive for ett eller flere markører.
Diskusjoner
Ikke-invasive tester som kan nøyaktig og pålitelig oppdage blære kreft vil ha en betydelig innvirkning på pasientene og helsevesenet ved å redusere behovet for hyppig, kostbart og ubehagelig cystoskopi. Betydelig fremgang har blitt gjort for å identifisere urinbaserte biomarkører som kan utkonkurrere urin cytologi, og noen av disse markørene er utviklet i kommersielle tester. Ikke desto mindre, utfordringer når det gjelder å nå følsomheten av systoskopi [37] – [39]. Målet med denne studien var å øke følsomheten for DNA-basert deteksjon av blærekreft i urinprøver gjennom en enkel filtrering prosedyre, for å berike for tumorceller. I en stor sammenhengende kohort av blæretumorpasienter, har vi testet en kommersiell spor-etset polykarbonatfilter med en porestørrelse på 8 um og sammenlignet den med standard urinsediment analyse. Kvantitativ analyse på tvers av et panel bestående av syv DNA-metylering markører viste signifikant økte nivåer av tumor DNA i filtrerte urinprøver, sammenlignet med de tilsvarende sedimenter, noe som antyder at filteret fanger opp blæren tumorceller preferensielt i forhold til andre celler som finnes i urinen. Viktigst, filtrering prosedyren identifisert et større antall prøver fra blæren kreftpasienter som positiv, noe som resulterer i en samlet diagnostisk sensitivitet på 87% i filterprøver sammenlignet med en sensitivitet på 80% i tilsvarende sedimentene.
Lav -grade, lav-trinns blæren svulster representerer den største utfordringen i urin-basert gjenkjenning metoder, inkludert standard cytologi og fisk, da disse svulstene har en tendens til å kaste lavere antall celler i urinen [40], [41]. Denne begrensningen var også tydelig i vårt DNA-basert tilnærming, der følsomheten i urin sedimenter var nær eller over 90% for scene ≥T1 svulster, mens det bare var 75% for lav grad Ta svulster. Interessant, filtrering av urinprøvene økte følsomhet for lav grad av Ta- tumorer til 84%, noe som tyder på at denne fremgangsmåten kan lindre noen av vanskelighetene ved påvisning av disse tumorene. Blant de totalt 189 pasienter undersøkt, 16 tilfeller var negative for alle metylering markører i begge filtrer og sedimentprøver, og 13 av disse hadde høy eller lav grad Ta svulster. Vi [20] og andre [42] har tidligere vist at en undergruppe av overfladiske blære svulster viser lave priser av hypermethylation hendelser. Interessant, disse svulstene viser i stedet relativt høy forekomst av aktive
FGFR3
mutasjoner [20], og derfor kombinasjonen av metylering markører og
FGFR3
mutasjoner kan øke følsomheten for påvisning av overfladiske svulster i en diagnostisk innstilling [20], [43]. Vi begrenset våre analyser til én type markør (DNA hypermethylation) for å gi et helhetlig og sammenlignbar kvantitativt mål for å vurdere de to prosedyrene for utarbeidelse av diagnostiske celler (filtrering og sedimente), som var det viktigste formålet med vår studie. Dessuten kastes vi et forholdsvis stort antall prøver (14%) på grunn av lavt utbytte DNA, noe som kan svekke den kvantitative analysen. Men disse prøvene kunne godt ha vært kvalitativt testet for DNA metylering markører i en diagnostisk innstilling.
Som opptil 70% av pasienter med ikke-invasiv blærekreft opplever tilbakefall, ikke-invasive urinprøver er svært ønskelig for tilbakefall overvåking. Halvparten av pasientene i vår kohort presentert med en tilbakevendende svulst, og i denne gruppen, som for pasienter med primære svulster, urin filtrering ga en høyere sensitivitet enn sedimentering (85% vs. 78%). Disse data antyder at urin filtrering kan også forbedre diagnose av blærekreft, noe som kan være spesielt nyttige som tilbakevendende tumorer ofte er mindre og kaster færre celler enn primære svulster. Likevel kan denne fremgangsmåten ikke lindre andre begrensninger av DNA-metylering basert gjentakelse overvåkning, blant annet den høye positive raten blant cystoskopi-negative tilfeller, noe som kan være forårsaket av epigenetiske forandringer i normal-vises urothelium (epigenetisk felt defekt) [44], [ ,,,0],45].
Et åpenbart kritisk parameter for størrelse-baserte anrikning av tumorceller i biologiske prøver er porestørrelsen på filteret. Ideelt sett bør porene være stor nok til å utelukke normale celler og liten nok til å holde på tumorceller, idet det tas hensyn til deformerbarhet av celler under trykk. Tidligere studier med sikte på å anrike sjeldne CTCs i blod ved filtrering funnet at et 8 um porestørrelse filter utarmet prøver av 99,9% av leukocytter og samtidig beholde 85-100% av carcinoma celler [25], [46]. Med en større porestørrelse (12-14 um), færre leukocytter men også atskillig færre karcinomaceller (ned til 18%) ble bibeholdt på filteret [46]. Ved hjelp av en kommersiell spor-etset polykarbonatfilter med en porestørrelse på 8 pm, som er lik filtrene som brukes i disse tidligere studiene, var vi i stand til å berike den fraksjon av tumorceller i urinprøver.
