Abstract
Sirkulasjonstumorceller (CTCs), kaste fra primærsvulster og spres i perifert blod, spiller en viktig rolle i metastasering. Selv etter isolering av CTCs fra blod, målcellene er blandet med en befolkning på andre celletyper. Her, foreslår en ny fremgangsmåte for analyser av celleblanding ved ett-celle-nivå ved hjelp av en mikrofluidteknisk enhet som inneholder elektroaktive oppstilt mikrobrønnene. Dielectrophoretic (DEP) kraft, indusert av elektrodene mønstrede på bunnflaten av mikrobrønnene, tillater effektiv fangst og stabil posisjonering av enkeltceller for high-throughput biokjemiske analyser. Vi har vist at forskjellige on-chip-analyser, inkludert immunofarging, levedyktighet /apoptose analyse og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) på enkeltcellenivå kan bli utført bare ved å bruke spesifikke reagenser for hver analyse. Vår enkle metoden bør i stor grad bidra til diskriminering og analyse av sjeldne kreftceller blant en populasjon av blodceller
Citation. Kobayashi M, Kim SH, Nakamura H, Kaneda S, Fujii T (2015) Cancer Cell Analyser på enkelt~~POS=TRUNC Cell-nivå ved Electromicro Array Device. PLoS ONE 10 (11): e0139980. doi: 10,1371 /journal.pone.0139980
Redaktør: Arum Han, Texas A M University, USA
mottatt: 06.09.2015; Godkjent: 18 september 2015; Publisert: 11.11.2015
Copyright: © 2015 Kobayashi et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Alle data er inkludert i manuskriptet
Finansiering:.. Dette arbeidet ble delvis støttet av Japan Science and Technology Agency for kjerneforskning for evolutional Science and Technology (CREST) og for Strategic International Research Cooperative Program (SICP)
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
Sirkulasjonstumorceller (CTCs), kaster fra primær- og metastatiske svulster og flyter inn i blodet, blir vurdert. som en vesentlig årsak til kreft metastase [1]. Telling av antall CTCs i perifert blod gjør det mulig å overvåke terapeutiske effekten og prognose [2]. En utfordring i deteksjon av CTCs i en blodprøve, er at eksistensen av CTCs er ekstremt sjeldne og blandet med normale blodkomponenter (1 i 10
9 blodlegemer). Microfluidic enheter er egnet for sortering og analysering av sjeldne celler ettersom man effektivt kan håndtere komplekse cellulære fluider med minimal skade på suspenderte celler [3, 4]. I tillegg har evne til microfluidic anordninger for å håndtere det store volum av fullblodprøver som allerede er blitt vist [5]. Nylig har flere grupper vært å utvikle microfluidic anordninger for å isolere CTCs fra normale blodkomponenter, for eksempel ved hjelp av antistoff-belagte microposts, dielectrophoresis, størrelse basert separasjon ved et mikrofilter eller acoustophoresis, etc. [6-11]. Selv om tidligere metoder ved hjelp microfluidic enheter demonstrert separasjon av CTCs, de separerte celler har å bli samlet og helst bli analysert ved encellede nivå.
Et praktisk problem på CTC analysen er at kreftcellene er blandet med normale blodceller selv etter isolering av CTCs fra blod. De tidligere CTC isoleringsmetoder viser avveining mellom utvinning av CTCs og utarming av hvite blodceller (WBC) [9-11]; høyere utvinningsgrad av CTCs, jo lavere uttømming rate av WBCs. Disse resultatene tyder på at de isolerte kreftceller er fortsatt blandet med stort antall WBC. For eksempel, en metode under anvendelse av mikrofluid magnetophoretic WBC uttømming lar 3,8-log uttømming av WBC og et 97% utbytte av kreftceller [12]. Hvis en original blodprøven inneholder 10-cancerceller og 10
6-WBC, inneholder en renset prøve 10-cancerceller og 156-WBC etter isolering med magnetophoretic WBC uttømming metode. Derfor, etter isolering av målceller fra blod, diskriminering mellom kreftceller og WBCs er svært nødvendig for å påvise eller analysere målcellene.
Immunostaning eller fluorescerende in situ hybridisering (FISH) er mye brukt metode for diskriminering av kreftceller. Imidlertid konvensjonelle protokoller ved hjelp av et reagensrør eller en mikrotiter-plate som krever store volum av reagenser, inkludert antistoffer eller prober for hybridisering. Videre sentrifugeringer, som kreves for å forandre reagensene i hver analyse, muligens føre til kritisk tap av original prøver, eller skade på cellelevedyktighet så vel som cellefunksjon på grunn av sterke sentrifugalkrefter som virker på en celle [13-15]. En enkel og effektiv metode for biokjemisk analyse er derfor meget ønskelig å redusere eventuelle farer for de konvensjonelle metoder.
Her foreslår en ny fremgangsmåte for on-chip enkelt-kreftcelle-analyser ved bruk av elektromikro array (EMA) enhet. EMA inneholder mønstrede tynnfilmelektroder på bunnen av hver mikrobrønn for enkelt-celle overlapping med dielectrophoresis (DEP) [16, 17]. Siden DEP kraft gir rask, aktiv og stabil fangst, kan vi effektivt felle kreftceller suspendert i prøveløsningen. Fanget celler kan bli stabilt holdes på en brikke ved DEP, slik at rask utveksling av reagenser med et ekstremt lite prøvevolum. Således er high-throughput biokjemiske analyser for oppstilt enkle celler lettes. Vi har demonstrert muligheten for våre tilnærminger med en blanding av forskjellige celletyper ved å utføre tre typer analyser; kreftcelle diskriminering av farging, levedyktighet /apoptose analyse og fluorescerende in situ hybridisering (FISH) analyse. Hele prosessen for analyser bare krever sekvensiell injeksjon av cellesuspensjonen og reagenser for analysen uten kompliserte ventil eller rørsystemer. Vi forventer at våre enkle metoden til rette for høy gjennomstrømming og parallelt enkelt celle analyser, mens de eliminerer ekstra celle manipulasjoner utenfor enheten.
Electromicro Array
Design
Enheten består av en mikrofluidkanal fremstilt av polydimetylsiloksan (PDMS), og et glass-substrat som inneholder et stort antall av mikrofremstille på hverandre indiumtinnoksid (ITO) elektroder (figur 1A). Avstanden mellom elektrodene er omtrent 6 mikrometer, og diameteren til mikrobrønner er 30 um, som er større enn diameteren av målcellene (20 uM). Og høyden av mikrostrukturen, som var laget av epoksyharpiks, er 25 um. Mikrobrønnene er innrettet med de interdigiterte ITO-elektroder for å lokalisere et par elektroder (anode og katode) i hver av brønnene. Én enhet inneholder 3168 mikro. Påtrykte elektriske felt er sterkt lokalisert inne i hver mikrobrønn ettersom de interdigiterte elektrodene er plassert på bunnen av mikrobrønnene. Fig 1B viser fremgangsmåten i enkeltcelleanalyse. Først blir cellene innført i microchannel og fanget inn i mikrobrønnene ved hjelp av positiv DEP som induseres av vekselspenning som påtrykkes elektrodene. Deretter blir reagenser for analysene som innføres i fluidkanalen. Fig 1C viser bilde av fanget celler i mikrobrønnene.
(a) Konfigurasjon av enheten og dimensjoner av mikro og interdigi elektroder. (B) Cell fangst og reagenser bytte for encellede analyse. Cellesuspensjonen ble innført i mikrofluidkanalen på enheten, og celler som er fanget inn i mikrobrønnene ved positiv DEP. Etter celle fangst, analyser av de fangede celler blir utført ved innføring av nødvendige reagenser i microchannel. (C) Bilde av fanget DU145-celler (indikert ved piler) i mikrobrønnene.
Fabrication
Figur 2 viser fremstillingsprosessen av den foreliggende anordning. Formen på elektrodene ble mønstrede bruk av fotoresist (AZP1350, AZ Electronic Materials) på et ITO belagte glass-substrat (TOA OPTICAL TECHNOLOGIES, LTD.), Fulgt av etsing av ITO med 0,2 M FeCl ^
3 + 6 M HCl-oppløsning for 30 min ved romtemperatur. Deretter ble substratet renset og skylt for å fjerne gjenværende fotoresist AZP1350 på ITO. Den mikro matrise er fabrikkert med fotoresist (KMPR1005, NIPPON Kayaku CO.) På toppen av mønstrede elektroder. Fotoresisten ble spinnbelagt på elektrodene, og et krom-foto-maske mønstret for mikro matrisen ble innrettet med de mønstrede ITO-elektroder. Fotoresisten ble utsatt for ultrafiolett lys gjennom fotomasken, etterfulgt av fremkalling og skylling.
(a) Microwell array. De interdigi Elektrodene er fremstilt ved en konvensjonell prosess mønstring av ITO og mikro laget av KMPR er på linje med elektroden. (B) PDMS fluidic chip. Den fluidic brikken er fabrikert gjennom soft-litografi prosess. (C) Ferdig mikrofluid enhet laget ved å binde sammen to deler.
PDMS fluid-brikken er fremstilt på vanlig måte replika støpeprosessen som vist i figur 2B. Fotoresist (SU-8 2100, Microchem Co.), som tjener som en form, ble mønster på en silisiumskive. Formen ble grundig renset med isopropanol og avionisert vann. PDMS (. Silpot 184, Dow Corning Toray, CO Ltd.) ble blandet med herdemiddel (10: 1 masseforhold) og helles over i støpeformen. Deretter ble PDMS oppvarmet ved 75 ° C i 1 time, etterfulgt ved å trekke av de polymeriserte PDMS fra formen. Hull som tilgangsporter til strømningskanalen ble stanset ut.
For å binde mikro matrise og PDMS fluidic chip, de ble utsatt for O
2 plasma for å aktivere motsatte overflatene med ioneetsning maskin ( RIE-10NR, Samco CO.). Også O
2 plasma behandling gjør KMPR mikro og PDMS kanalen hydrofile, noe som sikrer enkel injeksjon av vannholdige reagenser inn i kanalen og mikrobrønnene.
Cell Overtrykk Bruke DEP Force
I denne studien blir cellene innført i microchannel aktivt fanget inn i mikro utstyrt med hverandre-elektrode av DEP kraft. DEP er et fenomen hvori nøytrale partikler beveger seg når den er påført på ikke-uniformt elektrisk felt. Den gjennomsnittlige tids DEP kraft kan tilnærmes i form av dipol effekter som (1) der
ε
m
er absolutt permittiviteten til mediet,
r
er radius til partikkelen, Re (
f
CM) er den reelle delen av Clausius-Mossotti faktor (
f
CM) om det indusert dipolmoment og E er RMS-verdien av det påtrykte elektriske felt.
f
CM er (2) (3) (4) der
ε
p
er absolutt permittiviteten av mediet. Partikkelen beveger seg i et felt maksimum (positiv DEP) eller et felt minimum (negativ DEP), avhengig av Re (
f
CM) som representerer differansen mellom de dielektriske egenskapene til det partikkel og dens suspenderingsmedium (figur 3) [18-20]. Re (
f
CM) kan kontrolleres ved å justere konduktiviteten til det suspenderende medium og hyppigheten av påtrykte elektriske felt. Således celler blir fanget inn i mikro ved positiv DEP i tilfelle av EMA anordningen [16].
partikler tiltrekkes til elektrodene på grunn av den positive DEP kraft, og frastøtes fra elektrodene på grunn av den negative DEP kraften .
Materialer og metoder
Prøvepreparering
U937 celler (leukemi monocyttlignende lymfom cellelinje, hentet fra Japan Riken Bio Resource Center,), DU145-celler ( prostatakreft-cellelinje oppnådd fra Japan PC3-celler (prostata kreft cellelinje av Riken Bio Resource Center,) og erholdt fra Japan det Riken Bio Resource Center,) ble dyrket i en fuktet inkubator (37 ° C i en atmosfære av 5% CO
2). Kulturmediet for alle celler var RPMI 1640 (Invitrogen Corp.) supplert med føtalt bovint serum (10%, Gemini Bio-produkter) og penicillin-streptomycin-løsning (1%, Sigma Chemical Co). Den midlere diameter på U937 celle, DU145 celle og PC3 cellen var henholdsvis 20 um og 22 um 10 um. Cellene ble dispergert i en DEP-buffer (10 mM HEPES, 0,01 mM CaCl
2, 59 mM D-glukose og 236 mM sukrose; pH7.35) til å justere konduktiviteten av cellesuspensjonen medium (21,4 MSM
-1) for positiv DEP [21]. DEP-bufferen inneholdt bovint serumalbumin (1% wt /vol) for å blokkere ikke-spesifikk celle-adhesjon. Celler i kulturmediet ble sentrifugert ved 2000 rpm i 5 min. Vi forsiktig fjernet kulturmedium og lagt DEP buffer.
Forsøksoppsett
microfluidic enheten ble montert på x-y translasjonsforskning scenen ligger på invertert mikroskop (IX71, Olympus). Celler ble overvåket med et kamera (DP73, Olympus), som ble installert på mikroskopet. Det elektriske potensial for DEP ble påført på de interdigiterte ITO-elektroder med funksjonsgeneratoren (WF1974; NF Corp.) via en forsterker. (HSA4101; NF Corp.)
immunofarging
Fanget celler i mikrobrønner ble fiksert med 4% paraformaldehyd i PBS (fosfatbufret saltvann) i 10 minutter og vasket med PBS i 5 minutter. Deretter ble de permeabilisert med 0,2% Triton X-100 i PBS i 5 minutter og vasket med PBS i 5 minutter. Celler ble immunfarget med Hoechst33342 (DOJINDO) for DNA-innhold, FITC-konjugerte anti-cytokeratin antistoffer (BD) for epitelceller og PE-konjugert anti-CD45-antistoffer (Liv-teknologi) for leukocyttceller i 30 minutter. Til slutt ble cellene renset med PBS i 10 minutter. Hele fremgangsmåter ble utført ved en strømningshastighet på 3 mL min
-1.
Levedyktighet og apoptose-analysen
Fanget celler ble eksponert for Annexin V Alexa Fluor 488 (Invitrogen) ved værelses temperaturen i det mørke rommet i 30 minutter etterfulgt av utbytting av reagenser inn i blandede reagenser av Annexin bindingsbuffer (Invitrogen), propidium jodid (Invitrogen) og calcein blå (Invitrogen) i 10 minutter. Hele prosessen ble utført ved en strømningshastighet på 3 mL min
1.
Fluorescent In Situ Hybridisering (FISH)
Interphase FISH ble utført på fanget cellene i mikro henhold til den standard protokoll med de følgende modifikasjoner. Kort fortalt ble fanget cellene fiksert med Carnoy løsning. Anordningen ble vasket med 2 x Saline-natriumcitratbuffer (SSC, Abbott), dehydrert i en stigende serie av alkohol og lufttørket. Sonden mix (5’BCL-6 probe merket i rødt og 3’BCL-6 probe merket med grønt) for hybridisering ble lagt. DNA ble denaturert ved 73 ° C i 5 minutter og deretter hybridisert ved 37 ° C i 16 timer på den termosykler (Beckman Coulter). Etter inkubasjon med 0,4 x SSC /0,3% Nonidet P-40 (NP-40) ved 73 ° C, enheten ble overført til 2 x SSC /0,1% NP-40 ved værelsestemperatur, det ble lufttørket i det mørke rommet . DNA ble kontra med DAPI (DOJINDO), forseglet med dekkglass.
Diskusjon
Mulighetsstudie av Enhet for On-Chip Farging
heten av nåværende enhet
Resultater og for on-chip enkelt-kreftcelle-analyse ble demonstrert ved å utføre immunfarging etter fangst en blanding av to ulike cellelinjer, inkludert U937-celler (en modell av hvite blodlegemer) og DU145-celler (en kreftcellelinje). Cellesuspensjonen ble innført i anordningen med en strømningshastighet på 3 mL min
-1. For den positive DEP, 10 Vp-p og sinusformet elektrisk potensial på 8 MHz, ble påført på de interdigiterte ITO-elektroder. Etter celle fangst med DEP, gjennomførte vi farging å identifisere de fangede celler. Fanget celler ble fiksert, permeabilisert og farget ved sekvensiell injeksjon av reagensene inn i anordningen gjennom atkomståpningen. Cellene ble farget med Hoechst33342 (blå) flekker DNA, FITC-konjugert anti-cytokeratin antistoffer (grønn) for epitelceller og R-PE konjugert anti-CD45 antistoff (rød) for leukocyttceller (fig 4). Cytokeratin-positive celler ble betraktet som en kreftcelle, mens CD45-positive celler ble betraktet som WBC. Figur 4 viser fanget 11 celler (i 10 brønner inkludert en godt med to celler fanget i øverste venstre), 3 celler farget med anti-CK antistoff (grønn) tilsvarer kreftcelle og 8 celler farget med anti-CD45 antistoff (rød), tilsvar til WBC. På denne måten kan identifisering av kreftceller og WBC gjøres bare ved sekvensiell injeksjon av nødvendige reagenser til enheten uten komplekse ventilsystem eller ekstra utstyr.
Fanget DU145 celler og U937 celler farget med Hoechst33342 (blå), anti-cytokeratin antistoff (grønn) og anti-CD45-antistoff (rød). Sammenslåtte bildet identifiserer DU145 celler som en modell av CTC (blå + grønn).
Fangst ytelse på de forskjellige cellelinjer ble undersøkt ved å telle antall fanget celler i mikro etter immunostaning. Fig 5A viser fangst mønster av hver av celletypene, hvor bildet representerer hele matrisen i enheten, og hvert bildeelement representerer hver mikrobrønn. DU145 celler har en tendens til å bli fanget i den oppstrøms av mikro matrisen mens U937-celler tilfeldig fordelt på mikro matrisen. Grunnen ville være den større diameter av DU145-celler enn for U937-celler, genererer større DEP kraft, som vist i ligning (1). Siden den kraft som induseres av DEP er proporsjonal med kubikk av celleradius, mottar DU145 celle større kraft enn U937 celle. Det totale antall fangede DU145-celler og U937-celler ble 763 og 801, respektivt. 39% av de innførte celler ble fanget inn i mikrobrønnene, og 33% av mikrobrønnene ble okkupert av enkelt celle. Siden dagens elektroaktive mikro ble designet for å effektivt felle enkelt DU145 celle som diameter er større enn for U937 celle viser enheten gode resultater på enkelt DU145 celle fangst, hvor 728-brønner ble okkupert av enkelt DU145-celler (598-brønner var okkupert av enkelt DU145 cellene, og 130-brønner ble okkupert av enkelt DU145 cellene og enslige U937 celler). Bare 15-brønner ble okkupert av to eller tre DU145 cellene. Imidlertid kan flere U937-celler lett bli fanget inn i en samme mikro siden U937 celle (11 mikrometer i diameter) er mindre enn den for DU145 cellen.
(a) Pixel bilde av mikro på enheten. Hver piksel tilsvarer hver mikro på enheten, og (b) Fordeling av innholdet i fanget celler i mikro. Fargene viser innholdet i fanget celler i mikro.
Livskraftig og apoptose analysen
Vi undersøkte levedyktigheten fanget kreftceller til å oppdage og selektivt analysere levedyktige CTCs som kan være involvert i metastasering. Siden nesten alle kreftceller i blod blir drept av cytotoksiske celler slik som T-celler, etc., og død på grunn av anoikis eller skader på grunn av skjærspenning [22], er det sterkt nødvendig for å identifisere levedyktige kreftceller blant en populasjon av celler for videre analyse. For å sjekke levedyktighet av kreftceller, ble DU145 cellene fanget inn i mikrobrønnene og dyrket i enheten ved å innføre kulturmedium. Etter 6 timer ble fanget cellene farget med calcein (blå) for levedyktige celler, annexin V (grønn) for apoptose-celler eller PI (rød) for døde celler. Nesten alle av de innestengte celler (85%) avgir blå fluorescens, noe som indikerer at cellene er levedyktige, selv etter 6 timers inkubasjon på anordningen (Fig 6).
Annexin V (grønn) flekker apoptotisk celle, PI (rød) flekker døde celler og Calcein (blå) flekker levedyktige celler. Sammenslåtte bildet identifisere både apoptotiske og døde celler (grønn + rød). Bilder av celler fanget i mikro etter 6 timers inkubasjon.
Fluorescent In Situ Hybridisering (FISH)
Vi har gjennomført on-chip fisk i EMA å lokalisere tilstedeværelse eller fravær av spesifikke DNA-sekvenser i kromosomer siden kreftceller ofte fremkalle kromosomal omleiring for medikamentresistens. For demonstrasjon, B-Cell Lymphoma6 (BCL6; genet for hemming av apoptose [23]) genet omorganisering ble vurdert for dyrkede PC3 celler ved hjelp on-chip FISH. FISH-negative viser nærhet av røde flekker (oppstrømsdelen av BCL6 genet) og grønne flekker (nedstrøms del av BCL6 genet). Mens FISH-positive show dual-color break-apart sonde. Figur 7 viser resultatet av FISH-analyse for en PC3 celle i mikro matrisen. Translokasjon av apoptotisk genet i PC3 cellene kan med hell kontrolleres ved on-chip FISH, og kromosom 3q27 av cellen ikke føre trans fordi røde og grønne flekker på samme sted.
Pilene viser signal av BCL6 sonde. Signal viser nedstrøms del av BCL6 genet og rødt signal viser oppstrømsdelen av BCL6 genet. Flett bildet viser gul signal på grunn av røde og grønne signaler er på samme sted. Dette betyr kromosom 3q27 ikke forårsaker trans.
Konklusjoner
I denne studien har vi foreslått en ny metode for enkelt kreftcelle analyser med EMA enheten. Enheten mulig for oss å gjennomføre effektiv enkelt celle fangst og tre typer biokjemiske analyser; farging, levedyktighet /apoptose analyse og fisk på enkeltcellenivå. Siden de fangede enkeltceller kan bli stabilt holdt inne mikro, gjennomførte vi hele prosessen for analysene av sekvensielt injisere reagenser uten kompliserte ventil eller rørsystemer. Vår enkle EMA enhet kombinert med svært sensitive analytiske analyser lover høy gjennomstrømming og parallelized analyser av sjeldne kreftceller i en befolkning på andre celletyper. Man kan også bruke denne teknikken til screening et medikament kandidat for svulst behandling ved å overvåke responsen av målceller gjennom on-chip analyser.
